本发明涉及药物领域，特别是一种虻虫多肽及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤是当今世界直接危及人类生命的一种最常见、最严重的疾病，传统的手术、放化疗方法只是在延长肿瘤患者生命，在此同时会产生内脏器官损伤、免疫功能抑制等副作用，使病人的生活质量明显下降。如何有效地预防和治疗肿瘤，已成为医学领域研究的一个热点。
虻虫，传统中药之一，属双翅目短角亚目虻科昆虫；为中形到大形的种类，强壮而有软毛，通常称为牛虻。多用其干燥雌虻入药，具有破积、逐瘀、通经之功效，主治瘕、积聚、少腹蓄血、血滞经闭等症状。此外，也是治疗跌打损伤、瘀滞肿痛的特效药。经国内外学者对虻虫的研究，其化学成分主要可分为蛋白质、多糖、微量元素及有机酸四大类。其中蛋白质含量最高，可达50％以上。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种对肿瘤有抑制作用的虻虫多肽。
本发明的另一个目的是提供上述虻虫多肽的制备方法。
本发明的还有一个目的是提供上述虻虫多肽的应用。
本发明的目的是这样实现的：一种虻虫多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将虻虫研磨成浆，加入水稀释，离心去除沉淀，加入复合酶水解；(2)水解后离心去除沉淀；(3)水解液减压旋转蒸发浓缩，采用10000Da透析袋透析；然后将袋外溶液减压旋转蒸发浓缩后，浓缩液利用5000Da透析袋透析，取袋内溶液，经低温冷冻干燥，即为虻虫多肽。
所述的步骤(1)、(2)中，离心去除沉淀的工艺条件为：温度3-5℃，转速10000-14000rpm，时间12-18min。
所述的步骤(3)中，减压旋转蒸发浓缩的温度在40-60℃。
所述的步骤(1)中，加入复合酶水解的条件为：酶解温度为45-55℃，pH为7.5±0.2，酶水解时间为7-9h；然后75-85℃水浴12-18min灭活酶，反应结束。
所述的步骤(1)中，复合酶的加入量为9000-11000U/g，配比为蜗牛酶:木瓜酶:胃蛋白酶:胰蛋白酶＝8-12:4-6:13-17:18-22。
上述制备方法制得的对肿瘤有抑制作用的虻虫多肽。
所述的虻虫多肽的分子量为5000-10000Da。
上述虻虫多肽在制备抑制肿瘤的药物上的应用。
上述虻虫多肽在制备抑制肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌或结肠癌的药物上的应用。
本发明的制备方法简单易得，制得的虻虫多肽经验证具有抑制肿瘤的作用，因此开拓了虻虫多肽的适用症，也给肿瘤的治疗提供了新的治疗药物和方向。
具体实施方式
本发明是一种虻虫多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将虻虫研磨成浆，加入水稀释，离心去除沉淀，加入复合酶水解。优选的，离心去除沉淀的工艺条件为：温度3-5℃，转速10000-14000rpm，时间12-18min。优选的，加入复合酶水解的条件为：酶解温度为45-55℃，pH为7.5±0.2，酶水解时间为7-9h；然后75-85℃水浴12-18min灭活酶，反应结束。复合酶的加入量优选为9000-11000U/g，配比为蜗牛酶:木瓜酶:胃蛋白酶:胰蛋白酶＝8-12:4-6:13-17:18-22。
(2)水解后离心去除沉淀。优选的，离心去除沉淀的工艺条件为：温度3-5℃，转速10000-14000rpm，时间12-18min。
(3)水解液减压旋转蒸发浓缩，采用10000Da透析袋透析；然后将袋外溶液减压旋转蒸发浓缩后，浓缩液利用5000Da透析袋透析，取袋内溶液，经低温冷冻干燥，即为虻虫多肽。优选的，减压旋转蒸发浓缩的温度在40-60℃。
上述制备方法制得的虻虫多肽，其分子量为5000-10000Da。
上述虻虫多肽在制备抑制肿瘤(例如抑制肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞等等)的药物上的应用。
实施例1
制备方法：
将虻虫研磨成浆，加入适量的水稀释，离心(4℃，12000rpm，15min)去除沉淀，加入复合酶水解。酶解温度为50℃，加酶量为10000U/g，酶配比为蜗牛酶:木瓜酶:胃蛋白酶:胰蛋白酶＝10:5:15:20，酶水解时间为8h，pH为7.5，之后80℃水浴15min灭活酶。反应结束。
水解后离心(4℃，12000rpm，15min)去除沉淀。
水解液减压旋转蒸发浓缩(50℃)，采用10000Da透析袋透析；将袋外溶液减压旋转蒸发浓缩(50℃)后，浓缩液利用5000Da透析袋透析，取袋内溶液，经低温冷冻干燥，即为虻虫活性多肽粉(分子量5000-10000Da)。
以下通过体外细胞实验研究本发明活性多肽粉对几种常见肿瘤的体外抑制作用，结果表明本发明多肽粉对实验的肿瘤细胞有抑制作用，例举的体内实验结果表明，本发明活性多肽对荷瘤小鼠肿瘤有一定的抑制作用。
一、体外抗肿瘤实验(MTT比色法)
1.材料与方法
1)癌细胞的选取：人肝癌细胞Hep G-2、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549和人结肠癌细胞HT-29。
2)取上述对数生长期的细胞，经0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后重悬细胞，用血球平板计数调整细胞悬液的浓度至5×104个/mL，加至96孔板中，每孔100μL，于37℃恒温CO2培养箱中培养；
3)培养24h后吸出废旧培养液，加入终体积为200μL的含有不同浓度本发明实施例1(低、中、高组的浓度分别为0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml)的活性多肽粉和阳性药物(5-氟尿嘧啶，5-FU终浓度为0.5mg/ml)的新鲜基础培养基，并以PBS为阴性对照，每组设置5个平行样品，于CO2培养箱37℃恒温培养。
4)48h后吸出药液，加入5mg/mL的MTT溶液(Sigma)20μl和新鲜基础培养基180μL；继续恒温培养4h，弃去含有MTT的培养液，加入150μl DMSO后振荡均匀，于490nm波长处测定光密度值。
5)癌细胞生长抑制率计算方法：
抑制率(％)＝[(OD对照—OD空白)—(OD给药—OD空白)]/(OD对照—OD空白)
6)结果统计：以均数±标准差表示，采用SPSS 15.0软件进行统计处理，多组均数比较采用单因素方差分析。
2.实验结果
本实验通过MTT比色法分析各多肽组分对肝癌细胞Hep G-2、乳腺癌细胞MCF-7、胃癌细胞SGC-7901、肺癌细胞A549和结肠癌细胞HT-29的生长抑制作用。表1结果可以看出，不同浓度的本发明活性多肽对实验5种癌细胞均有抑制作用，其中高剂量组与阳性对照组(5-FU药物组)相比，除对肺癌细胞A549的抑制活性有明显差异(p<0.01)，其他各组均无明显差异。而本发明活性多肽源于传统中药虻虫，毒副作用更少，应用将更广泛。
表1各组对不同癌细胞的抑制率
注：※：高剂量组与5-FU药物组相比p<0.01。
二、荷瘤小鼠实验
1材料与方法
1.1动物及瘤株SPF级雄性昆明种(KM)小鼠，体质量(20±2)g；小鼠H22肝癌细胞由广东药科大学提供。
1.2药物及制备本发明活性多肽粉(按实施例1制备方法制得)，4℃冰箱保存备用；5-氟尿嘧啶(5-FU；美国Sigma公司)。
1.3荷H22小鼠肝癌模型复制
将腹部隆起明显的H22肝癌腹水瘤小鼠，无菌条件下从腹腔抽出瘤液，以生理盐水稀释，1000r/min离心3min，调整瘤细胞浓度为5×106/mL，于小鼠右腋下行皮下无菌接种，接种量为0.2mL/只(即每只1×106个细胞)。
1.4动物分组与给药
50只小鼠随机分为模型组，化疗药物组(阳性对照组)，本发明活性多肽粉(实验组)高、中、低剂量组，每组10只。接种24h后，实验组分别以20、40、80mg·kg-1·d-1剂量灌胃给药；阳性对照组以5-FU 25mg·kg-1·d-1剂量腹腔注射，隔日1次；模型组给予等容积生理盐水灌胃；连续给药14d。
1.5瘤指数检测称取瘤体质量并计算瘤指数：p瘤指数＝m瘤体/m体质量。用免疫组织化学法检测肿瘤组织VEGF、MMP-9蛋白的表达水平。
1.6统计方法实验结果以均数±标准差表示，采用SPSS 15.0软件进行统计处理，多组均数比较采用单因素方差分析。
2.实验结果
表2结果显示：发明活性多肽粉高、中剂量组及化疗药物组均能显著减小荷瘤小鼠瘤体质量及瘤指数，中剂量、高剂量实验组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。
各组对荷H22小鼠瘤组织VEGF、MMP-9蛋白表达的影响结果见表3：高剂量活性多肽粉实验组能显著减少VEGF蛋白的表达，高剂量活性多肽粉实验组及阳性对照组均能显著减少MMP-9蛋白的表达，与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。
表2各组对荷H22小鼠瘤体质量(m)与瘤指数(p)的影响
注：※：与模型组相比p<0.01。
表3各组荷瘤小鼠肝癌组织VEGF、MMP-9表达比较
注：※：与模型组相比p<0.01。
实施例2
制备方法：
将虻虫研磨成浆，加入适量的水稀释，离心(5℃，11000rpm，15min)去除沉淀，加入复合酶水解。酶解温度为45℃，加酶量为11000U/g，酶配比为蜗牛酶:木瓜酶:胃蛋白酶:胰蛋白酶＝10:5:15:20，酶水解时间为8h，pH为7.5，之后80℃水浴15min灭活酶。反应结束。
水解后离心(5℃，11000rpm，15min)去除沉淀。
水解液减压旋转蒸发浓缩(45℃)，采用10000Da透析袋透析；将袋外溶液减压旋转蒸发浓缩(45℃)后，浓缩液利用5000Da透析袋透析，取袋内溶液，经低温冷冻干燥，即为虻虫活性多肽粉(分子量5000-10000Da)。
实施例3
酶配比为蜗牛酶:木瓜酶:胃蛋白酶:胰蛋白酶＝8:4:13:18，其他同实施例1。
实施例4
酶配比为蜗牛酶:木瓜酶:胃蛋白酶:胰蛋白酶＝12:6:17:22，其他同实施例1。
实施例5
酶解温度为55℃，其他同实施例1。
实施例6
减压旋转蒸发浓缩的温度在60℃，其他同实施例1。