本发明涉及微藻养殖技术领域，尤其涉及一种浓缩卵囊藻的培养方法。
背景技术：
微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，微藻营养成分非常丰富，富含蛋白质、氨基酸、多糖、维生素、不饱和脂肪酸和色素等多种高附加值的生物物质，具体可以概括为以下四类：蛋白质、糖类、酯类、核酸及各种矿物质。根据统计，微藻典型的营养组成是：蛋白质含量为40％～60％，总糖含量为10％～30％，总酯含量为10％～30％。不同种类的微藻营养组成相差很大。但大多数微藻的原生质成分密度都比水大，其中糖类的密度约为1500kg/m3，蛋白质约为1300kg/m3，核酸约为1700kg/m3，只有脂类物质的密度小于水的密度(最轻的约为860kg/m3)。
微藻作为对虾养殖系统中重要的生物因子，已经成功应用于对虾养殖中；尤其是波吉卵囊藻是湛江地区对虾高位池养殖中后期虾池中常见的优势种，波吉卵囊藻(Oocystis borgei)隶属于绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，卵囊藻科，卵囊藻属，由2、4、8、16个椭圆形或卵形的细胞组成以群体形式生活。
但多数虾农没有种藻及培藻技能，因此对有效的微藻制剂的需求不断扩大，而现阶段微藻制剂在市面上难以流通，其中主要因素是微藻的活体浓缩技术不够完善。现有的微藻浓缩技术主要包括沉降、气浮、离心、过滤等。沉降和气浮首先是使微藻絮凝，而目前在对微藻絮凝技术上多采用预氧化、化学絮凝、电场絮凝等，常见的预氧化处理包括臭氧化、预氯化、和高锰酸/高铁酸预氧化等，通过改变细胞表面和微藻培养液的性质，使之更易絮凝；化学絮凝多采用金属盐和高分子聚合物等阳离子絮凝剂，通过吸附电中和、吸附架桥和网捕沉淀作用使微藻细胞絮凝沉降，其中以铁系金属盐和铝系金属盐为代表；电场絮凝，在外加电场的作用下，使藻细胞在载体表面形成大的絮凝块。离心是目前应用最为广泛的微藻浓缩方法，分离效果相对较高。过滤是常用固液分离法，也可应用于微藻的浓缩中。但是上述几种方法存在损害微藻细胞、成本高昂的缺陷。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种不损害细胞并且成本低廉的浓缩卵囊藻的培养方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种浓缩卵囊藻的培养方法，将藻种接种至卵囊藻培养基中，在温度为22～35℃，光照强度为600～1000lux的条件下进行培养；所述卵囊藻培养基包括湛水107-13培养液和植物激素；所述卵囊藻培养基的海水比重为1.008～1.016；
所述培养过程中，维持藻液中C：N比高于10:1；所述培养过程中，藻液的pH值维持在8.0～8.8之间。
优选的，采用向藻液中通入空气和CO2的混合气体来维持藻液的C：N和pH值。
优选的，所述混合气体的通入速度为0.6～0.8vvm。
优选的，所述植物激素包括6-苄氨基嘌呤和2.4-二氯苯氧乙酸。
优选的，所述6-苄氨基嘌呤在卵囊藻培养基中的浓度为0.3～0.5mg/L。
优选的，所述2.4-二氯苯氧乙酸在卵囊藻培养基中的浓度为1～6mg/L。
优选的，所述培养在藻液中卵囊藻总细胞浓度达到2.5～3.5×105个/ml时停止。
优选的，所述培养的时间为9～11天。
优选的，所述湛水107-13培养液以海水为溶剂，每升海水中包括80mg的NaNO3、8mg的K2HPO4、0.2mg的FeC6H5O7、200μg的维生素B1、0.5～1.5μg的维生素B12和1g的NaHCO3。
优选的，所述光照的光源包括室外光和荧光灯，所述光照时间为24h/d。本发明的有益效果：本发明提供的浓缩卵囊藻的培养方法通过调节卵囊藻培养的温度和盐度增加多糖包被内卵囊藻8、卵囊藻16细胞群体在总卵囊藻细胞群体的比例至45％以上，增加卵囊藻群体半径；并且通过添加植物激素，促进卵囊藻氨基酸的合成，增加卵囊藻细胞群体的密度；另外通过调节藻液的pH，减少卵囊藻的静电阻力，使卵囊藻更易絮凝。本发明提供的方法在确保卵囊藻细胞活性完好的条件下，增加卵囊藻细胞群体半径和密度，使卵囊藻的沉降速度提升1.5倍以上，缩短沉降时间，节约卵囊藻规模化养殖的成本。
具体实施方式
本发明的目的在于通过优化卵囊藻的培养基和培养条件，增加多糖包被内卵囊藻8、卵囊藻16细胞群体在总卵囊藻细胞群体的比例，增加卵囊藻细胞群体半径和密度，使卵囊藻的沉降速度提升，缩短沉降时间；使得卵囊藻细胞群体自然沉降即可实现浓缩。
本发明提供了一种浓缩卵囊藻的培养方法，将藻种接种至卵囊藻培养基中，在温度为22～35℃，光照强度为600～1000lux的条件下进行培养；所述卵囊藻培养基包括湛水107-13培养液和植物激素；所述卵囊藻培养基的盐度为1.008～1.016；所述培养过程中，维持藻液中C：N比高于10:1；所述培养过程中，藻液的pH值维持在8.0～8.8之间。
在本发明中，所述卵囊藻优选的为波吉卵囊藻，所述卵囊藻藻种的浓度优选的为(3～4)×108个/L，更优选的为(3.2～3.8)×108个/L。本发明对所述藻种的来源没有特殊限定，采用健康无污染的波吉卵囊藻即可。
在本发明中，所述卵囊藻培养基包括湛水107-13营养液；本发明中所述湛水107-13培养液以海水为溶剂，每升海水中优选包括80mg的NaNO3、8mg的K2HPO4、0.2mg的FeC6H5O7、200μg的维生素B1、0.5～1.5μg的维生素B12和1g的NaHCO3。在本发明中，所述海水优选为过滤、消毒后的海水，所述过滤优选采用膜过滤的方法，所述膜过滤使用的滤膜规格优选为2μm；所述海水的消毒优选的采用50％强氯精，所述消毒的时间优选的为12h。本发明在海水消毒后，优选的采用硫代硫酸钠中和海水中残留的氯，暴气20～30h确保海水总残留的氯全部消除。
本发明中，所述卵囊藻的培养基包括植物激素，所述植物激素优选包括细胞分裂素6-苄氨基嘌呤和生长素2.4-二氯苯氧乙酸。在本发明中，所述细胞分裂素6-苄氨基嘌呤作为细胞分裂素在培养基中的浓度优选为0.3～0.5mg/L；更优选为0.4mg/L；所述2.4-二氯苯氧乙酸作为生长素在培养基中的浓度优选为1～6mg/L，更优选为2～5mg/L，最优选的为3～4mg/L。本发明中所述植物激素能够增加卵囊藻细胞的干重以及卵囊藻细胞中氨基酸含量；从而增加卵囊藻细胞群体的密度。
在本发明中，所述卵囊藻培养基的盐度为1.008～1.016，优选为1.010～1.014，更优选的为0.011～0.013。
在本发明中，所述卵囊藻培养的温度为22～35℃，优选的为25～30℃，更优选为26～28℃；所述卵囊藻培养过程中光照优选采用室外光和荧光灯相结合的方式作为光源，所述光照时间优选为24h/d，所述卵囊藻培养的光照强度为
600～1000lux，优选为700～900lux，更优选的为750～850lux。
本发明中，所述卵囊藻在培养过程维持藻液中C：N比高于10:1，藻液的pH值在8.0～8.8之间。在本发明中，所述藻液的C：N比优选的为(10～15):1。本发明优选采用向藻液中通入包括空气和CO2的混合气体的方式维持藻液的碳氮比和pH值，所述混合气体中空气和CO2的体积比优选的为(4～5):1。在本发明中，所述混合气体的通入速度优选的为0.6～0.8vvm，更优选的为0.7vvm。本发明维持藻液中C：N比(10～15):1可以增加卵囊藻形成群体所需胶质多糖的合成量，同时增加卵囊藻8和卵囊藻16细胞在总卵囊藻细胞群体中的比例。本发明维持藻液的pH值在8.0～8.8之间，可以减少卵囊藻的静电阻力，使卵囊藻更易絮凝。
在本发明中所述卵囊藻培养具体的培养时间根据取样检测结果确定。本发明在卵囊藻培养过程中，优选的对卵囊藻进行取样检测，先采用显微镜对卵囊藻细胞浓度计数，其次将卵囊藻藻液以2倍体积稀释法进行稀释为5组，先采用分光光度计于630nm处测得5组吸光度值，建立标准曲线回归方程，确定藻液吸光度值和藻细胞浓度的关系。取培养藻液0.5mL，于630nm处测藻液的吸光度值，以标准曲线回归方程计算藻细胞浓度，优选的藻液的细胞浓度达到2.5～3.5×105个/ml时停止培养，更优选的为3.0×105个/ml时停止培养。
在本发明中，所述卵囊藻培养的时间优选的为9～11天，本发明在卵囊藻细胞停止培养后，优选将得到的藻液自然沉降浓缩，得到浓缩卵囊藻；所述自然沉降浓缩的时间优选为2～4天，更优选的为3天。
本发明在所述自然沉降浓缩后，排出藻液中的上清液，收集藻泥，所述藻泥为细胞活性完好的浓缩卵囊藻。
本发明对所述浓缩卵囊藻的培养容器无特殊限定，优选的在本发明实施例中采用室内池塘或室内PVC桶。
下面结合实施例对本发明提供浓缩卵囊藻的培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
室内大池浓缩卵囊藻的培养方法
对规格为1.5m×30m2室内池塘清洁消毒后，加入过滤海水至1.2m高，用有效氯为50％强氯精1.44kg对水进行消毒12h；再用720g硫代硫酸钠中和，连续曝气24小时，待水中余氯全部消失，加入NaNO32.8kg；K2HPO4280g；FeC6H5O7(10％溶液)0.72L；维生素B17.2g；维生素B1230mg；NaHCO336kg；细胞分裂素6-苄氨基嘌呤18g，生长素2.4-二氯苯氧乙酸40g和波吉卵囊藻藻种1000L(3×108个/L)，采用室外光和荧光灯相结合的方式作为光源24h光照培养，控制光强为900lux，以0.7vvm的通气速度通入空气和纯CO2的混合气体，悬浮微藻，控制水体中的pH值在8.0～8.8之间波动，23～27℃培养11d。取样显微镜观察藻液的细胞浓度达到3.0×105个/ml时停止培养，藻液中卵囊藻8和卵囊藻16细胞群体占总卵囊藻细胞群体的比例62％，停至通气2d，全部卵囊藻沉降于池底，最大沉降速度0.75m/d，排出上清液，收集藻泥。
实施例2
室内大池浓缩卵囊藻的培养方法
对规格为1.5m×44m2室内池塘清洁消毒后，加入过滤海水至1.2m高，用有效氯为50％强氯精2.1kg对水进行消毒12h；再用1.1kg硫代硫酸钠中和，连续曝气24小时，待水中余氯全部消失，加入NaNO34.1kg；K2HPO4410g；FeC6H5O7(10％溶液)1.1L；维生素B110.1g；维生素B1244mg；NaHCO352kg；细胞分裂素6-苄氨基嘌呤26g，生长素2.4-二氯苯氧乙酸58g和波吉卵囊藻藻种1400L(3×108个/L)，采用室外光和荧光灯相结合的方式作为光源24h光照培养，控制光强为950lux，以0.8vvm的通气速度通入空气和纯CO2的混合气体，悬浮微藻，控制水体中的pH值在8.0～8.8之间波动，28～24℃培养9d。取样显微镜观察藻液的细胞浓度达到3.2×105个/ml时停止培养，藻液中卵囊藻8和卵囊藻16细胞群体占总卵囊藻细胞群体的比例60％，停至通气2d，全部卵囊藻沉降于池底，最大沉降速度0.75m/d，排出上清液，收集藻泥。
实施例3
室内PVC桶培养卵囊藻浓缩方法
对规格为2m3的PVC桶清洁消毒后，加入过滤海水1.8m3，用有效氯为50％强氯精72g对水进行消毒12h；再用36g硫代硫酸钠中和，不断暴气24小时，待水中余氯全部消失，加入NaNO3144g；K2HPO415g；FeC6H5O7(1％溶液)0.36L；维生素B1360mg；维生素B120.9mg；NaHCO31.8kg；细胞分裂素6-苄氨基嘌呤0.9g，生长素2.4-二氯苯氧乙酸2g和波吉卵囊藻藻种15L(4×108个/L)，采用室外光和荧光灯相结合的方式作为光源24h光照培养，控制光强为950lux，以0.8vvm的通气速度通入空气和纯CO2的混合气体，悬浮微藻，控制水体中的pH值在8.2～8.6之间波动，25～30℃培养10d。取样显微镜观察计藻液的细胞浓度达到2.9×105个/ml时停止培养，藻液中卵囊藻8和卵囊藻16细胞群体占总卵囊藻细胞群体的比例56％，停至通气35h，全部卵囊藻沉降于池底，最大沉降速度0.8m/d排出上清液，收集藻泥。
实施例4
室内PVC桶培养卵囊藻浓缩方法
对规格为2m3的PVC桶清洁消毒后，加入过滤海水1.8m3，用有效氯为50％强氯精72g对水进行消毒12h；再用36g硫代硫酸钠中和，不断暴气24小时，待水中余氯全部消失，加入NaNO3144g；K2HPO415g；FeC6H5O7(1％溶液)0.36L；维生素B1360mg；维生素B120.9mg；NaHCO31.8kg；细胞分裂素6-苄氨基嘌呤0.9g，生长素2.4-二氯苯氧乙酸2g和波吉卵囊藻藻种15L(3.8×108个/L)，采用室外光和荧光灯相结合的方式作为光源24h光照培养，控制光强为880lux，以0.6vvm的通气速度通入空气和纯CO2的混合气体，悬浮微藻，控制水体中的pH值在8.4～8.5之间波动，28℃培养9d。取样显微镜观察藻液的细胞浓度达到3.5×105个/ml时停止培养，藻液中卵囊藻8和卵囊藻16细胞群体占总卵囊藻细胞群体的比例48％，停至通气32h，全部卵囊藻沉降于池底，最大沉降速度0.72m/d，排出上清液，收集藻泥。
由以上实施例可知，本发明提供的方法在确保卵囊藻细胞活性完好的条件下，增加卵囊藻细胞群体半径和密度，卵囊藻的沉降速度从常规的0.45～0.48m/d增加到0.72～0.8m/d，增加1.5倍以上，缩短沉降时间，节约卵囊藻规模化养殖的成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。