一种人皮肤成纤维细胞培养液及培养方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人皮肤成纤维细胞培养液及培养方法。

背景技术：

随着人皮肤成纤维细胞分离、培养技术的成熟以及生物医学工程等技术的发展，以培养人皮肤成纤维细胞为基础的生物人工皮肤逐渐发展起来，人们一直希望采用这种体外皮肤支持的方法来代替患者损伤的皮肤功能，为患者等待皮肤移植或自身皮肤再生创造条件。目前认为，生物人工皮肤要达到理想支持效果至少需要10¹⁰以上数量级的细胞，而在保障细胞活性的条件下，人皮肤成纤维细胞数量越多，其支持及治疗效果将越佳，因此，人皮肤成纤维细胞体外大规模培养技术已成为生物人工皮肤技术发展的核心技术。

虽然人皮肤成纤维细胞体外大规模培养技术己取得了许多重大的进展，目前仍难于满足生物人工皮肤发展的需要，存在着以下问题：

1、动物培养环境中抑制因素的积累是提高细胞密度的主要限制因素。1)体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一，对细胞有很大的毒害作用。2)高乳酸浓度抑制细胞生长。

2、氧气供应相对不足。氧气是动物细胞生长的必要物质，且人皮肤成纤维细胞更是一种高耗氧量细胞，在人皮肤成纤维细胞大规模培养过程中，消耗大量氧气，可导致溶氧急剧降低。这种氧的缺乏也不仅可直接造成细胞的损害，影响细胞的生长速度，还促进培养基中葡萄糖的无氧酵解，增加乳酸的产生，使得培养基中的PH值急剧下降，又对人皮肤成纤维细胞造成进一步的损害。

3、机械损伤。人皮肤成纤维细胞是锚定依赖性细胞，其功能的有效发挥必须依赖于对支架材料等支持物的贴附，而在众多的体外人皮肤成纤维细胞规模培养方法中，微载体悬浮培养技术较其它培养技术具有以下优点：1)表面积/体积比大，单位体积细胞培养基细胞产率高；2)兼有悬浮培养和贴壁培养的优点；3)培养基利用率高；4)放大容易，可以达到几升以上的容积，细胞收获过程不复杂；5)可用简单的显微镜即可观察细胞在微载体表面的生长情况；因而被广泛应用人皮肤成纤维细胞体外规模化高密度三维培养术中。但是，在细胞培养过程中许多作用力(如端流和气泡产生的剪切力、微载体间的碰撞)的作用下，贴在微载体上生长的细胞会受到损伤，抑制细胞生长，并导致细胞死亡。

综上所述，大规模细胞培养过程中，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中细胞死亡主要原因是由于氧气、营养物质的缺乏和氨、乳酸等代谢产物蓄积所引起细胞凋亡所致。随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入，细胞凋亡的发生被认为是大规模细胞培养过程的重要制约环节，预防并控制细胞凋亡也因此成为研究热点。

因此，需要研发一种人皮肤成纤维细胞培养液，其可在同等条件下有效减轻规模化培养中各种培养环境因素对人皮肤成纤维细胞造成的损伤，并抑制人皮肤成纤维细胞凋亡的发生，达到进一步提高人皮肤成纤维细胞规模化培养的密度和功能状态的效果。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种人皮肤成纤维细胞培养液，所述对人皮肤成纤维细胞的规模化培养具有良好的效果。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明公开了一种人皮肤成纤维细胞培养液，包括：培养基、保护剂、胎牛血清和HEPES；

所述保护剂包括：刺玫果总黄酮提取物、黄芪多糖和胰岛素。

优选的，所述培养液包括以下组分：

在本发明提供的一实施例中，所述培养液包括以下组分：

在本发明提供的另一实施例中，所述培养液包括以下组分：

在本发明提供的另一实施例中，所述培养液包括以下组分：

优选地，所述刺玫果总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：

a)将刺玫果干燥粉碎，用12～16体积倍量的70～80％乙醇微波提取3次，每次提取的时间为40min、20min和10min，过滤后合并提取液；

b)将步骤a得到的提取液上大孔吸附树脂柱，经水洗至无色后，用70～90％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇得浸膏，干燥至恒重。

优选地，所述培养基为DMEM。

山刺玫(Rosa davurica Pall.)为蔷薇科蔷薇属落叶灌木植物,主要分布于我国东北地区,其果实为刺玫果。传统医学将刺玫果列为补药,据《中华大辞典》称:刺玫果具有健脾理气、养血调经之功效。现代医学研究发现,刺玫果具有抗衰老、抗疲劳、耐缺氧,增强人体免疫功能作用,长期服用能显著提高人体中SOD含量。

刺玫果为药食同源的宝贵资源，其富含有机酸,黄酮、香豆素、昌醇、三菇、烯烃、皂试、挥发油、多种矿物质、微量元素等多种活性成分,其中的黄酮类化合物具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、抗衰老和抗自由基等作用。

组分中的黄芪多糖等可有效保护细胞膜和线粒体膜的完整性，从而减少各种培养环境因素对人皮肤成纤维细胞的损伤，能有效保护人皮肤成纤维细胞膜的完整性。

氧自由基不仅通过对生物膜中不饱和脂肪酸进行过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤，自由基(或氧化应激)在细胞凋亡过程起重要的诱导作用。本发明组分中的刺玫果总黄酮提取物是一种天然的水溶性抗氧化剂，它能通过淬灭生物膜内的自由基活性保护人皮肤成纤维细胞膜，使人皮肤成纤维细胞免受氧化损害。此外，刺玫果总黄酮提取物中富含多种水溶性物质，亦能够清除0^2-，减少H₂0₂的产生，还可能阻断羟自由基的产生，可非常有效地减轻活性氧分子对细胞膜及细胞器膜的损伤。

Ca²⁺是细胞凋亡发生过程中重要的信息分子，Ca²⁺持续升高可使核酸内切酶激活，使DNA片段化，因此钙离子的内稳定失调强与人皮肤成纤维细胞损伤的发生具有非常重要的关系，并被认为是转化至不可逆期的界限步骤。本发明中的刺玫果总黄酮提取物具有良好的钙阻滞作用。

黄芪多糖不仅可在缺氧条件下经无氧酵解，产生ATP，且不产生有害的代谢产物，还作为一种能量合成促进剂，在缺血、缺氧等应激状态下，激活磷酸果糖激酶和丙酣酸激酶，促进对糖的利用，更快、更多地为人皮肤成纤维细胞提供了能量，使钙泵在缺氧状态下仍能维持一定的生理活性，保持了钙离子内低外高的稳态，从能有效的保护人皮肤成纤维细胞膜的完整性和细胞的功能而减轻人皮肤成纤维细胞损害，抑制了人皮肤成纤维细胞的凋亡。

胰岛素可通过作用于人皮肤成纤维细胞表面的胰岛素受体，增强人皮肤成纤维细胞对葡萄糖的摄入和利用，促进人皮肤成纤维细胞蛋白内蛋白合成，从而进一步增强人皮肤成纤维细胞的功能与活力。

本发明提供了一种人皮肤成纤维细胞培养方法，包括：采用本发明提供的人皮肤成纤维细胞培养液培养人皮肤成纤维细胞。

作为优选，人皮肤成纤维细胞培养方法采用微载体培养方法。

综上所述，本发明公开的人皮肤成纤维细胞培养液能通多种机制在人皮肤成纤维细胞规模化培养过程有效地减轻各种因素对人皮肤成纤维细胞的损伤，并抑制人皮肤成纤维细胞凋亡的发生，从而达到进一步提高人皮肤成纤维细胞规模化培养的密度和功能状态，并有效延长人皮肤成纤维细胞的体外生存时间的目的。

附图说明

图1示实施例1细胞的生长曲线；

图2示实施例1负载细胞的微载体在倒置显微镜下观察及DAPI染色后荧光倒置显微镜下观察结果；其中2-1示实验组倒置显微镜观察结果，2-2示实验组DAPI染色结果，2-3示对照组1倒置显微镜观察结果；2-4示对照组1DAPI染色结果；2-5示对照组2倒置显微镜观察结果；2-6示对照组2DAPI染色结果；2-7示对照组3倒置显微镜观察结果；2-8示对照组3DAPI染色结果；2-9示对照组4倒置显微镜观察结果；2-10示对照组4DAPI染色结果；

图3示实施例2负载细胞的微载体在倒置显微镜下观察及DAPI染色后荧光倒置显微镜下观察结果；其中3-1示实验组倒置显微镜观察结果，3-2示实验组DAPI染色结果，3-3示对照组1倒置显微镜观察结果；3-4示对照组1DAPI染色结果；3-5示对照组2倒置显微镜观察结果；3-6示对照组2DAPI染色结果；3-7示对照组3倒置显微镜观察结果；3-8示对照组3DAPI染色结果；3-9示对照组4倒置显微镜观察结果；3-10示对照组4DAPI染色结果；

图4示实施例3负载细胞的微载体在倒置显微镜下观察及DAPI染色后荧光倒置显微镜下观察结果；其中4-1示实验组倒置显微镜观察结果，4-2示实验组DAPI染色结果，4-3示对照组1倒置显微镜观察结果；4-4示对照组1DAPI染色结果；4-5示对照组2倒置显微镜观察结果；4-6示对照组2DAPI染色结果；4-7示对照组3倒置显微镜观察结果；4-8示对照组3DAPI染色结果；4-9示对照组4倒置显微镜观察结果；4-10示对照组4DAPI染色结果。

具体实施方式

本发明提供了一种人皮肤成纤维细胞培养液及培养方法，所述人皮肤成纤维细胞培养液对人皮肤成纤维细胞的规模化培养具有良好的效果。

下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。

实施例中使用的试剂和组分均为市售或自制来源。

如：

胰岛素来源于市售(Sigma)

DMEM培养基来源于市售(Gbico)

胎牛血清来源于市售(Gbico)

黄芪多糖来源于国产市售

刺玫果总黄酮提取物来源于自制

人皮肤成纤维细胞来源于本实验室保存

微载体cytodex3源于市售

HEPES来源于国产市售

DAPI染料来源于市售(Sigma)

实施例1：利用本发明公开的培养液规模化培养人皮肤成纤维细胞

1、配制培养液

试验组：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、60mg刺玫果总黄酮提取物、20mg黄芪多糖和10^-7mmol胰岛素。

对照组1：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清和35mmol HEPES。

对照组2：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、120mg刺玫果总黄酮提取物。

对照组3：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、40mg黄芪多糖。

对照组4：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、2×10^-7mmol胰岛素。

2、微载体cytodex3预处理：将0.25g微载体cytodex3置于50ml塑料离心管中，用0.lmol/L、pH为7.0无钙续磷酸续缓冲液(PBS)浸泡过夜后，吸去PBS，再用PBS洗涤3次，经121℃高压灭菌30分钟后，吸出PBS，用培养基洗涤2次，最后用以上配制的培养液浸泡10小时以上，备用。

3、浓缩静止接种法接种细胞：消化收集平板培养的人皮肤成纤维细胞悬液，总量为2×10⁷的细胞悬液放入上述微载体中，轻轻混匀，在无菌条件下取出50ml无菌高横截面微重力旋转培养瓶，打开瓶盖和两个孔阀门，用注射器将含微载体cytodex3的人皮肤成纤维细胞悬液经注射孔缓缓注入微重力旋转培养瓶中，继续添加上述培养液至30ml，取出两个注射器，盖上瓶盖并将其稍稍扭松，静止横放于二氧化碳孵箱中，培养条件为温度:37℃，二氧化碳浓度:5％。每8小时取出轻轻摇晃1分钟。24小时后取出微重力旋转培养瓶置于紫外消毒后的超净台中，用75％酒精擦拭瓶盖和瓶壁3次，打开瓶盖，将两支无菌10ml注射器(其中一支装有培养液，另一支不装培养基)分别连接在两个取样孔上，打开取样孔阀门，将注射器中的培养液缓慢注入容器内，容器内气泡从另一支空的注射器中排出(培养过程中始终保持容器内无气泡，以避免形成涡流)，将整个容器充满后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后将其移入二氧化碳培养箱中，安装在培养装置上，并根据所接种微载体和细胞的量调整容器的转速，以微载体在旋转过程中不贴附在容器的内外壁上为宜。本试验中设定旋转初速度为7.6rpm。

4、微载体cytodex3生长细胞的DAPI染色法：取出样品后用DAPI染色，置于37℃下0.5小时后，在荧光显微镜下观察，长有细胞的多孔微载体为蓝色，未长细胞的微载体仍为背景色。

试验结果：

1、试验组和对照组在为期7天的培养中细胞生长曲线(参见图1)，可见实验组中的细胞密度高于均对照组，且悬浮细胞数较少；

2、在培养的第5天，荧光倒置显微镜下及DAPI染色(参见图2)后，可见实验组中多个微载体相互聚集在一起，且己完全被细胞所包裹，且微载体上的贴壁细胞数较对照组密集，细胞活力较好，说明本发明的培养液具有较好的人皮肤成纤维细胞保护功能，可促进进一步地规模化培养。

实施例2：利用本发明公开的培养液规模化培养人皮肤成纤维细胞

试验组：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、50mg刺玫果总黄酮提取物、30mg黄芪多糖和10^-8mmol胰岛素。

对照组1：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清和35mmol HEPES。

对照组2：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、100mg刺玫果总黄酮提取物。

对照组3：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、60mg黄芪多糖。

对照组4：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、2×10^-8mmol胰岛素。

按照与实施例1相同的方法进行微载体cytodex3预处理、浓缩静止接种法接种细胞和DAPI染色计数。结果如下：

在培养的第5天，荧光倒置显微镜下及DAPI染色(参见图3)后，可见实验组中多个微载体相互聚集在一起，且己完全被细胞所包裹，且微载体上的贴壁细胞数较对照组密集，细胞活力较好，说明本发明的培养液具有较好的人皮肤成纤维细胞保护功能，可促进进一步地规模化培养。

实施例3：利用本发明公开的培养液规模化培养人皮肤成纤维细胞

试验组：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、80mg刺玫果总黄酮提取物、40mg黄芪多糖和10^-6mmol胰岛素。

对照组1：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清和35mmol HEPES。

对照组2：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、160mg刺玫果总黄酮提取物。

对照组3：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、80mg黄芪多糖。

对照组4：在1L DMEM(高糖型)培养基中含有60mL胎牛血清、35mmol HEPES、2×10^-6mmol胰岛素。

按照与实施例1相同的方法进行微载体cytodex3预处理、浓缩静止接种法接种细胞和DAPI染色计数。结果如下：

在培养的第5天，荧光倒置显微镜下及DAPI染色(参见图4)后，可见实验组中多个微载体相互聚集在一起，且己完全被细胞所包裹，且微载体上的贴壁细胞数较对照组密集，细胞活力较好，说明本发明的培养液具有较好的人皮肤成纤维细胞保护功能，可促进进一步地规模化培养。