本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种无血清培养基及其制备方法。
背景技术：
近年来，随着动物细胞培养技术的日益成熟，动物细胞培养生产疫苗、单克隆抗体以及功能蛋白的新兴产业迅速发展壮大。绝大多数的细胞培养需要动物来源的血清，血清可以为离体培养的细胞提供丰富的生长因子、激素和其它营养物质。然而，由于血清中蛋白种类较多、成分复杂，增加了下游提取工作的负担和成本。同时，血清价格昂贵、批次间质量不稳定、易引入动物源的病毒和支原体，给细胞培养带来了诸多不便。
无血清培养基是解决上述问题的关键，由于无血清培养基蛋白含量低、质量稳定、无病毒等潜在危险引入，大大降低了细胞培养和产物提取的成本，简化了生产工艺。无血清培养基的开发和应用有利于动物细胞的大规模、产业化培养。
目前国外已有生物企业研发的无血清培养基产品成功上市，如Gibco、Hyclone、Lonza等，但价格昂贵；国内无血清培养基的研发尚处于起步阶段，目前鲜有上市品牌。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种无血清培养基及其制备方法，能够为细胞提供良好的生殖环境，且易于细胞提取。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：发明一种无血清培养基，其特征在于：各原料在无血清培养基中的浓度(mg/L)如下：
优选的，各原料在无血清培养基中的浓度(mg/L)如下：
优选的，所述水为超纯水。
本发明还提供了一种上述无血清培养基的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备储液：
将甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺一水、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐一水、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸分别溶于水或者两种以上混合溶于水，制得氨基酸储液，并进行冷冻保存；
将L-谷氨酰胺溶于水，制得谷氨酰胺储液，并进行冷冻保存；
将L-色氨酸和L-酪氨酸二钠盐分别或者混合溶解在0.1mol/L的盐酸中，制得色氨酸和酪氨酸二钠盐储液，并进行冷冻保存；
将抗坏血酸、生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、尼克酰胺、盐酸吡哆素、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12和肌醇分别溶于水或者两种以上混合溶于水，制得维生素储液，并进行冷藏保存；
将氯化钙、硫酸镁和一水磷酸二氢钠分别溶于水或者两种以上混合溶于水，制得无机盐储液，并进行冷藏保存；
将D-葡萄糖、硫辛酸、酚红、丙酮酸钠、酵母蛋白水解物、亚硒酸钠、转铁蛋白、腐胺二盐酸、血蓝蛋白、还原型谷胱甘肽、抗坏血酸磷酸酯、氢化可的松、层黏连蛋白、玻连蛋白、聚-L-赖氨酸、地塞米松、甲状腺激素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、甘油三脂、磷脂、胆固醇和乙醇胺分别溶于水或者两种以上混合溶于水，制得微量元素储液，并进行冷藏保存；
将胰岛素溶于质量百分浓度为1％的冰乙酸溶液中；制得胰岛素储液，并进行冷藏保存；
上述原料在各自储液中的浓度(mg/L)如下：
(2)将适量氯化钾、氯化钠、步骤(1)中制得的氨基酸储液、色氨酸和酪氨酸二钠盐储液、维生素储液、无机盐储液、微量元素储液和胰岛素储液加入超纯水中，然后再加入碳酸氢钠，混合溶解制得混合液，使用之前向混合液中加入经37℃水浴解冻的谷氨酰胺储液，制得无血清培养基，各原料在无血清培养基中的浓度(mg/L)如下：
各原料在无血清培养基中的浓度(mg/L)如下：
优选的，用0.1μm的过滤器对混合液和谷氨酰胺储液进行过滤除菌。
优选的，无血清培养基的储存温度为4℃。
优选的，步骤(1)中的冷冻温度为-20℃，冷藏温度为2～8℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、细胞增殖：本发明的无血清培养基细胞增殖正常、活力稳定，与含10％小牛血清成品培养基相比无显著差异；
2、蛋白含量低：本发明的无血清培养基蛋白含量明显低于常规培养基，简化了提取工艺、降低了生产成本；
3、质量稳定：由于本产品成分已知、无动物源蛋白，重复生产质量稳定。
4、本发明适用范围广泛，可适用于Vero、BHK-21、A549、CHO等多种常用细胞系，且从常规血清培养基过渡简单，适应性快；
5、细胞贴壁速度快，以Vero细胞为例，采用本品培养6h，可贴壁90％以上；
6、本发明所有成分均已知，配置工艺简单、重现性较好。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
实施例一
本发明制备无血清培养基的步骤如下：
(1)制备储液：
将甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺一水、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐一水、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸分别溶于水或者两种以上混合溶于水，制得氨基酸储液，并进行冷冻保存；
将L-谷氨酰胺溶于水，制得谷氨酰胺储液，并进行冷冻保存；
将L-色氨酸和L-酪氨酸二钠盐分别或者混合溶解在0.1mol/L的盐酸中，制得色氨酸和酪氨酸二钠盐储液，并进行冷冻保存；
将抗坏血酸、生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、尼克酰胺、盐酸吡哆素、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12和肌醇分别溶于水或者两种以上混合溶于水，制得维生素储液，并进行冷藏保存；
将氯化钙、硫酸镁和一水磷酸二氢钠分别溶于水或者两种以上混合溶于水，制得无机盐储液，并进行冷藏保存；
将D-葡萄糖、硫辛酸、酚红、丙酮酸钠、酵母蛋白水解物、亚硒酸钠、转铁蛋白、腐胺二盐酸、血蓝蛋白、还原型谷胱甘肽、抗坏血酸磷酸酯、氢化可的松、层黏连蛋白、玻连蛋白、聚-L-赖氨酸、地塞米松、甲状腺激素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、甘油三脂、磷脂、胆固醇和乙醇胺分别溶于水或者两种以上混合溶于水，制得微量元素储液，并进行冷藏保存；
将胰岛素溶于质量百分浓度为1％的冰乙酸溶液中；制得胰岛素储液，并进行冷藏保存；
上述原料在各自储液中的浓度(mg/L)如下：
冷冻保存的温度为-20℃，冷藏保存的温度为2℃；
(2)将适量氯化钾、氯化钠、步骤(1)中制得的氨基酸储液、色氨酸和酪氨酸二钠盐储液、维生素储液、无机盐储液、微量元素储液和胰岛素储液加入超纯水中，然后再加入碳酸氢钠，混合溶解制得混合液，并用0.1μm的过滤器进行过滤除菌，用37℃水浴解冻的方法对谷氨酰胺储液解冻，然后用0.1μm的过滤器进行过滤除菌；
使用之前向混合液中加入经上述处理的谷氨酰胺储液，制得无血清培养基，各原料在无血清培养基中的浓度(mg/L)如下：
该无血清培养基的储存温度为4℃。
实施例二
本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤(1)中上述原料在各自储液中的浓度(mg/L)如下：
冷藏保存的温度为6℃；
步骤(2)中各原料在无血清培养基中的浓度(mg/L)如下：
实施例三
本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤(1)中上述原料在各自储液中的浓度(mg/L)如下：
冷藏保存的温度为8℃；
步骤(2)中各原料在无血清培养基中的浓度(mg/L)如下：
以Vero细胞为例，进行了对比试验，试验是在温度为37℃的环境中进行培养3天，CO2的通入量5.0％。其中，对比例一中所用培养基为MEM培养基+10％小牛血清，对比例二中所用培养基为F12培养基+10％小牛血清，实验数据如下：
从上述试验数据可以看出本发明的无血清培养基在细胞培育方面的主要性能完全不逊色于有血清的培养基，甚至还要优异些，完全能够满足细胞培育的需求。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以组合、变更或改型均为本发明的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。