一种改进的腺苷酸环化酶的制备方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种改进的腺苷酸环化酶的制备方法。

背景技术：

结构和功能分析需要大量的膜蛋白样本，但是一个瓶颈是如何大批量高效的获得膜蛋白。在无细胞表达系统生产蛋白复杂性降低带来了转录翻译流程的高效运转。采用助表达序列的策略可以基于翻译起始的优化带来无细胞表达效率的快速提高。高频使用稀有密码子以及不利起始翻译已被确定为蛋白质生物合成的主要限制步骤，在mrna的5'端区域，如核糖体结合位点涉及高风险的二级结构的形成可以减缓甚至阻止启动程序，高频的稀有密码子可能造成翻译停顿，错配的氨基酸，甚至过早终止事件，但这样的问题可以由合成基因表达的优化来解决。

腺苷酸环化酶，简称adcy，是膜整合蛋白，12次跨膜糖蛋白,是g蛋白的效应物,能催化atp生成camp,引起细胞应答。腺苷酸环化酶广泛分布于哺乳动物的细胞膜中，此酶催化atp生成camp并释放焦磷酸。腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上。腺苷酸环化酶(adcy)是g蛋白偶联受体(gpcrs)下游的关键信号分子。基本上标准的无细胞是无法表达出完整的蛋白分子的，所以需要对无细胞表达条件进行改进。

技术实现要素：

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于提供了一种改进的无细胞合成技术，旨在体外合成腺苷酸环化酶。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供了一种改进的无细胞合成，包括以下步骤：

(1)待表达基因的密码子优化；

在密码子优化后的待表达基因序列的n段添加助表达序列b-tag，c端添加10×his标签，三段序列连接成整个序列，作为基因克隆的模板。

(2)目的片段的pcr反应；

设计引入酶切位点的上游引物和引入酶切位点的下游引物，对模板进行pcr扩增。

(3)pcr产物的纯化回收；

对pcr产物进行纯化和回收，另一方面，将pet28a质粒载体转化大肠杆菌dh5a，培养过夜后提取质粒，并进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行纯化回收。

(4)重组表达载体的构建；

将上述含酶切位点的待表达基因片段与线性pet28a质粒按2：1比例、在45℃下保温5min后，置于冰浴中冷却，冷却后分别加入1μlt4dna连接酶、2μl10×t4dna连接酶缓冲液，l6℃保温16h。连接液转化大肠杆菌dh5α，经37℃培养过夜后，挑选3～5个菌落做pcr验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于dna测序。对经测序确证的、含pet28a重组质粒的菌落进行质粒提纯。

(5)目的基因的无细胞蛋白合成反应

取300μl标准反应混合物装于d-tube^tmdialyzermidi(thermo，3.5kda)中，4.5ml供应试剂(feedingbuffer)装于50mlcorning离心管中。将d-tube^tmdialyzermidi放入50ml离心管中。供应试剂没有模板，没有t7rna聚合酶，其余与标准反应混合物一致。通过sds-page来检测adcy2的表达情况。

另外，根据本发明上述实施例一还可以具有如下附加的技术特征：改进的无细胞合成系统可以提高表达效率，延长反应时间。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1构建后pet28a-adcy2载体图谱

图2adcy2无细胞表达图

图3adcy2蛋白纯化电泳图

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例一

1.对adcy2基因进行密码子优化，优化后的密码子，核苷酸序列如seqidno：1所示，在密码子优化后序列的adcy2基因的n段添加助表达序列b-tag，如seqidno：2所示；助表达序列为：(5’-atccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctat-3’)；c端添加10×his标签，如seqidno：3所示；标签为：(5’-catcatcatcatcatcatcatcatcatcat-3’；hhhhhhhhhh)；基因合成整个序列，作为基因克隆的模板。

2.取上述合成的含b-tag和10×his标签目的片段作为pcr反应的模板，设计引入ncoⅰ酶切位点的上游引物，如seqidno：4所示；引物序列为：(5’-atgctccatggatccagcgtactccaaagatt-3’)；引入xhoⅰ酶切位点的下游引物如seqidno：5所示；助表达序列为：(5’-gggccctcgagatgatgatgatgatgatgatgatgatgatg-3’)；分别取4.0μl模板、2μl10μmol/l的上游和下游引物、1.0μlpfudnapolymerase(5u/μl)、10μl10×buffer、5.0μldntpmixture作为pcr反应体系。用无菌水将反应液调至50μl，于95℃条件下预变性处理2min，然后分别在94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最终72℃终延伸5min，整个pcr反应体系共进行35个循环。

3.pcr产物的纯化回收

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，进行dna纯化。纯化后的adcy2片段进行双酶切，反应体系如下：30μl添加了酶切位点的adcy2片段、5μl10×bufer、1μlncoⅰ(20u/μl)、lμlxhoⅰ(20u/μl)，用无菌水将反应液调至50μl后，于37℃下保温1h，然后在65℃条件下处理20min进行热失活。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，dna纯化试剂盒纯化回收。另一方面，将pet28a质粒载体转化大肠杆菌dh5a，培养过夜后提取质粒，并进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行纯化回收。

4.pet28a-adcy2重组表达载体的构建

将上述含酶切位点的adcy2片段与线性pet28a质粒按2：1比例、在45℃下保温5min后，置于冰浴中冷却，冷却后分别加入1μlt4dna连接酶、2μl10×t4dna连接酶缓冲液，l6℃保温16h。连接液转化大肠杆菌dh5α，经37℃培养过夜后，挑选3～5个菌落做pcr验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于dna测序。对经测序确证的、含pet28a-adcy2重组质粒的菌落进行质粒提纯。

5.目的基因的无细胞蛋白合成反应

标准的无细胞蛋白合成反应包括如下成分：57mmhepes-koh(ph8.2)，1.2mmatp，0.85mmgtp，0.85mmutp，0.85mmctp，0.64mmcamp，200mm谷氨酸钾，80mm醋酸铵，15mm醋酸镁，34μg/mlfolinicacid，6.7μg/ml质粒，33μg/mlt7rna聚合酶，20种氨基酸各500μm，2％pet8000，33mm磷酸烯醇式丙酮酸，和24％大肠杆菌抽提物。

对于半连续的表达体系，300μl标准反应混合物装于d-tube^tmdialyzermidi(thermo，3.5kda)中，4.5ml供应试剂(feedingbuffer)装于50mlcorning离心管中。将d-tube^tmdialyzermidi放入50ml离心管中。供应试剂没有模板，没有t7rna聚合酶，其余与标准反应混合物一致。通过sds-page来检测adcy2的表达情况。

实施例二

1.对adcy2基因进行密码子优化，优化后的密码子，核苷酸序列如seqidno：1所示，在密码子优化后序列的adcy2基因的c端添加10×his标签，如seqidno：3所示；标签为：(catcatcatcatcatcatcatcatcatcat；hhhhhhhhhh)；基因合成整个序列，作为基因克隆的模板。

2.取上述合成的含10×his标签目的片段作为pcr反应的模板，设计引入ncoⅰ酶切位点的上游引物，如seqidno：4所示；引物序列为：

(5’-atgctccatggatccagcgtactccaaagatt-3’)；引入xhoⅰ酶切位点的下游引物如seqidno：5所示；助表达序列为：

(5-gggccctcgagatgatgatgatgatgatgatgatgatgatg-3’)；分别取4.0μl模板、2μl10μmol/l的上游和下游引物、1.0μlpfudnapolymerase(5u/μl)、10μl10×buffer、5.0μldntpmixture作为pcr反应体系。用无菌水将反应液调至50μl，于95℃条件下预变性处理2min，然后分别在94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最终72℃终延伸5min，整个pcr反应体系共进行35个循环。

3.pcr产物的纯化回收

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，进行dna纯化。纯化后的adcy2片段进行双酶切，反应体系如下：30μl添加了酶切位点的adcy2片段、5μl10×bufer、1μlncoⅰ(20u/μl)、lμlxhoⅰ(20u/μl)，用无菌水将反应液调至50μl后，于37℃下保温1h，然后在65℃条件下处理20min进行热失活。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，dna纯化试剂盒纯化回收。另一方面，将pet28a质粒载体转化大肠杆菌dh5a，培养过夜后提取质粒，并进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行纯化回收。

4.pet28a-adcy2重组表达载体的构建

将上述含酶切位点的adcy2片段与线性pet28a质粒按2：1比例、在45℃下保温5min后，置于冰浴中冷却，冷却后分别加入1μlt4dna连接酶、2μl10×t4dna连接酶缓冲液，l6℃保温16h。连接液转化大肠杆菌dh5α，经37℃培养过夜后，挑选3～5个菌落做pcr验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于dna测序。对经测序确证的、含pet28a-adcy2重组质粒的菌落进行质粒提纯。

5.目的基因的无细胞蛋白合成反应

标准的无细胞蛋白合成反应包括如下成分：57mmhepes-koh(ph8.2)，1.2mmatp，0.85mmgtp，0.85mmutp，0.85mmctp，0.64mmcamp，200mm谷氨酸钾，80mm醋酸铵，15mm醋酸镁，34μg/mlfolinicacid，6.7μg/ml质粒，33μg/mlt7rna聚合酶，20种氨基酸各500μm，2％pet8000，33mm磷酸烯醇式丙酮酸，和24％大肠杆菌抽提物。对于半连续的表达体系，300μl标准反应混合物装于d-tube^tmdialyzermidi(thermo，3.5kda)中，4.5ml供应试剂(feedingbuffer)装于50mlcorning离心管中。将d-tube^tmdialyzermidi放入50ml离心管中。供应试剂没有模板，没有t7rna聚合酶，其余与标准反应混合物一致。通过sds-page来检测adcy2的表达情况。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

<110>武汉金开瑞生物工程有限公司

<120>一种改进的腺苷酸环化酶的制备方法

<130>2016

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>3273

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

atgtggcaggaagctatgcgtcgtcgtcgttacctgcgtgaccgttctgaagaagctgct60

ggtggtggtgacggtctgccgcgttctcgtgactggctgtacgaatcttactactgcatg120

tctcagcagcacccgctgatcgttttcctgctgctgatcgttatgggttcttgcctggct180

ctgctggctgttttcttcgctctgggtctggaagttgaagaccacgttgctttcctgatc240

accgttccgaccgctctggctatcttcttcgctatcttcatcctggtttgcatcgaatct300

gttttcaaaaaactgctgcgtctgttctctctggttatctggatctgcctggttgctatg360

ggttacctgttcatgtgcttcggtggtaccgtttctccgtgggaccaggtttctttcttc420

ctgttcatcatcttcgttgtttacaccatgctgccgttcaacatgcgtgacgctatcatc480

gcttctgttctgacctcttcttctcacaccatcgttctgtctgtttgcctgtctgctacc540

ccgggtggtaaagaacacctggtttggcagatcctggctaacgttatcatcttcatctgc600

ggtaacctggctggtgcttaccacaaacacctgatggaactggctctgcagcagacctac660

caggacacctgcaactgcatcaaatctcgtatcaaactggaattcgaaaaacgtcagcag720

gaacgtctgctgctgtctctgctgccggctcacatcgctatggaaatgaaagctgaaatc780

atccagcgtctgcagggtccgaaagctggtcagatggaaaacaccaacaacttccacaac840

ctgtacgttaaacgtcacaccaacgtttctatcctgtacgctgacatcgttggtttcacc900

cgtctggcttctgactgctctccgggtgaactggttcacatgctgaacgaactgttcggt960

aaattcgaccagatcgctaaagaaaacgaatgcatgcgtatcaaaatcctgggtgactgc1020

tactactgcgtttctggtctgccgatctctctgccgaaccacgctaaaaactgcgttaaa1080

atgggtctggacatgtgcgaagctatcaaaaaagttcgtgacgctaccggtgttgacatc1140

aacatgcgtgttggtgttcactctggtaacgttctgtgcggtgttatcggtctgcagaaa1200

tggcagtacgacgtttggtctcacgacgttaccctggctaaccacatggaagctggtggt1260

gttccgggtcgtgttcacatctcttctgttaccctggaacacctgaacggtgcttacaaa1320

gttgaagaaggtgacggtgacatccgtgacccgtacctgaaacagcacctggttaaaacc1380

tacttcgttatcaacccgaaaggtgaacgtcgttctccgcagcacctgttccgtccgcgt1440

cacaccctggacggtgctaaaatgcgtgcttctgttcgtatgacccgttacctggaatct1500

tggggtgctgctaaaccgttcgctcacctgcaccaccgtgactctatgaccaccgaaaac1560

ggtaaaatctctaccaccgacgttccgatgggtcagcacaacttccagaaccgtaccctg1620

cgtaccaaatctcagaaaaaacgtttcgaagaagaactgaacgaacgtatgatccaggct1680

atcgacggtatcaacgctcagaaacagtggctgaaatctgaagacatccagcgtatctct1740

ctgctgttctacaacaaagttctggaaaaagaataccgtgctaccgctctgccggctttc1800

aaatactacgttacctgcgcttgcctgatcttcttctgcatcttcatcgttcagatcctg1860

gttctgccgaaaacctctgttctgggtatctctttcggtgctgctttcctgctgctggct1920

ttcatcctgttcgtttgcttcgctggtcagctgctgcagtgctctaaaaaagcttctccg1980

ctgctgatgtggctgctgaaatcttctggtatcatcgctaaccgtccgtggccgcgtatc2040

tctctgaccatcatcaccaccgctatcatcctgatgatggctgttttcaacatgttcttc2100

ctgtctgactctgaagaaaccatcccgccgaccgctaacaccaccaacacctctttctct2160

gcttctaacaaccaggttgctatcctgcgtgctcagaacctgttcttcctgccgtacttc2220

atctactcttgcatcctgggtctgatctcttgctctgttttcctgcgtgttaactacgaa2280

ctgaaaatgctgatcatgatggttgctctggttggttacaacaccatcctgctgcacacc2340

cacgctcacgttctgggtgactactctcaggttctgttcgaacgtccgggtatctggaaa2400

gacctgaaaactatgggttctgtttctctgtctatcttcttcatcaccctgctggttctg2460

ggtcgtcagaacgaatactactgccgtctggacttcctgtggaaaaacaaattcaaaaaa2520

gaacgtgaagaaatcgaaactatggaaaacctgaaccgtgttctgctggaaaacgttctg2580

ccggctcacgttgctgaacacttcctggctcgttctctgaaaaacgaagaactgtaccac2640

cagtcttacgactgcgtttgcgttatgttcgcttctatcccggacttcaaagaattctac2700

accgaatctgacgttaacaaagaaggtctggaatgcctgcgtctgctgaacgaaatcatc2760

gctgacttcgacgacctgctgtctaaaccgaaattctctggtgttgaaaaaatcaaaacc2820

atcggttctacctacatggctgctaccggtctgtctgctgttccgtctcaggaacactct2880

caggaaccggaacgtcagtacatgcacatcggtactatggttgaattcgctttcgctctg2940

gttggtaaactggacgctatcaacaaacactctttcaacgacttcaaactgcgtgttggt3000

atcaaccacggtccggttatcgctggtgttatcggtgctcagaaaccgcagtacgacatc3060

tggggtaacaccgttaacgttgcttctcgtatggactctaccggtgttctggacaaaatc3120

caggttaccgaagaaacctctctggttctgcagaccctgggttacacctgcacctgccgt3180

ggtatcatcaacgttaaaggtaaaggtgacctgaaaacctacttcgttaacaccgaaatg3240

tctcgttctctgtctcagtctaacgttgcttct3273

<210>2

<211>78

<212>dna

<213>助表达序列b-tag

<400>2

atccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtca60

aatttcctgaattgctat78

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>10×his标签

<400>3

catcatcatcatcatcatcatcatcatcathhhhhhhhhh40

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

atgctccatggatccagcgtactccaaagatt32

<210>5

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gggccctcgagatgatgatgatgatgatgatgatgatgatg41