一种催化活性得到提高的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用的制作方法

文档序号：14854939发布日期：2018-07-04 02:56阅读：207来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种催化活性得到提高的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用。

背景技术：

d-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性稀少糖，它的甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿、预防肥胖等生理功能。2011年fda认可d-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用。自此d-阿洛酮糖得到了迅速发展。

自然界中，d-阿洛酮糖的含量极少，且极难获得。生物法制备d-阿洛酮糖是近年来的一个研究热点。d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(d-psicose-3-epimerase,简写为dpe)属于差向异构酶类，可以催化多种酮糖c3位的差向异构，是生产d-阿洛酮糖的良好的生物催化剂。

由于来源于野生菌株未经改造的dpe酶在催化活性方面较差，工业应用存在一定的局限性，导致酶的使用量偏大，应用成本偏高，限制了d-阿洛酮糖的大规模工业化生产。

因此，本领域迫切需要开发一种催化活性显著提高的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种催化活性显著提高的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

本发明第一方面提供了一种突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶在包括选自下组的至少3个位点发生突变：

在野生型的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的对应于seqidno.:1的第73位天冬氨酸(d)、第111位酪氨酸(y)、第188位天冬酰胺(n)、第250位甘氨酸(g)。

在另一优选例中，所述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶来自于类芽孢杆菌(paenibacillussenegalensis)。

在另一优选例中，所述第73位天冬氨酸(d)突变为谷氨酸(e)；和/或

第111位酪氨酸(y)突变为苯丙氨酸(f)；和/或

第188位天冬酰胺(n)突变为苏氨酸(t)；和/或

第250位甘氨酸(g)发生突变半胱氨酸(c)。

在另一优选例中，所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列如seqidno.:2、4、6、8所示。

在另一优选例中，所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有选自下组的一个或多个特征：

(a)催化效率≥25％，较佳地，26-40％，更佳地，27-30％；

(b)所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的催化活性为同等条件下的野生型d-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化活性的3-15倍，较佳地，4-13倍，更佳地，5－10倍；

(c)所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的单位酶活≥400，较佳地，为420-900，更佳地，450-800。

在另一优选例中，所述的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶除73、111、188、250位氨基酸外，其余氨基酸与seqidno.:1所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白仍具有催化合成阿洛酮糖的活性。

在另一优选例中，与seqidno.:1所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。

在另一优选例中，所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶为seqidno.:1所示的野生型的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶经突变形成的。

本发明第二方面提高了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如seqidno.:2、4、6、8所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如seqidno.:3、5、7、9所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与seqidno.:3、5、7、9所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码seqidno.:1或2、4、6、8所示多肽的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸在突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的orf的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6his)、或其组合。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：dna序列、rna序列、或其组合。

本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体选自下组：pet、pcw、puc、ppic9k、pma5、或其组合。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或在基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：原核细胞、真核细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、链霉菌、或其组合。

在另一优选例中，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、和/或谷氨酸棒杆菌，优选大肠杆菌。

在另一优选例中，所述真核细胞包括毕赤酵母、黑曲霉、和/或链霉菌，优选毕赤酵母。

本发明第五方面提供了一种产生本发明第一方面所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶；和

分离所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

本发明第六方面提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明第一方面所述的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

在另一优选例中，所述酶制剂还包括选自下组的一种或多种组分：氯化钴(较佳地，六水合氯化钴)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、或其组合。

在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。

本发明第七方面提供了一种制备阿洛酮糖的方法，包括步骤：

(i)将本发明第一方面所述的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所述阿洛酮糖；和

(ii)任选地，分离并纯化所述阿洛酮糖。

在另一优选例中，所述阿洛酮糖为d-阿洛酮糖。

在另一优选例中，在步骤(i)中，所述反应底物包括果糖。

在另一优选例中，在步骤(i)中，所述反应底物选自下组：结晶果糖、果糖溶液、高果糖浆、或其组合。

在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的时间为0.1-10h，较佳地，0.4-8h，更佳地，0.6-5h。

在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的温度为20-80℃，较佳地，30-75℃，更佳地，40-70℃。

本发明第八方面提供了一种本发明第一方面所述的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶或本发明第四方面所述的宿主细胞的用途，用于产生阿洛酮糖。

在另一优选例中，所述阿洛酮糖为d-阿洛酮糖。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示d-果糖标准品在hplc上的保留时间。

图2显示d-阿洛酮糖在hplc上的保留时间。

图3显示野生型dpe和突变体酶的单位酶活比较。

图4显示野生型dpe酶反应1h的样品hplc图。

图5显示d73e/y111f/n188t突变体酶反应1h的样品hplc图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地获得一种来源于类芽孢杆菌(paenibacillussenegalensis)突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，实验结果表明，所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有高达29.6％的催化效率，突变体酶的单位酶活高达720，其催化活性(单位酶活)可显著提高至野生型的9.6倍，因此，本发明的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有非常高的催化活性。本发明还提供了所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的用途。

如本文所用，术语“dpe酶”、“psdpe”、“d-阿洛酮糖-3-差向异构酶”、“野生型的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶”均可互换使用。

野生型的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶

如本文所用，“野生型d-阿洛酮糖-3-差向异构酶”是指天然存在的、未经过人工改造的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(pcr)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述野生型的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的来源没有特别限制，一种优选的来源为类芽孢杆菌(paenibacillussenegalensis)。

突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶及其编码序列

如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“本发明突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶”、“dpe酶突变体”、“突变体酶”、“突变的dpe酶”、“d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体”可互换使用，均指非天然存在的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，且所述突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶为seqidno.:1所示蛋白进行人工改造的蛋白。

应理解，本发明突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶中的氨基酸编号基于seqidno.:1作出，当某一具体突变蛋白与seqidno.:1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于seqidno.:1的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的n末端或c末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似糖基转移酶活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。

本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。

本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原igg片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表i进行氨基酸替换而产生。

表i

在本发明的活性突变蛋白具有催化产生阿洛酮糖的活性。

优选地，所述的突变蛋白如seqidno.:2、4、6、8所示。

应理解，本发明突变蛋白与seqidno.:2、4、6、8所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变蛋白与seqidno.:2、4、6、8所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。

此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。

术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。优选地，在本发明中，所述编码突变蛋白的多核苷酸的序列如seqidno.:3、5、7、9所示。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cdna时，可优选使用race法(race-cdna末端快速扩增法)，用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。

载体和宿主细胞

本发明还提供了一种包含本发明的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因的载体，以及含所述载体的宿主细胞。

在本发明的一个优选例中，所述述载体具有在大肠杆菌(更佳地在大肠杆菌bl21(de3)菌株)中表达的能力。

本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因序列，例如全人工合成或pcr法合成。一种优选的合成法为不对称pcr法。不对称pcr法是用不等量的一对引物，pcr扩增后产生大量的单链dna(ssdna)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在pcr反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链dna，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的pcr就会产生大量的单链dna。用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。

本发明的多核苷酸序列可以通过常规的重组dna技术，表达或生产目的蛋白，包括步骤：

(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞，较佳地大肠杆菌细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的pl启动子：真核启动子包括cmv早期启动子、hsv胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、反转录病毒的ltrs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子，在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是dna表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录。如腺病毒增强子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

本发明还提供的重组载体，其包含本发明的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因的dna序列。在优选的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的基因与启动子。

在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体，在一优选实施方式中，dpe酶及其突变体表达的载体可以为pet、pcw、puc、ppic9k、pma5或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。

本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的rna或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞，较佳地，油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇s2或sf9；动物细胞如cho、cos或bowes黑素瘤细胞等。在一优选实施方式中，表达宿主可以为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、链霉菌或其他宿主细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用cacl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。该方法是这样实现的，根据宿主细胞，用本领域技术人员所共知的方法生长或培养。比如微生物细胞通常是在0-100℃，优选10-60℃，同时还要氧气。培养基中含有碳源，如葡萄糖；氮源，通常是有机氮的形式，如酵母提取物、氨基酸；盐，如硫酸铵，微量元素，如铁、镁盐；如果需要的话还有维生素。在此期间培养基的ph可以保持固定的值，就是说，在培养期间进行控制或不控制。培养可以分批培养、半不连续培养或连续培养形式进行。在培养之后，收集细胞，破碎或直接使用。将d-果糖与本发明的突变体酶或含有本发明突变体酶的细胞一起培养，即可将d-果糖转化为d-阿洛酮糖。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。

制备酶制剂组合物

本发明还提供了一种酶制剂组合物，该酶制剂组合物中包含本发明的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶。

本发明的酶制剂组合物还可以包含：氯化钴(较佳地，六水合氯化钴)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、或其组合。

阿洛酮糖的制备方法

本发明还提供了一种阿洛酮糖的制备方法，所述方法包括步骤：

(1)将本发明的突变的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶与反应底物接触，进行催化反应，从而生成所述阿洛酮糖；

(2)任选地，分离并纯化所述阿洛酮糖。

本发明还涉及将上述方法制得的d-阿洛酮糖应用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品的用途。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明提供了一种催化活性得到显著提高的dpe酶突变体，它的催化活性(单位酶活)为同等条件下的野生型d-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化活性的9.6倍，大大降低了合成d-阿洛酮糖过程中的酶的用量，具有重要的工业应用价值。

(2)本发明的dpe酶突变体的催化效率高达29.6％。

(3)本发明的dpe酶突变体的单位酶活高达720u/mg。

(4)编码本发明的突变的dpe酶的多核苷酸序列，在大肠杆菌中表达量高，表达稳定，能够显著降低制备dpe酶的成本。

(5)采用本发明的制备突变的dpe酶，周期短，成本低，适用于工业化生产。

(6)本发明的突变的dpe酶的催化活性要显著高于野生型的dpe酶(psdpe)，在工业生产中可大大降低酶的用量和缩短反应时间，从而降低生产成本。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体库的建立

根据已报道的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(d-psicose-3-epimerase，dpe)序列进行blast比对，发现来源于paenibacillussenegalensis中某一未知蛋白的氨基酸序列与其他几种dpe基因的相似性较大，推测该基因具有将d-果糖转化为d-阿洛酮糖的能力，是潜在的dpe基因。dna序列经优化后由常州基宇生物科技有限公司进行全基因合成，并重组到pet29a(+)载体(novagen)上；后经表达实验和功能实验验证，该蛋白可将d-果糖转化为d-阿洛酮糖，具有d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的功能，属于该家族一员，其氨基酸序列如seqidno.:1所示。随后在该野生型蛋白的基础上进行蛋白定向进化研究。

以全基因合成的psdpe-pet29a(+)质粒(由常州基宇生物技术有限公司合成)为模板，以引物f1和r1分别为正反向引物，进行易错pcr，构建突变体库。

引物序列如下：f1:5'ggaattccatatgaaattcggcacc3'(seqidno.:10)；r1：5'cgcggatccttacggggtgctttt3'(seqidno.:11)，两端分别带有ndei和bamhi限制性酶切位点

易错pcr反应体系如下：

易错pcr在bio-radt100thermalcycler上进行，pcr程序如下：

将上述pcr反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收880bp大小的片段(具体操作见天根生化科技(北京)有限公司琼脂糖凝胶回收试剂盒操作规程)，并经限制性内切酶ndei和bamhi酶切后，与经过同样双酶切的pet29a(+)(novagen)载体进行连接，并转化bl21(de3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，于37℃倒置过夜培养后，即得到dpe突变体库，长出的单克隆用于活性筛选

实施例2突变体库的活化和诱导表达

从上述培养过夜的平板上挑取单克隆至装有1ml含终浓度为50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基(成分：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeastextract)5g/l,氯化钠10g/l，其中胰蛋白胨(tryptone)和酵母提取物(yeastextract)购自oxoid，氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司)的96深孔板中，于37℃、220rpm振荡培养过夜。次日，从上述过夜培养的96空板中吸取100μl培养液，加入到新鲜的1ml含终浓度为50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基的96深孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后，加入终浓度为1mm的iptg进行诱导，随后在30℃继续培养20h。一共挑取了400个单克隆，用于活性筛选。

将上述诱导后的菌液在4℃、4000rpm离心15min，弃上清。菌体用100μl50mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)悬浮，加入终浓度为0.5g/l的溶菌酶，于37℃处理1h，4℃、4000rpm离心30min，取50μl上清转移至新的96孔板，用作活性筛选的模板。

实施例3高效液相色谱hplc高通量筛选方法的确立

高效液相色谱hplc按如下条件进行：

岛津shimadzulc-20ahplcwithriddetectororequivalent；

分析柱：waterssugar-paki,6.5×300mmcolumn；

流动相：水；

流速：0.6ml/min；

柱温：80℃；

检测器：rid，

检测器温度60℃

以sigma公司生产的d-果糖和d-阿洛酮糖纯品为标准品，上样量为20μl。色谱分析结果见附图1和2，d-果糖的保留时间为9.389min(图1)，d-阿洛酮糖保留时间为12.233min(图2)，两者分离度大，可作为酶突变体筛选的方法。

实施例4突变体的活性筛选

在上述含50μl突变体酶上清的96孔板中，依次加入400μl25％果糖水溶液(终浓度为200g/l)、50μl5mmcocl2溶液(终浓度为0.5mm)，于60℃反应10min，然后在100℃处理10min灭活酶，4000rpm离心10min，取上清稀释50倍后进行hplc检测，以d-阿洛酮糖的生成量来筛选突变体，野生型dpe生成的d-阿洛酮糖作为对照。

经hplc分析发现，有3个突变体的d-阿洛酮糖的生成量要明显高于野生型对照，该三个突变体编号分别为克隆25、189和327号。随后将这三个克隆进行扩大培养，以验证其活性是否显著提高。

实施例5酶突变体的扩大培养和活性验证

将野生型dpe、克隆25、189和327接种到5ml含终浓度为50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基的试管中，37℃、220rpm振荡培养过夜。次日，按1％比例转接到100ml含终浓度为50μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养3～4h，加入终浓度为1mm的iptg，随后在30℃、200rpm诱导过夜。

诱导后的菌液于4℃、8000rpm离心10min，菌体用20mlph7.050mm磷酸钠缓冲液洗涤两次后，加入10mlph7.050mm磷酸钠缓冲液进行悬浮。随后在冰浴条件下进行超声破碎(超声功率200w，超声3s/间歇5s，超声10min)。超声后的样品在4℃、12000rpm离心20min，上清进行冷冻干燥，得到冻干粉用作活性检测。

反应条件和hplc检测条件同实施例4，冻干粉用缓冲液溶解成1mg/ml浓度，反应体系为100ml。结果如图3所示。结果显示，野生型dpe的单位酶活为75u/mg，克隆25的单位酶活为112u/mg，克隆189的单位酶活为180u/mg，克隆327的单位酶活为125u/mg。1u相当于在60℃、ph7.0条件下单位时间内(1min)生成1μmol的d-阿洛酮糖所需要的酶量。

三个克隆的催化活性显著高于野生型dpe酶。随后将这三个克隆送测序，并与野生型dpe氨基酸序列进行比对，发现克隆25携带一个d73e突变，克隆189携带y111f和n188t两个突变，克隆327携带一个g250c突变。

实施例6多个突变位点联合的突变体的构建

利用定点突变技术(如stratagene公司的quikchangesite-directedmutagenesiskit)，将上述4个突变位点进行组合，构建了4个突变体，分别含有以下突变位点：d73e/y111f/n188t、d73e/g250c、y111f/n188t/g250c、d73e/y111f/n188t/g250c。将上述4个突变体进行扩大培养和活性测定，反应条件同实施例5，结果如表2所示。

表2

结果表明，含有3个或3个以上突变位点的突变体具有很高的单位酶活，最高可达720，且提高倍数最高可达9.6倍，因此具有很高的催化活性，并且其催化活性显著高于含有3个以下(如2个)突变位点的突变体。

实施例7利用突变体进行d-阿洛酮糖的合成

在两个250ml三角烧瓶中分别加入100ml50％果糖溶液和11.9mg六水合氯化钴固体粉末，在60℃水浴条件下搅拌10min后，分别加入0.1g的野生型dpe酶冻干粉和d73e/y111f/n188t突变体酶冻干粉，开始反应，于1h取样进行hplc检测。结果显示在1h时加入d73e/y111f/n188t突变体酶的反应中d-阿洛酮糖的面积比已达到29.6％(图5)，而加入野生型dpe的反应中d-阿洛酮糖的面积比仅为16.96％(图4)。由此可见，本发明突变体酶的反应催化活性要显著高于野生型dpe酶，在工业生产中可大大降低酶的用量和缩短反应时间，从而降低生产成本。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海立足生物科技有限公司

<120>一种催化活性得到提高的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

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