本发明属于微生物采油和发酵生产领域，具体地说，它涉及一种厌氧生产脂肽表面活性剂的方法及发酵培养基。
背景技术：
脂肽是由芽孢杆菌属的细菌代谢合成的一种生物表面活性剂，具有表面活性高、临界胶束浓度低，安全无毒、可生物降解等优势，因而在微生物采油、环境污染修复、植物生防控制等技术领域有重要的应用潜力。目前很多研究集中在好氧条件下生产脂肽表面活性剂，但对脂肽在在厌氧条件下的生产还缺少研究。
微生物采油技术具有驱油潜力大、工艺简便、成本低、环境友好、采出液不需特殊处理等优势，有望成为未来油田开发后期稳油控水、提高采收率的主力技术。当前，油田在利用脂肽表面活性剂提高采收率的技术中，大都采用地上发酵生产脂肽，然后再注入油藏；然而地上建厂、发酵设备的运行与维护以及产品运输的成本较高，不适合作为低油价运行机制下的石油开采方式。油藏是一个缺氧环境，通过油藏注空气进行油藏地下有氧发酵又会增加开采成本。如果产脂肽的芽孢杆菌能在油藏缺氧条件下合成脂肽表面活性剂，实现油藏原位驱油将具有重要的应用前景。因此，获得一种厌氧生产脂肽表面活性剂的方法，将能够解决上述瓶颈问题。
在脂肽表面活性剂的发酵生产过程中，当发酵液中含有较高浓度的脂肽表面活性剂时，经过通气、搅拌，常常会产生大量较稳定的泡沫。泡沫问题一直困扰着脂肽的发酵生产，同时，通气、搅拌等工艺也会增加脂肽的发酵生产成本。然而，厌氧发酵生产过程中，不需要通气，也就不会产生严重的泡沫问题。因此，发明一种厌氧生产脂肽表面活性剂的方法，在脂肽的发酵生产领域将具有重要的应用价值。
技术实现要素：
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为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种厌氧生产脂肽表面活性剂的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种厌氧生产脂肽表面活性剂的方法，包括以下步骤：1)按照常规方法配制含NaNO3为唯一氮源，含蔗糖、甘油或者可溶性淀粉为唯一碳源的发酵培养基；2)将产脂肽表面活性剂的芽孢杆菌接种至LB培养基中培养至对数生长后期，制备种子液；3)将上述种子液接种至含发酵培养基的厌氧培养体系(如厌氧瓶、厌氧发酵罐)中，在适宜温度下厌氧生产脂肽，培养结束后定性和定量分析厌氧发酵液中的脂肽表面活性剂。
发酵培养基中以NaNO3为唯一氮源，选择蔗糖、甘油或可溶性淀粉中的任何一种作为唯一碳源时，能够满足一些芽孢杆菌厌氧生产脂肽。发酵培养基按质量分数为：蔗糖2-4％(或甘油3-5％，或可溶性淀粉2-4％)，NaNO3 0.1-0.3％，K2HPO4·3H2O 0.3-0.5％，KH2PO4 0.2-0.4％，MgSO4·7H2O 0.03-0.05％，CaCl2 0.01-0.02％；余量为水，pH 6.5-7.0。
产脂肽的芽孢杆菌包括地衣芽孢杆菌，但不限于地衣芽孢杆菌。取产脂肽的芽孢杆菌(如地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC39307)的斜面菌种1-2接种环，接种到100ml的LB培养基中，在37℃、160-200rpm/min下，好氧培养8-12小时，至OD600值为0.5-0.8，即得到培养至对数生长后期的种子液，菌数为103-105个/ml。
将产脂肽菌种的种子液接种至发酵培养基的厌氧培养体系(如厌氧瓶、厌氧发酵罐)中，在35-39℃下，厌氧培养10-15天，厌氧生产脂肽表面活性剂。种子液与发酵培养基的体积比为3-6:100。
利用氯仿/甲醇(2:1，v/v)萃取法提取厌氧发酵液中的脂肽，提取方法为：取厌氧发酵液，离心除菌体，调节上清液pH值至2.0，于4℃过夜放置；然后利用等体积的氯仿/甲醇(2:1，v/v)混合物进行萃取，萃取的下层有机相进行真空旋转蒸发(45℃，50rpm)，得到厌氧条件下生产的脂肽产物。
本发明可对于脂肽进行薄层色谱法定性分析；利用排油圈直径法定量厌氧发酵液中的脂肽。
对产物进行薄层色谱法定性分析，在茚三酮显色剂下，产物显示紫色，表明为脂肽。
利用排油圈直径法定量厌氧发酵液中的脂肽。利用提取到的脂肽产物配制一系列浓度(0-1000mg/l)的脂肽标准品溶液；将直径为90mm的培养皿放到坐标纸上，加入30ml蒸馏水，再在培养皿中水面的中央滴20μl的原油(粘度低于20mPa·s)，在水面上形成一层油膜；取10μl的脂肽标准品溶液滴到油膜中央，记录排油圈直径，并制备排油圈直径与脂肽浓度间的标准曲线(见附图1)。取2ml厌氧发酵液在5000rpm条件下离心10min后得上清液；按照上述排油圈方法，测定获得相应的排油圈直径，根据标准曲线得到待测样品中脂肽的质量浓度。
所述厌氧生产脂肽表面活性剂的方法使得一部分芽孢杆菌实现了厌氧产脂肽，在厌氧培养的8-10天，脂肽表面活性剂产量大于100mg/L，厌氧发酵液对原油的乳化活性大于60％，表面张力低于32mN/m。在物理模拟岩心驱油实验中，利用本发明方法在缺氧的岩心环境中原位生产脂肽表面活性剂，提高的原油采收率高于5.0％。物理模拟岩心驱油实验评价方法如下：1)依次对岩心进行称重、抽真空、饱和水，测定孔隙体积(PV)、饱和油、老化等处理；2)进行一次水驱至岩心出口端采出液的含水率99％以上，计算一次水驱采收率；3)向岩心中注入产脂肽的芽孢杆菌种子液及发酵培养基的混合液，注入体积0.3PV-0.5PV，封闭岩心两端，在模拟油藏温度下培养一个月；4)进行二次水驱至岩心出口端采出液的含水率99％以上，计算二次水驱采收率；5)实验数据处理，计算岩心中原位产脂肽表面活性剂所提高的原油采收率。
所述的厌氧生产脂肽表面活性剂的方法可以应用于微生物采油和脂肽的发酵生产领域。
本发明的有益效果：
本发明使得一部分芽孢杆菌实现了在厌氧条件下生产脂肽，避免了好氧发酵过程中的诸多不利因素。利用本发明方法，不需要空气的注入，可以实现在缺氧的油藏环境中原位生产脂肽表面活性剂，提高的原油采收率，减少基础设施和生产设备费用、降低采油成本。
附图说明
图1为排油圈直径法定量分析发酵液中脂肽含量的标准曲线。
具体实施方式
结合下述具体实施例对本发明进行详细的说明，使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在如下实施例中，如无特殊说明，所用的材料和试剂均可从生化试剂公司购买获得；除特殊说明的方法外，所用试验方法均为实验室常规实验方法。
在如下实施例中，选择菌株Bacillus licheniformis ATCC39307作为示例菌株，来研究和验证本发明的厌氧生产脂肽表面活性剂的方法和应用。
产脂肽的芽孢杆菌(产脂肽的芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC39307)的斜面菌种2接种环，接种到100ml的LB培养基中，在37℃、180rpm/min下，好氧培养8-12小时，至OD600值为0.7，即得到培养至对数生长后期的种子液，菌数为104个/ml。
实施例1：厌氧产脂肽的碳源筛选
以NaNO3为唯一氮源，硝酸盐可以作为菌种厌氧生长代谢所需要的电子受体，筛选能够促使产脂肽芽孢杆菌在厌氧条件下生产脂肽的碳源。所考察的9种碳源包括葡萄糖、蔗糖、糖蜜、大豆油、橄榄油、原油、甘油、玉米浆粉、可溶性淀粉。实验中的基础培养基按质量分数为：蔗糖3％，NaNO3 0.2％，K2HPO4·3H2O 0.4％，KH2PO4 0.35％，MgSO4·7H2O 0.06％，CaCl2 0.01％，余量为水；pH 6.8。分别以所考察的9种碳源替换基础培养基中的蔗糖，来制备9种培养基。为了除掉培养基中的溶解氧，将配制好的培养基加热至煮沸状态，保持约15min。在高纯氮气的保护下，将培养基分装到相应的厌氧管中，塞好橡胶塞，再拧紧盖子，置于高压蒸汽灭菌锅中，115℃下灭菌处理30min。待培养基冷却至室温后，接种培养基体积3％的菌株ATCC 39307的种子液(菌数为104个/ml)，至于37℃下，培养12天，用于厌氧发酵生产脂肽。
培养结束后，利用全自动表面张力仪BZY-1测定厌氧发酵液上清液(5000rpm，10min)的表面张力；以原油(粘度小于20mPa·s)为油膜，测定厌氧发酵液的排油圈直径。
结果表明，在以蔗糖、甘油、可溶性淀粉3种底物为碳源时，厌氧发酵液的表面张力能够降低到32mN/m以下，且排油圈直径大于15mm。说明在NaNO3作为唯一氮源的条件下，以蔗糖、甘油、可溶性淀粉3种碳源中的任何一种为唯一碳源，均能够促使产脂肽芽孢杆菌在厌氧条件下生产脂肽。其余6中碳源的厌氧发酵液的表面张力均高于50mN/m，排油圈直径小于5mm；表明了其余6种碳源不能满足产脂肽芽孢杆菌在厌氧条件下生产脂肽。
实施例2：厌氧发酵液中脂肽的提取以及定性与定量分析
厌氧发酵液的制备对应于实施例1中的蔗糖为碳源。
1)脂肽的提取：利用氯仿/甲醇(2:1，v/v)萃取法提取厌氧发酵液中的脂肽。取厌氧发酵液，离心除菌体，用6mol/L的HCl调节上清液pH值至2.0，于4℃过夜放置；然后利用等体积的氯仿/甲醇(2:1，v/v)混合物进行萃取，萃取的下层有机相进行真空旋转蒸发(45℃，50rpm)，真空冷冻干燥后，得到厌氧条件下生产的脂肽产物。
2)薄层色谱法定性分析：将提取的脂肽产物溶于二氯甲烷中，将样品点在硅胶板上，在氯仿：乙酸＝8:2(v/v)的展开剂中展开，用显色剂进行显色。在茚三酮显色剂下，产物显示紫色，表明为脂肽。
3)定量分析：利用排油圈直径法测定发酵液中脂肽表面活性剂的含量。称取250mg脂肽提取物溶于蒸馏水，定容至250ml，得到质量浓度1000mg/l的脂肽溶液。配制一系列浓度(0-1000mg/l)的脂肽溶液，分别取5.0ml，10.0ml，15.0ml，20.0ml，25.0ml，30.0ml，35.0ml，40.0ml，45.0ml浓度为1000mg/l的脂肽溶液，至蒸馏水中定容至50ml；得到质量浓度分别为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000mg/l的脂肽标准品溶液。
将直径为90mm的培养皿放到坐标纸上，加入30ml蒸馏水，再在培养皿中水面的中央滴20μl的原油(粘度低于20mPa·s)，在水面上形成一层油膜；取10μl的脂肽标准品溶液滴到油膜中央，记录排油圈直径，并制备排油圈直径与脂肽浓度间的标准曲线(见附图1)。
取2ml的厌氧发酵液在5000rpm条件下离心10min后得上清液；按照上述排油圈方法，测定获得相应的排油圈直径；根据标准曲线得到厌氧发酵液中脂肽的质量浓度。
实施例3：在厌氧瓶中发酵生产脂肽表面活性剂
1)实验中的所用的发酵培养基按质量分数为：蔗糖3％，NaNO3 0.2％，K2HPO4·3H2O 0.4％，KH2PO4 0.35％，MgSO4·7H2O 0.06％，CaCl2 0.01％，余量为水；pH 6.8。
2)厌氧培养基制备方法如下：将上述配制好的培养基煮沸约15min；然后在高纯氮气保护下，将200ml培养基分装到250ml的厌氧瓶中；115℃，灭菌30min；培养基冷却至室温后，注入过滤除菌的2.5％(w/v，g/ml)Na2S·9H2O还原剂至终质量浓度0.02％，去除残余氧。
3)发酵条件：菌株体积接种量为5％，在37℃、80rpm下，厌氧培养10天。
在厌氧瓶培养条件下，菌株ATCC 39307的脂肽表面活性剂的产量为143.5±9.7mg/l。
实施例4：实施例3获得的含脂肽厌氧发酵液的表面活性与乳化活性分析
菌株ATCC 39307在装有200ml发酵培养基的厌氧瓶中，于37℃、80rpm/min条件下，厌氧培养10天，对厌氧发酵液的乳化活性和表面活性进行分析评价。培养结束后，取厌氧发酵液在5000rpm条件下离心10min去除菌体，得上清液。
取12ml厌氧发酵液的上清液，利用全自动表面张力仪BZY-1，测定表面张力，以蒸馏水为对照。
乳化活性以乳化系数EI24来表征，EI24即乳化层高度与混合液总高度的百分比值。乳化活性的测定方法如下：取一支10ml的带刻度试管，加3ml的原油和3ml的厌氧发酵液上清液；在微型漩涡混合仪上，振荡2min；于40℃下，静置24h后，计算乳化系数EI24。
上述厌氧发酵液的表面张力低于32mN/m，而相同测定条件下蒸馏水的表面张力为72.1mN/m。厌氧发酵液对原油的乳化活性大于60％，展现出了乳化分散原油提高采收率的应用价值。
实施例5：厌氧产脂肽的物理模拟岩心驱油评价：
实验中所用岩心为人造胶结岩心(岩心处于处于一个带有进口和出口的密闭腔室中)，所用原油为某油田采油二厂的脱水脱气原油，饱和水和驱替水均为某油田采油二厂的油藏注入水。
1)实验中岩心的处理：对岩心进行称重，设置好岩心的进口端和出口端；对岩心进行抽真空与饱和水处理，对饱和水后的岩心进行第二次称重，根据两次称重的差值计算得到孔隙体积(PV)为67.1mL。然后对岩心进行饱和原油处理，当岩心出口端出油20mL以上时，即认为饱和油过程结束；将岩心放在模拟油藏温度(39℃)下进行老化处理24h。
2)一次水驱采油：用平流泵对岩心进行一次水驱处理，岩心出口端放置一个100ml量筒，平流泵流速为0.5ml/min，当岩心出口端采出液含水率99％以上时，即认为一次水驱过程结束，计算一次水驱后的采收率为48.7％。
3)微生物菌液的注入：用平流泵向岩心中注入产脂肽芽孢杆菌的种子液及发酵培养基的混合液，注入体积为0.5PV，封闭岩心两端，将岩心放置在模拟油藏温度(39℃恒温培养箱)下培养一个月。
4)二次水驱：水驱至岩心出口端采出液的含水率99％以上，计算二次水驱后的总采收率54.1％。
5)实验数据处理：根据一次水驱后采收率48.7％和二次水驱后的总采收率54.1％，计算得到厌氧产脂肽培养基在岩心中作为营养激活剂所提高的原油采收率为5.4％。
在模拟油藏温度培养的过程中，菌株厌氧产生脂肽表面活性剂，动用原油，从而在一次水驱基础上提高原油采收率达5个百分点。本发明的厌氧生产脂肽表面活性剂的方法在微生物采油领域具有重要的推广和应用价值。