本发明涉及生物工程领域，具体地，将单个核细胞复苏并诱导扩增为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法。
背景技术：
：多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller，cik)，为人血液中的单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导、扩增获得的一群异质细胞。该细胞同时表达cd3+和cd56+两种细胞膜表面标志，故称为nk细胞样t淋巴细胞，具有t淋巴细胞活性和nk细胞的非mhc限制性。因此，可用于激活机体免疫系统，提高机体的免疫力；cik细胞能够分泌il-2、il-6、ifn-γ等多种细胞因子，对白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌治疗，防止肿瘤复发与转移，提高患者生活质量发挥了重要作用。cik细胞中的效应细胞cd3+cd56+细胞在正常人外周血中少见，仅1％—5％，数量少。为了获得更多的cik细胞，并满足择期应用的需求，将正常人外周血或脐血等中单个核细胞冷冻保存，需要时进行复苏并诱导、扩增，可获得大量的cik细胞。复苏冷冻保存的细胞，常使用含胎牛血清的培养基作为复苏液。由于胎牛血清为动物来源，不适于细胞产品的临床应用。因此，摸索一种有利于cik细胞诱导、扩增的方法，成为目前亟待解决的问题技术实现要素：本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法，利用包含白蛋白和右旋糖酐冷冻复苏液复苏的单个核细胞，诱导、扩增形成多种细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。根据本发明的一个方面，本发明提供了一种将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将冷冻保存的单个核细胞置于37-42℃水浴中融化，以便得到融化的单个核细胞；将所述融化的单个核细胞与用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液混合，以便得到复苏细胞混合液，其中，所述冷冻复苏液包含白蛋白和右旋糖酐；将所述复苏细胞混合液进行离心处理，以便得到复苏细胞；以及将所述复苏细胞进行定向诱导处理，以便得到诱导后的多种细胞因子诱导的杀伤细胞。根据本发明的实施例的将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法，采用含有白蛋白和右旋糖酐的冷冻复苏液复苏得到的单个核细胞，在后续的诱导过程中，诱导形成多种细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。另外，根据本发明上述实施例的冷冻复苏液还可以具有如下附加的技术特征：根据本发明的实施例，所述白蛋白为人白蛋白。根据本发明的实施例，所述人白蛋白来源于市售人血清白蛋白或自体血浆。根据本发明的实施例，所述白蛋白的含量为1-5％。根据本发明的优选实施例，所述白蛋白的含量为2.5％。根据本发明的实施例，所述右旋糖酐为右旋糖酐40。根据本发明的实施例，所述右旋糖酐的含量为2-8重量％。根据本发明的优选实施例，所述右旋糖酐的含量为5重量％。根据本发明的实施例，所述融化的单个核细胞与所述冷冻复苏液混合的体积比为1：0.5-5。根据本发明的优选实施例，所述融化的单个核细胞与所述冷冻复苏液混合的体积比为1：1。根据本发明的实施例，利用诱导因子进行所述定向诱导处理，所述诱导因子包括：干扰素γ和细胞培养添加物。根据本发明的一些实施例，该细胞培养添加物可以为supgrow。根据本发明的实施例，干扰素γ的浓度为700-1300u/ml。根据本发明的优选实施例，干扰素γ的浓度为1000u/ml。根据本发明的实施例，细胞培养添加物的浓度为1-5体积％。根据本发明的优选实施例，细胞培养添加物的浓度为2.5体积％。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例的将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法的流程示意图；图2显示了根据本发明一个实施例的复苏液对诱导cik细胞增殖的影响；图3显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导17天的p组的细胞表面标志表达情况示意图；图4显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导17天的f1组的细胞表面标志表达情况示意图；图5显示了根据本发明一个实施例的复苏液对诱导cik细胞增殖的影响；图6显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导14天的p组的细胞表面标志表达情况示意图；图7显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导14天的f1组的细胞表面标志表达情况示意图；图8显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导14天的f2组的细胞表面标志表达情况示意图；图9显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导14天的f3组的细胞表面标志表达情况示意图；图10显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导18天的p组的细胞表面标志表达情况示意图；图11显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导18天的f1组的细胞表面标志表达情况示意图；图12显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导18天的f2组的细胞表面标志表达情况示意图；图13显示了根据本发明一个实施例的流式细胞仪检测经体外诱导18天的f3组的细胞表面标志表达情况示意图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。根据本发明的又一方面，本发明提供了一种将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法。参考图1，根据本发明的实施例，该方法包括：s100水浴融化根据本发明的实施例，将冷冻的单个核细胞置于37-42℃水浴中融化，得到融化的单个核细胞。由此，利用水浴使细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。s200复苏处理根据本发明的实施例，将融化的单个核细胞与用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液混合，得到复苏细胞混合液，其中，该冷冻复苏液包括白蛋白和右旋糖酐。由此，利用包括白蛋白和右旋糖酐的冷冻复苏液稀释融化的单个核细胞，在常温下，不仅减少在细胞冻存液中的dmso对单个核细胞的伤害，而且冷冻复苏液中的白蛋白和右旋糖酐对融化的单个核细胞渗透压和营养起调节作用。根据本发明的实施例，该白蛋白为人白蛋白。血液中的白蛋白具有运输、维持渗透压以及营养作用。体外白蛋白具有保护细胞的作用。而人白蛋白与单个核细胞均为血液成分，更有利于保护细胞，使细胞的活力更好，促进单个核细胞诱导为cik细胞，并且得到cik细胞用于临床，患者的排异作用小。根据本发明的实施例，人白蛋白的来源不受特别的限制，只要能提供人白蛋白即可，即可以来源于市售人血清白蛋白，也可以来源于人体血浆。人单个核细胞对人源性的人血清白蛋白或血浆的排异作用小，有利于冻存细胞的恢复。根据本发明的实施例，白蛋白的含量不受特别的限制，只要能提高单个核细胞诱导为cik细胞的诱导效率、扩增倍数或活性即可。根据本发明的一些实施例，白蛋白的含量为1-5％或1-5。由此，复苏得到的细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。根据本发明的优选实施例，白蛋白的含量为2.5。由此，复苏得到的细胞的增殖速率更快，诱导分化效率高，细胞活性更佳。其中需要说明的是，白蛋白的含量即可以是体积百分比也可以是重量百分比，根据白蛋白的状态进行调整，如果是白蛋白是固态，则白蛋白的含量为1-5重量％，如果白蛋白为液态，则白蛋白的含量为1-5体积％。根据本发明的实施例，右旋糖酐为右旋糖酐40。由此，有利于提高细胞的复苏效果。根据本发明的实施例，右旋糖酐的含量为2-8重量％。由此，复苏得到的细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。根据本发明的优选实施例，所述右旋糖酐的含量为5重量％。由此，复苏得到的细胞的增殖速率更快，诱导分化效率高，细胞活性更佳。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的用于多种细胞因子诱导的杀伤细胞的冷冻复苏液。由此，利用该冷冻复苏试剂盒复苏得到的单个核细胞，在后续的诱导过程中，诱导形成多种细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。根据本发明的实施例，融化的单个核细胞与冷冻复苏液混合的体积比为1：0.5-5。由此，保证冷冻复苏液稀释后的dmso浓度较低，对单个核细胞的损伤小。根据本发明的优选实施例，融化的单个核细胞与冷冻复苏液混合的体积比为1：1。由此，在保证稀释后dmso的浓度低，对单个核细胞的损伤小的前提下，冷冻复苏液的用量小，冷冻复苏的成本低。s300离心处理根据本发明的实施例，将复苏细胞混合液进行离心处理，得到复苏细胞。由此，从复苏细胞混合液中离心回收复苏细胞。s400定向诱导处理根据本发明的实施例，将复苏细胞进行定向诱导处理，得到诱导后的多种细胞因子诱导的杀伤细胞。由此，通过定向诱导处理，使单个核细胞诱导分化为cik细胞。根据本发明的实施例，利用诱导因子进行定向诱导处理，其中，诱导因子包括：干扰素γ和细胞培养添加物。根据本发明的一些实施例，该细胞培养添加物可以为supgrow。由此，有利于单个核细胞诱导分化为cik细胞。根据本发明的实施例，干扰素γ的浓度为700-1300u/ml。由此，单个核细胞诱导分化为cik细胞的效率高。根据本发明的优选实施例，干扰素γ的浓度为1000u/ml。由此，单个核细胞诱导分化为cik细胞的效率更佳。根据本发明的实施例，细胞培养添加物的浓度为1-5体积％。由此，单个核细胞诱导分化为cik细胞的效率高。根据本发明的优选实施例，细胞培养添加物的浓度为2.5体积％。由此，单个核细胞诱导分化为cik细胞的效率更佳。根据本发明的实施例的将单个核细胞复苏并诱导为多种细胞因子诱导的杀伤细胞的方法，利用前述冷冻复苏液复苏得到的单个核细胞，在后续的诱导过程中，诱导形成多种细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖速率快，诱导分化效率高，细胞活性好。下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自sigma公司。实施例11、pbmc复苏(1)液氮中取出冷冻保存的外周血单个核细胞(pbmc)，采用37～42℃水浴速融。(2)分别使用等体积的x-vivo15培养基(记为p组)，以及等体积的含2.5％hsa，5％dextran40的复苏液(记为f1组)两种方式处理细胞。(3)离心，分别取细胞，采用细胞活力分析仪计数，测细胞存活率。2、诱导为cik细胞分别将p组和f1组的细胞采用x-vivo15培养基，静置培养24h。然后，在p组和f1组的细胞培养基中加入1000u/mlifn-γ和2.5％supgrow，继续培养24h后，再加入100ng/mlcd3、1000u/mlil-2、1000u/mlil-1α，进行体外诱导扩增。3、计算由于复苏细胞时，起始细胞数不一致，需引用校正因子，计算cd3/cd56阳性细胞数。计算方法如下：(1)计算两组起始细胞数的平均值；(2)使用平均值数除以各组起始细胞数，得到各组的校正因子k；(3)将各组最终细胞数分别乘以对应的校正因子k以及cd3/cd56阳性百分率，即为cd3/cd56阳性细胞数。4.结果(1)复苏实验结果“步骤1”复苏得到的单个核细胞的细胞数和细胞活力结果如表1所示。表1.复苏液对细胞存活率和细胞数的影响分组细胞数细胞活力p(0.89±0.09)×107(93.50±0.01)％f1(0.94±0.30)×107(93.45±0.02)％由表1可见，采用培养基p或复苏液f1处理复苏的细胞，两者细胞数、存活率无显著差别(p>0.05)，结果表明，f1复苏液对复苏得到的单个核细胞的活力和细胞数与对照组p复苏液相比，无显著差别。(2)诱导实验结果(a)细胞增殖“步骤2”中，p组和f1组在不同培养时间诱导增殖得到的cik细胞的结果如表2和图2所示，其中，加入ifn-γ和supgrow进行体外诱导扩增记为第0天。表2.复苏液对诱导cik细胞增殖的影响由表2可见，使用含2.5％hsa、5％dextran40的复苏液(f1)处理细胞有助于冻存细胞复苏后的增殖。(b)表面标志物检测利用流式细胞仪测定经体外诱导的细胞的cik细胞表面标志的表达情况。取诱导第17天的p组、f1组细胞离心收集，生理盐水洗涤，分别加入抗人cd3-pe、cd56-fitc抗体(均来源美国biolegend公司)，4℃，30min，流式细胞仪检测cd3、cd56的表达，具体结果见表3和4以及图3-4所示，图3为p组的结果示意图，图4为f1组的结果示意图。表3.流式检测细胞表型分组cd3+cd56+(％)p13.64±0.13f118.06±0.57#由表3显示，复苏液f1可提高cik细胞表达。(p<0.05)表4.诱导的cik细胞中cd3/cd56阳性细胞数分组cd3+cd56+(×106)p155.99f1263.53由表4显示，复苏液f1可提高诱导的cik细胞中cd3/cd56阳性细胞数。5.结论上述结果表明，采用p组和f1组复苏液处理冷冻保存的外周血来源的单个核细胞两组的细胞数和细胞活力相近，但利用相同诱导、扩增培养基培养，可见随着诱导、扩增时间延长，f1组细胞的增殖倍数显著高于p组，并且cd3/cd56阳性细胞数增加，表明f1组处理的细胞诱导、扩增cik细胞均显著高于p组，进而证明与p组普通培养基的冷冻复苏液相比，f1组(含2.5％hsa、5％dextran40)的冷冻复苏液能够在细胞复苏过程中，显著提高单个核细胞诱导、扩增为cik的能力。实施例21、脐带血mnc复苏(1)液氮中取出冷冻保存的脐带血单个核细胞(mnc)，采用37～42℃水浴速融。(2)分别使用等体积的x-vivo15培养基(记为p组)，以及等体积的含2.5％hsa、5％dextran40的复苏液(记为f1组)，2.5％血浆、5％dextran40的复苏液(记为f2组)，5％血浆、5％dextran40的复苏液(记为f3组)四种方式处理细胞。(3)离心，分别取细胞，采用细胞活力分析仪计数测定细胞活力。2、诱导为cik细胞分别将p和f1-3组处理的细胞采用x-vivo15培养基，静置培养24h。p和f1-3组处理的细胞采用加入1000u/mlifn-γ、2.5％supgrow，继续培养24h后，再加入100ng/mlcd3、1000u/mlil-2、1000u/mlil-1α，进行体外诱导扩增。3、计算计算方法同实施例1。4、结果(1)复苏实验结果“步骤1”复苏得到的单个核细胞的细胞数和细胞活力结果如表5所示。表5.复苏液对细胞存活率和细胞数的影响分组细胞数细胞活力p(2.56±1.39)×107(96.29±0.77)％f1(2.64±0.77)×107(96.14±1.22)％f2(2.58±1.03)×107(95.93±1.94)％f3(2.50±0.37)×107(93.93±0.69)％由表5可见，与p组使用培养基相比，采用复苏液f1、f2、f3处理复苏的单个核细胞，其细胞数和存活率无显著差别p>0.05。(2)诱导实验结果(a)细胞增殖“步骤2”中，p组和f1组在不同培养时间诱导增殖得到的cik细胞的结果如表6和7以及图5所示，其中，加入ifn-γ和supgrow进行体外诱导扩增记为第0天。表6.诱导不同时间处理液对cik细胞数和存活率的影响表7.诱导不同时间cik细胞数扩增倍数由表6、7和图5结果表明，细胞复苏时，使用2.5％hsa、5％dextran40复苏液(f1组)，2.5％血浆、5％dextran40复苏液(f2组)和5％血浆、5％dextran40复苏液(f3组)处理细胞，有助于cik细胞的增殖。(b)表面标志物检测利用流式细胞仪测定经体外诱导的细胞的cik细胞表面标志的表达情况。取诱导第14天的p组、f1、f2、f3、组细胞离心收集，生理盐水洗涤，分别加入抗人cd3-fitc、cd56-bv421抗体(抗体均来源于美国biolegend公司)，4℃，30min，流式细胞仪检测cd3、cd56的表达，具体结果见表8和9以及图6-13，图6为诱导14天的p组的结果示意图，图7-9为诱导14天f1组、f2组、f3组结果示意图；图10为诱导18天的p组的结果示意图，图11-13为诱导18天f1组、f2组、f3组结果示意图。表8.流式检测cik细胞表型14d细胞表型(％)18d细胞表型(％)表9.cd3/cd56阳性细胞数诱导14d诱导18d分组cd3+cd56+(×107)cd3+cd56+(×107)p21.3226.97f126.6236.02f232.4841.37f329.4034.82由表8和9以及图6-13显示，与p组只采用培养基处理细胞相比，f1组、f2组、f3组采用的三种复苏液均可提高cik细胞中cd3/cd56阳性细胞数。5.结论上述结果表明，p组和f1-f3组复苏的脐带血单个核细胞复苏后细胞数和细胞活力相近，但采用相同的培养基诱导、扩增复苏的单个核细胞，随着培养时间延长，f1-f3组的细胞增殖倍数显著高于p组，并且cd3/cd56阳性细胞数增加，表明f1-f3组细胞的诱导、扩增能力均显著高于p组，进而证明与p组的普通培养基冷冻复苏液相比，f1-f3组(含hsa和dextran40)的冷冻复苏液能够在细胞复苏过程中，显著提高单个核细胞诱导诱导和增殖为cik的能力。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页12