本实用新型属于试剂盒技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞分离和扩增试剂盒。
背景技术：
间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。脐带间充质干细胞是指存在于脐带组织中的一种多功能干细胞，具有细胞含量高、增殖能力强，免疫原性低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点。
目前获得MSC的方法主要是组织贴壁法和酶消化法，组织贴壁法具有成本低，可更好保留细胞活性的优点而广泛被采用。但目前采用培养瓶通过组织贴壁法获得原代MSC数量较低，因为MSC从脐带组织中游离出来的时间不统一，若使用培养瓶原代培养，导致在收集已游离出来的MSC时，未游离出细胞的大量组织块一起被抛弃而造成MSC总的数量获得量低。
技术实现要素：
本实用新型提出一种脐带间充质干细胞分离和扩增试剂盒，该试剂盒克服了目前组织贴壁法获得脐带间充质干细胞数量低的缺点。
本实用新型的技术方案是这样实现的：
一种脐带间充质干细胞分离和扩增试剂盒，包括盒体与盒盖，所述盒体内设置有细胞培养液存储元件、细胞洗涤液存储元件、细胞消化液存储元件、脐带洗涤液存储元件、脐带采集保存液存储元件、细胞存储元件与细胞冻存液存储元件，所述细胞培养液存储元件位于所述盒体的右侧，所述细胞洗涤液存储元件、细胞消化液存储元件、脐带洗涤液存储元件、脐带采集保存液存储元件、细胞存储元件与细胞冻存液存储元件均位于所述盒体的左侧，所述细胞消化液存储元件位于所述细胞洗涤液存储元件上方，所述脐带洗涤液存储元件、脐带采集保存液存储元件、细胞存储元件与细胞冻存液存储元件均位于所述细胞消化液存储元件上方，所述细胞冻存液存储元件与所述细胞培养液存储元件相邻，所述细胞存储元件位于所述脐带采集保存液存储元件与所述细胞冻存液存储元件之间，所述脐带洗涤液存储元件位于所述脐带采集保存液存储元件与所述细胞消化液存储元件之间；所述细胞存储元件包括细胞培养板放置槽与6孔细胞培养板，所述6孔细胞培养板设置在所述细胞培养板放置槽内。
进一步，所述细胞培养液存储元件包括细胞培养液放置槽与细胞培养液套装，所述细胞培养液套装放置在所述细胞培养液放置槽内。细胞培养液套装含低糖DMEM培养液450ml/套、胎牛血清50ml/套、250ng/ml bFGF和250ng/ml EGF混合液10ml/套。
进一步，所述细胞洗涤液存储元件包括细胞洗涤液放置槽与细胞洗液瓶，所述细胞洗涤液瓶放置在所述细胞洗涤液放置槽内。
进一步，所述细胞消化液存储元件包括细胞消化液放置槽与细胞消化液瓶，所述细胞消化液瓶放置在所述细胞消化液放置槽内。
进一步，所述脐带洗涤液存储元件包括脐带洗涤液放置槽与脐带洗涤液瓶，所述脐带洗涤液瓶放置在所述脐带洗涤液放置槽内。
进一步，所述脐带采集保存液存储元件包括脐带采集保存液放置槽与脐带采集保存液瓶，所述脐带采集保存液瓶放置在所述脐带采集保存液放置槽内。
进一步，所述细胞冻存液存储元件包括细胞冻存液放置槽与细胞冻存液瓶，所述细胞冻存液瓶放置在所述细胞冻存液放置槽内。
本实用新型的有益效果：
本实用新型的脐带间充质干细胞分离和扩增试剂盒采用6孔细胞培养板，由于脐带组织块分格贴壁，可根据细胞游出时间先后，分批收集原代细胞进行传代，最大限度使所有组织块游离出间充质干细胞，大大提高从每根脐带获得间充质干细胞的数量，且最终收获冻存的细胞不仅数量大，而且纯度很高，流式细胞仪检测结果CD73、CD90、CD105分别都高于99％，CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR分别都低于1％，各批次细胞质量保持稳定。组织贴壁法从人脐带中分离MSC并进行传代培养，最终大量获得MSC产品的试剂盒，克服了目前组织贴壁法获得脐带间充质干细胞数量低的缺点。
附图说明
为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本实用新型脐带间充质干细胞分离和扩增试剂盒的结构示意图。
附图标示：1、盒体，2、脐带采集保存液放置槽，3、脐带洗涤液放置槽，4、细胞培养板放置槽，5、细胞冻存液放置槽，6、细胞消化液放置槽，7、细胞洗涤液放置槽，8、细胞培养液放置槽，9、脐带采集保存液瓶，10、脐带洗涤液瓶，11、6孔细胞培养板，12、细胞冻存液瓶，13、细胞消化液瓶，14、细胞洗涤液瓶，15、细胞培养液套装。
具体实施方式
下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
参照图1，一种脐带间充质干细胞分离和扩增试剂盒，包括盒体与盒盖，盒体1内设置有细胞培养液存储元件、细胞洗涤液存储元件、细胞消化液存储元件、脐带洗涤液存储元件、脐带采集保存液存储元件、细胞存储元件与细胞冻存液存储元件。细胞培养液存储元件位于盒体的右侧，细胞洗涤液存储元件、细胞消化液存储元件、脐带洗涤液存储元件、脐带采集保存液存储元件、细胞存储元件与细胞冻存液存储元件均位于盒体的左侧。细胞消化液存储元件位于细胞洗涤液存储元件上方。脐带洗涤液存储元件、脐带采集保存液存储元件、细胞存储元件与细胞冻存液存储元件均位于细胞消化液存储元件上方。细胞冻存液存储元件与细胞培养液存储元件相邻。细胞存储元件位于脐带采集保存液存储元件与细胞冻存液存储元件之间。脐带洗涤液存储元件位于脐带采集保存液存储元件与细胞消化液存储元件之间。细胞存储元件包括细胞培养板放置槽4与6孔细胞培养板11，6孔细胞培养板11设置在细胞培养板放置槽4内。
本实施例中，细胞培养液存储元件包括细胞培养液放置槽8与细胞培养液套装15，细胞培养液套装15放置在细胞培养液放置槽8内。细胞培养液套装15含低糖DMEM培养液450ml/套、胎牛血清50ml/套、250ng/ml bFGF和250ng/ml EGF混合液10ml/套。细胞洗涤液存储元件包括细胞洗涤液放置槽7与细胞洗液瓶14，细胞洗涤液瓶14放置在细胞洗涤液放置槽7内。细胞消化液存储元件包括细胞消化液放置槽6与细胞消化液瓶13，细胞消化液瓶13放置在细胞消化液放置槽6内。脐带洗涤液存储元件包括脐带洗涤液放置槽3与脐带洗涤液瓶10，脐带洗涤液瓶10放置在脐带洗涤液放置槽3内。脐带采集保存液存储元件包括脐带采集保存液放置槽2与脐带采集保存液瓶9，脐带采集保存液瓶9放置在脐带采集保存液放置槽2内。细胞冻存液存储元件包括细胞冻存液放置槽5与细胞冻存液瓶12，细胞冻存液瓶12放置在细胞冻存液放置槽5内。
本实施例中，脐带采集保存液瓶9规格为100ml/瓶，共计1瓶。脐带洗涤液瓶10规格为1000ml/瓶，共计1瓶。6孔细胞培养板11共计5个。细胞冻存液瓶12规格为500ml/瓶，共计3瓶。细胞消化液瓶13规格为50ml/瓶，共计5瓶。细胞洗涤液瓶14规格为1000ml/瓶，共计5瓶。细胞培养液套装15共计10套。
试剂盒的配制步骤及用于脐带间充质干细胞的分离与扩增流程
一、试剂盒的配制
1)脐带采集保存液配制及装瓶：将青霉素、链霉素加入生理盐水，终浓度分别是200单位/ml和200μg/ml，0.22μm过滤除菌，分装到无菌密封瓶，每瓶100ml，贴上标签。
2)脐带洗涤液配制及装瓶：将青霉素、链霉素加入生理盐水，终浓度分别是200单位/ml和200μg/ml，0.22μm过滤除菌，分装到无菌密封瓶，每瓶500ml，贴上标签。
3)细胞洗涤液为无菌生理盐水，装入无菌密封瓶，贴上标签。
4)细胞消化液配制及装瓶：称取胰蛋白酶粉末溶于生理盐水，胰蛋白酶终浓度是0.25％，0.22μm过滤除菌，分装，每瓶50ml，贴上标签。
5)间充质干细胞培养液配制：低糖DMEM细胞培养液每瓶450ml、胎牛血清每支50ml、浓度为250ng/ml bFGF和250ng/ml EGF混合液每支10m，分别-20℃保存，使用前4℃过夜解冻，然后将三种成分混匀。
6)细胞冻存液配制：将细胞培养液、FBS、DMSO按1:3:1比例混合，轻轻混匀，分装，贴标签
该试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：脐带采集保存液1瓶(100ml/瓶)，脐带洗涤液1瓶(1000ml/瓶)，细胞消化液5瓶(50ml/瓶)，细胞洗涤液5瓶(1000ml/瓶)，细胞培养液10套(含低糖DMEM培养液450ml/套、胎牛血清50ml/套、250ng/ml bFGF和250ng/ml EGF混合液10ml/套)，细胞冻存液3瓶(500ml/瓶)，6孔细胞培养板5个。按照上述试剂量对试剂盒中各组分进行分装，包装得到用于制备脐带间充质干细胞的试剂盒。试剂盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱内解冻之后4℃保存，一个月内用完。
二、脐带间充质干细胞的制备
1)脐带采集与运输：取新生儿脐带，保存于脐带采集保存液中，24h内送至实验室。
2)洗涤脐带：于超净工作台中取出脐带，放入15cm无菌玻璃培养皿清洗脐带3次，以去除血渍。
3)将脐带剪成长约1cm的小段，剥去外膜，血管，得到华氏胶，用剪刀将Wharton胶剪成约1mm3大小。
4)将剪碎Wharton胶转移到6孔细胞培养板里，用镊子将其铺匀，放培养箱里，约3小时后，待组织块牢固贴在6孔细胞培养板以后，加入少量的间充质干细胞培养液，刚好没过组织块。
5)连续两三天都要观察培养基的颜色，初步判断有无污染，保持六孔板绝对静止，切不可移动。
6)第7天左右，显微镜下观察，会有细胞从组织块周围游离出来，待有大量细胞游离出以后，吸掉游离出细胞的组织块。从有细胞开始爬出时开始，隔天半量换液一次。
7)第11天左右，早先游离出细胞的孔中会出现很多细胞集落，而且密度已较高，可准备传代；剩余未游离出细胞或者少量游离出细胞的孔可继续培养，待有大量细胞游离出来并出现较多细胞集落时再传代。通过分批传代，可使绝大多数贴壁的脐带Wharton胶组织块都游离出细胞，显著提高每根脐带的细胞获得量。
8)细胞传代
①吸掉细胞培养液，用细胞清洗液清洗6孔细胞培养板/培养瓶一次，加入细胞消化液，显微镜下观察，待大部分细胞变圆时，用培养液终止消化；
②用滴管轻轻吹打培养瓶/6孔细胞培养板，将液体转移到离心管，1000rpm，离心7min，倒去上清。
③加入细胞培养液重悬细胞，传入T75培养瓶，每瓶约5×105个细胞，15ml培养液(若使用T175细胞培养瓶，细胞数及培养液按相应量增加)，隔天换液，待细胞80％-90％融合时再次传代。
9)细胞的冻存
①收集细胞：用细胞消化液消化第3代细胞,，培养液终止消化，转移到离心管，计数，台盼蓝染色计算存活率，1000rpm离心7min，弃上清
②制成细胞冻存悬液：根据计数结果，加入适当体积的完全培养液重悬细胞，然后将细胞悬液和冻存液以1:1比例加在一起，细胞的终浓度在1～2×106个/ml，加冻存液时慢点，加一滴混匀后再加，以减少对细胞的刺激
③分装：将细胞冻存悬液分装到冻存管中，每管1ml
④逐步降温冻存细胞：4度30分钟→20度30分钟→液氮罐口30min→下放悬吊在罐中但不接触液面30min→液氮面30min→液氮中。
以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。