本发明涉及一种组合物，该组合物可作为生物墨水用于制备直写法3D打印的生物水凝胶，以及制备该组合物的方法和一种使用该组合物的直写法3D打印方法。
背景技术：
能够3D 打印水凝胶对于组织工程的发展至关重要。一般来说，水凝胶支架由合成高分子或是天然高分子构成，以给细胞组织的体外生长提供了途径。水凝胶3D打印的一大挑战就是绝大多数的水凝胶前驱体都是水溶液，挤出后无法形成可以自我支撑的结构。因为水溶液在挤出后会快速扩散，这就导致了打印结果会缺失精度和分辨率。同时，用于细胞生长的生物墨水必须具有合适的性能，比如机械强度、耐久性、以及生物相容性。
技术实现要素：
本发明提供一种能够满足以上要求的生物墨水，可以用来实施直写法3D打印方法。
本发明的内容包括：
实施方式1.一种组合物，其中包括：
(a)可光聚合物质；
(b)硫醇；
(c)光引发剂；
(d)温敏高分子；和
(e)水。
实施方式2.实施方式1的组合物，其中所述组合物含有1wt%至90wt%的所述可光聚合物质。
实施方式3.实施方式1或2的组合物，其中所述可光聚合物质是水溶性的和生物相容性的。
实施方式4.实施方式1至3中任一项所述的组合物，其中所述可光聚合物质含有至少一个可光聚合官能团。
实施方式5.实施方式4的组合物，其中所述可光聚合官能团选自以下基团中的至少一个：炔基、降冰片烯基、马来酰亚胺基团、富马酸基团、共轭二烯基、戊二酸基团或其衍生物。
实施方式6.实施方式4的组合物，其中所述可光聚合官能团选自以下基团中的至少一个：，，，，，，，
其中，R1，R2，和R3每次出现时各自独立地选自H、卤素、烷基、卤烷基、羟基、烷氧基、芳香基、和芳氧基；
X每次出现时各自独立地选自C和Si；
X1每次出现时各自独立地选自O、S和SO2。
实施方式7. 实施方式1至3中任一项所述的组合物，其中所述可光聚合物质是单体、寡聚物或是高分子长链物质，
其中所述的单体、寡聚物或是高分子长链物质能够用于形成以下聚合物：聚乳酸、聚乙醇酸交酯、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧丙烷、泊洛沙、聚原酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚对二氧环己酮、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-恶唑啉)、纤维素、多肽、多糖、乙酞肝素、硫酸软骨素、海藻酸、或含有上述一个或多个聚合物链段的共聚物。
实施方式8.实施方式1-7中任一项所述的组合物，其中所述硫醇是水溶性的和生物相容性的。
实施方式9.实施方式1-7中任一项所述的组合物，其中所述硫醇包括选自以下的至少一种：含有巯基的单体、含有巯基的寡聚物和含有巯基的高分子聚合物。
实施方式10.实施方式9所述的组合物，其中所述硫醇具有选自以下的至少一种官能团：羟基、醚基、酯基、羧酸基、氨基、酰胺基、或者其他水溶性官能团。
实施方式11.实施方式9所述的组合物，其中所述含有巯基的寡聚物和含有巯基的高分子聚合物能够形成以下物质：聚乳酸、聚乙醇酸交酯、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧丙烷、泊洛沙、聚原酸酯、聚酐、聚羟基酸、聚对二氧环己酮、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、纤维素、多肽、多糖、乙酞肝素、硫酸软骨素、海藻酸、或含有上述一个或多个聚合物链段的共聚物。
实施方式12.实施方式9所述的组合物，其中所述硫醇包括含有巯基的多支化高分子聚合物。
实施方式13.前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述光引发剂是水溶性的和和生物相容性的。
实施方式14.实施方式13的组合物，其中所述光引发剂能够由紫外光、可见光或者红外光激发。
实施方式15.实施方式13的组合物，其中所述光引发剂包括选自以下的至少一种：自由基光引发剂、阳离子光引发剂、或其组合。
实施方式16.实施方式15的组合物，其中所述自由基光引发剂包括选自以下的至少一种：苯甲酰甲酸甲酯，羟基环乙烷苯酮(Irgacure 184)，苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦（XBPO），巯苯噻唑，Irgacure 651，Irgacure 907，Darocur 2959, 樟脑醌(CQ)，α-酮戊二酸（KGA），N-二甲氨基苯甲酸乙酯（4EDMAB），三乙醇胺(TEA)，或其组合。
实施方式17.实施方式16的组合物，其中所述阳离子光引发剂包括选自以下的至少一种：芳基重氮盐，二芳基碘鎓盐，三芳基锍盐，三芳基硒盐，三芳基锍六氟锑酸盐，或其组合。
实施方式18.前述实施方式中任一项的组合物，其中所述的温敏高分子具有反向热凝胶性（Reverse Thermal Gelation，RTG）。
实施方式19.前述实施方式中任一项的组合物，其中所述温敏高分子是水溶性的。
实施方式20.实施方式18的组合物，其中所述温敏高分子是一种ABA三嵌段共聚物，其中A嵌段和B嵌段是寡聚物嵌段。
实施方式21.实施方式20的组合物，其中所述A嵌段和B嵌段在某一温度下分别为疏水性寡聚物嵌段和亲水性寡聚物嵌段。
实施方式22.实施方式20的组合物，其中所述A嵌段和B嵌段在某一温度下分别为亲水性寡聚物嵌段和疏水性寡聚物嵌段。
实施方式23.实施方式22的组合物，其中所述A嵌段和B嵌段各自独立地包含选自以下的至少一种：脂肪族聚酯嵌段和脂肪族聚醚嵌段。
实施方式24.实施方式22的组合物，其中A嵌段是聚环氧乙烷嵌段，B嵌段是聚环氧丙烷嵌段。
实施方式25.实施方式22的组合物，其中所述温敏高分子是具有结构式(ABA-X)m的多嵌段共聚物,其中A和B每次出现时各自独立地为寡聚物，m是1-30的整数，X是扩链剂。
实施方式26.实施方式25的组合物，其中所述的扩链剂X每次出现时各自独立地为二元、三元或多元异氰酸酯，二元、三元或多元碳酸，酰卤，或其组合。
实施方式27.实施方式25的组合物，其中所述A嵌段和B嵌段在某一温度下分别为亲水性寡聚物嵌段和疏水性寡聚物嵌段。
实施方式28.实施方式25的组合物，其中所述A嵌段和B嵌段在某一温度下分别为疏水性寡聚物嵌段和亲水性寡聚物嵌段。
实施方式29.实施方式25的组合物，其中所述的ABA多嵌段高分子聚合物包括选自以下的至少一种：聚氨酯、聚碳酸酯、聚酯、或其组合。
实施方式30.前述实施方式中任一项的组合物，其中所述的温敏高分子是包括聚（N-取代丙烯酰胺）。
实施方式31.实施方式30的组合物，其中所述聚（N-取代丙烯酰胺）是聚（N-异丙基丙烯酰胺）（NIPAM）。
实施方式32.实施方式20的组合物，其中所述的温敏高分子包括选自以下的至少一种：聚乙烯醇的衍生物，羟丙基甲基纤维素（HPMC），羟乙基乙基纤维素（EHEC）,或其组合。
实施方式33.前述实施方式中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于制备直写法3D打印的生物水凝胶。
实施方式34.制备前述实施方式中任一项的组合物的方法，包括：将所述组合物的成分均匀混合。
实施方式35.一种直写法3D打印生物水凝胶的方法，包括以下步骤：
将实施方式1至34中任一项的组合物挤出，使其形成线状材料；光照使所述线状材料发生光聚合反应；在基底上放置所述线状材料从而形成水凝胶支架。因此，本发明也涉及制备水凝胶支架的方法，包括将实施方式1至34中任一项的组合物挤出，使其形成线状材料；光照使所述线状材料发生光聚合反应；在基底上放置所述线状材料从而形成水凝胶支架。
实施方式36.实施方式35所述的方法，其中所述的光照使所述线状材料发生光聚合反应的步骤在选自以下的一个或多个时刻进行：
（a）与将生物墨水通过微喷嘴挤出的步骤同时发生；
（b）在基底上放置挤出的线状材料后发生；和
（c）在水凝胶支架完全形成后发生。
该墨水有着优异的3D打印性能以及良好的细胞生物相容性。
附图说明
图1是采用组合物通过直写法3D打印方法获得的水凝胶支架。
具体实施方式
本发明提供了水凝胶前驱体水溶液（即生物墨水）和该溶液交联后产生的水凝胶，该水凝胶可3D 打印产生细胞生长的支架。同时，本发明提供了配置这种生物墨水及3D 打印细胞生长支架的方法。
直写法是一种用于打印水凝胶支架的3D 打印技术。运用该技术，我们可以将材料层层组装，创造出层状或是预先确定的3D 水凝胶结构、形状、和微周期性。
水凝胶支架可能由一层或是多层的相互连接的棒状结构堆叠而成。这些棒状结构的宽度（或直径）在10 微米-500 微米之间，其间隙在5 微米-500 微米之间。通常来说，由直写法形成的支架包含1-20 层。这些支架可以是在一维、二维、或是三维上呈周期性排列。
水凝胶支架被广泛应用于组织工程中。水凝胶支架可以提供优异的细胞活性，并且具有一定的机械强度可以方便移植手术。水凝胶支架的多孔结构方便细胞整合，组织生长，并且利于形成组织内的新血管。使用直写法3D 打印构筑水凝胶支架的优势在于，通过这种技术，我们可以非常方便的控制和调整孔隙率、孔眼大小以及支架中各孔隙的相互连通性。
典型的直写法3D 打印机一般包含一个3 轴定位平台，和一个固定在定位平台上的用于储存生物墨水的注射器。当定位平台移动到预先设定的位置时，墨水被通过喷嘴挤出，形成线状材料，并放置在基底上（如玻璃基底）。在打印第一层之后，喷头逐渐沿z 轴方向上移，从而开始打印第二层。这个过程不断重复，直到想要的3D 结构被完整打印。光照固化使挤出的线状材料发生光聚合反应的步骤可以发生在：
（a）与将生物墨水通过微喷嘴挤出的步骤同时发生；（b）在基底上放置挤出的线状材料后发生；（c）在水凝胶支架完全形成后发生。
挤出后的水凝胶线条有两相：未光固化相和已光固化相，两者有着不同的弹性。
未光固化相的水凝胶线条包括单纯物理缠绕的高分子网络，这一物理凝胶结构具有适宜通过喷头挤出的弹性和黏度行为。与其对比，已光固化相的水凝胶线条包括物理交联的高分子网络与化学交联的高分子网络。比如，这种生物墨水可能包含一种长链高分子聚合物和可光聚合的单体，可以在光照固化后形成一种互穿的物理和化学凝胶结构。这一互穿的物理和化学凝胶结构比单纯的物理缠绕的高分子网络有更好的机械强度。
在另一种情况中，已光固化相可能包含化学交联的高分子网络，而不包含物理缠绕的高分子链。这种生物墨水可能包括被化学修饰过的物理缠绕的高分子链。在这种高分子链的两端或主链被引入了可光聚合官能团。在光照固化后，这种长链高分子可以自我交联，从而物理凝胶结构就转变我化学凝胶结构。
直写法3D 打印的关键在于所使用的材料，即前驱体溶液或“墨水”。墨水必须能够从喷嘴挤出成线状，并且能够快速固化以保持打印后的形状。符合条件的生物墨水可能包含一种长链高分子，一种可光聚合的物质（比如至少含有一个可光聚合官能团的单体、寡聚物或是高分子）。墨水也可能包括一种交联剂、一种光引发剂、以及水。
高分子可分为线性结构或多支化结构。线性高分子的分子链即为一条简单的长链。如果高分子长链上以不规则频率出现与主链重复单元相同的短分子链，则该结构被称为支化高分子；如果高分子长链上以不规则频率出现与主链重复单元不同的短分子链，则该结构被称为接枝共聚高分子；如果高分子长链的每个重复单元都包含相同的短分子链，则该结构被称为梳状高分子；如果以小分子为中心，包含从中心放射性向外的支链，则该结构被称为星状高分子。与线性高分子只能包含一到两个官能团相比，多支化高分子可以包含多个官能团。
扩链剂又称链增长剂，是能与线型聚合物链上的官能团反应而使分子链扩展、分子量增大的物质。常用于提高高分子的机械性能和工艺性能。
通过调节该长链高分子的分子量，可光聚合物质的种类或是官能团数目，分子结构（线性结构或多支化结构）以及可光聚合物质和交联剂的浓度，我们可以调节墨水和水凝胶的性质以达到特定的打印参数，从而适应不同的打印体系。
生物细胞可以直接混合入该生物墨水中。这时，直写法3D 打印出的就是包裹着细胞的水凝胶3D 结构。也可以在水凝胶支架打印完成后再将生物细胞附着在水凝胶表面。
由于生物墨水将用于生物应用，所以其必须具有优异的生物相容性。按照ISO10993的定义，生物相容性是指生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能，一般是指材料与宿主之间的相容性，包括组织相容性和血液相容性。ISO10993包含17个相关标准,包括医疗器械和生物材料生物学评价试验指南(ISO10993-1)。
生物3D打印出的水凝胶将于活体细胞接触，细胞生长后将会移植入人体。所以根据ISO10993的要求，用于生物3D打印的生物墨水需要满足以下几类标准化生物学评价方法: 10993-3遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验,10993-4的血液相互作用试验选择、10993-5细胞毒性试验(体外),10993-6植入后局部反应试验,10993-10刺激和致敏试验,10993-11全身毒性试验。
这种生物墨水可能包含一种可光聚合的物质。这种物质可以是至少包含一个可光聚合官能团的单体、寡聚物或是高分子聚合物，比如甲基丙烯酸羟乙酯或者聚乙二醇二丙烯酸酯。在光照聚合过程中，这种可光聚合的物质形成化学交联的高分子网络，并与生物墨水中的长链高分子形成互穿结构。这种可光聚合的物质在生物墨水中的浓度可以是5 wt%至55 wt%。
通常来说，用于高分子光聚合的UV 波长在250nm 至420nm 之间，而光照的强度在50 mW/cm2 至2 W/cm2。UV 光照的强度和照射时间决定了水凝胶支架在UV 光下的曝光强度。如果曝光强度不够高，可光聚合的物质可能无法完全交联，从而水凝胶支架的机械强度就无法达到理想水平。然而如果曝光强度太高，生物墨水中的细胞就可能被UV 光损伤。
自由基聚合的氧阻聚效应是直写法3D 打印的最大阻碍。氧气会淬熄光引发剂产生的增加，从而阻碍自由基聚合。而在直写法3D 打印中，挤出的生物墨水线条的直径只有数百微米，这时的氧阻聚效应就更加明显。因为线条与氧气有了更大的接触面积。氧阻聚效应会导致水凝胶表面没有完全固化，甚至于无法固化。所以，对于数百微米级尺度的直写法3D 打印，氧阻聚效应是一种主要阻碍。可能避免氧阻聚效应影响材料固化的途径有：在氮气保护下打印；使用极高强度的UV光照射；或是提高光引发剂的浓度。但是，细胞无法在氮气气氛中长时间存活；高UV 曝光强度和高浓度的光引发剂都可能对细胞活性有害。
本发明利用硫醇-烯反应来避免氧阻聚效应对直写法3D 打印的阻碍。氧气分子会和碳自由基或是硫醇自由基反应生成过氧自由基。过氧自由基并不会淬熄高分子链增长反应，而会夺去硫醇上的氢原子，从而形成另一个硫醇自由基，从而继续高分子链增长反应。以这种方式，氧阻聚效应将会被避免。
生物墨水中的水溶性长链高分子需要保持足够的浓度，从而其能在生物墨水中物理缠绕。这样，生物墨水将具有剪切变稀性质。一般来说，水溶性长链高分子的浓度是在1%至90%之间，具体数值取决于该水溶性高分子的物理性质与分子量大小。
为了成功通过直写法3D 打印多孔3D 结构，挤出的结构必须能够自我支撑：挤出的材料可以保持线状，并且不需要额外的支撑结构。自我支撑结构能够避免在打印过程中发生的结构变形。
为了能够自我支撑，生物墨水需要具有显著的剪切变稀性质，也就是说，生物墨水的剪切储存模量(G′)需要远大于剪切损失模量(G″)。这样一来，生物墨水在外加应力小于阈值时呈稳态；而当直写法3D 打印时，外加应力等于或大于阈值，生物墨水可以流动。
当压力被施加于装有生物墨水的注射器时，喷嘴处的剪切应力等于或大于剪切应力阈值，从而生物墨水在喷嘴处剪切变稀。其剪切损失模量(G″)必须足够低，从而生物墨水可以被轻松从喷嘴挤出。一旦生物墨水从喷嘴中被挤出，其所受到的剪切应力小于剪切应力阈值。其剪切储存模量(G′)必须足够高，从而挤出的生物墨水线条可以自我支撑，保持挤出后的形状。以这种方式，挤出的水凝胶支架可以保持其3D 结构。这一过程可以在无菌的缓冲液环境下进行，所以细胞可以随着生物墨水通过打印机喷嘴挤出，同时保持活性。
在生物墨水的配置中，将不同组分均匀分散形成均一液体至关重要，因为不均匀的混合物可能会堵塞喷嘴，导致光照固化失败，或影响细胞生长。但是，具有剪切变稀性质的生物墨水很难以传统方式混合均匀。具有反向热凝胶性质的温敏高分子给出了一个解决方案。该类高分子溶于水后，具有低临界转变温度(LCST)：
其水溶液在低温时是低黏度液体，从而易于与其他组分混合均匀形成均一液体。
当温度高于其凝胶温度(Tgel)，其水溶液黏度增大，形成该温敏高分子的物理缠绕网络，形成水凝胶。在其凝胶点，生物墨水具有良好的剪切变稀性质，利于通过喷嘴挤出。
与反向热凝胶高分子相比，传统的热凝胶高分子的水溶液在高温时是低黏度液体。
如果使用传统的热凝胶高分子的水溶液配置生物墨水，混合就要求在高温下进行。而这种高温将对掺杂在生物墨水中的细胞有不好的影响。或者通过喷嘴挤出就需要在低温下进行，这在技术上难以实现。
聚乙二醇-聚丙二醇-聚二乙醇（简写为PEO-PPO-PEO）共聚高分子的高浓度水溶液的黏度在温度4-40℃之间会发生显著变化，呈现反向热凝胶性质。研究表明，这种显著的黏度变化是因为胶束浓度趋向于临界体积分数0.53，从而形成“硬球结晶”。
除了PEO-PPO-PEO 共聚高分子的胶束体系外，另一种反向热凝胶高分子是羟乙基乙基纤维素（EHEC）。羟乙基乙基纤维素的水溶液和相应的离子型表面活性剂会在高温下凝胶，而当温度冷却到凝胶点以下时重新液化。凝胶的原因主要是表面活性剂与羟乙基乙基纤维素高分子链在高温下络合。随着温度的升高，表面活性剂团聚下降，而团聚的离子化程度会提高。羟乙基乙基纤维素的疏水部分与这些团聚相络合，导致了交联，从而凝胶。
另一类反向热凝胶高分子是聚（N-异丙基丙烯酰胺）。聚（N-异丙基丙烯酰胺）的水溶液会在33.6° C 左右经历体积相转变，从膨胀的凝胶变为收缩的凝胶。这种变化是源于聚（N-异丙基丙烯酰胺）高分子的疏水性。高分子会通过分子间氢键团聚在一起，从而导致相分离。聚（N-异丙基丙烯酰胺）在稀溶液中要比在浓溶液中排列更加规整，就是由于高分子与水分子能够形成相对较强的氢键。而当温度上升，这些氢键强度会下降，从而之前的结构变得不稳定，从而凝胶。
实施例
实施例1
在冰浴中，将20g 聚乙二醇二丙烯酸酯（分子量~200）溶于80g 去离子水。然后，在该聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液中加入25g 普兰尼克 F127（聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物），2g 二硫苏糖醇，以及3g α-酮戊二酸。在冰浴中搅拌以得到均一溶液。将该溶液倒入注射器中。待溶液恢复到室温，即可将注射器加装在直写法3D 打印机上。打印机运行网状结构的3D模型文件，定位平台按照程序设定的路径运动，同时通过气动活塞压缩生物墨水挤出在玻璃基底表面。在挤出成线状材料的同时，打开打印机附带的UV光源（365 nm波长，150 mW/cm2）进行光照固化。打印完成后，即可得到一网状结构水凝胶支架（图1）。所得到的水凝胶支架柔软且有弹性，在消毒后，可用于细胞培养。
实施例2
在冰浴中，将20g 聚乙二醇二丙烯酸酯（分子量~200）溶于80g 去离子水。然后，在该聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液中加入25g 普兰尼克 F127（聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物），1.5g 二硫苏糖醇，以及5g 羟基环乙烷苯酮(Irgacure 184)。在冰浴中搅拌以得到均一溶液。将该溶液倒入注射器中。待溶液恢复到室温，即可将注射器加装在直写法3D 打印机上。打印机运行网状结构的3D模型文件，定位平台按照程序设定的路径运动，同时通过气动活塞压缩生物墨水挤出在玻璃基底表面。在挤出成线状材料的同时，打开打印机附带的UV光源（365 nm波长，150 mW/cm2）进行光照固化。打印完成后，将所得的水凝胶支架放在打印机附带的UV光源下继续曝光2分钟，使其进一步固化。所得到的水凝胶支架柔软且有弹性，在消毒后，可用于细胞培养。
实施例3
在冰浴中，将20g 聚乙二醇二丙烯酸酯（分子量~200）溶于80g 去离子水。然后，在该聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液中加入25g 普兰尼克 F127（聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物），2.5g 二硫苏糖醇，以及3.6g 苯甲酰甲酸甲酯。在冰浴中搅拌以得到均一溶液。将该溶液倒入注射器中。待溶液恢复到室温，即可将注射器加装在直写法3D 打印机上。打印机运行网状结构的3D模型文件，定位平台按照程序设定的路径运动，同时通过气动活塞压缩生物墨水挤出在玻璃基底表面。在挤出成线状材料的同时，不打开打印机附带的UV光源，而是在打印完成后，将所得的水凝胶支架放在打印机附带的UV光源（365 nm波长，150 mW/cm2）下曝光5分钟，使其固化。所得到的水凝胶支架柔软且有弹性，在消毒后，可用于细胞培养。