本发明涉及式i的化合物，
其中：
r选自h、me或cl。
r'选自：h、nh2、nhcoch3、nhcocf3或nhcoch2cl。
背景技术：
由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)引起的结核病(tb)是世界上主要的传染病。世界卫生组织(who)已经指出，每年有大约800万例新发病例被报告，并且由该病造成200万例死亡。此外，世界三分之一的人口具有潜伏的结核分枝杆菌感染，主要是在不发达国家中。
结核病控制基本上由用药物组合治疗诊断为患有tb的受试者组成，其中药物通常是被认为是一线药物的异烟肼(inh)、利福平(rmp)、吡嗪酰胺(pza)和乙胺丁醇(e)。
在巴西，据估计有超过5000万人感染了tb杆菌，而在里约热内卢州和亚马孙州，该病的发病率令人担忧，其中数字与印度和非洲国家的发病率相当。每年约有10万例新发病例以及5000至6000例由于该疾病造成的死亡被报告。
迫切需要开发用于tb治疗的新药，因为tb一线化疗由40多年前开发的药物组成。由于耐受多种化疗剂的菌株的出现，结合艾滋病毒共感染，1993年tb被who宣布为“全球紧急(emergênciaglobal)”。
异烟肼(inh)是一种分枝菌酸合成的前药抑制剂，它是用于tb治疗的首选药物，因为除了便宜以外，它还表现出与高抗分枝杆菌活性相关的较好耐受性。其活化在涉及形成相应酰基的过氧化氢依赖性过程中取决于结核分枝杆菌的过氧化氢酶-过氧化物酶(katg)，随后与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)反应，生成inh-nad加合物，其抑制参与到分枝菌酸合成的inha酶，其中分枝菌酸是杆菌细胞壁的组成成分。
两个方面对inh效力非常重要：生物利用度和亲脂性。化合物的亲油性的重要性与跨越杆菌的细胞壁的扩散现象相关。更多的亲脂性化合物通过脂质结构域表现出更大的扩散，从而增加药物的细胞内浓度。药物给药后不久，高生物利用度，特别是具有高峰浓度的高生物利用度提高了治疗效果且防止了inh耐药性的发展。
inh乙酰化过程对于通过nat酶突变具有更高nat酶活性的“快速乙酰化器(acetiladores)”类型的患者是很重要的，并且在这种情况下，inh的使用不是非常有效的，因为它被更快地转化为其低活性的代谢物(selkon,j.,fox,w.,gangadharam,p.,ramachandran,k.,ramakrishnan,c.,andveiu,s.,bull.w.h.o.,1961,25,779.)。此外，n-乙酰化作用可能与过表达nat酶的菌株中对inh的分枝杆菌耐药性有关(payton,m.,auty,r.,delgoda,r.,everett,m.,andsim,e.,j.bacteriol.,1999,181,1343.)。
现有技术“synthesisandantisecretoryandantiulcerogenicactivityofn-(2-acylaminophenyl)glyoxalyl-n'-acylhydrazinesandn-(2-benzoylaminophenyl)glyoxalylamides.catto,a.；cappeiletti,r.；leonardi,a.；tajana,a.；maggi,f.；nardi,d.；taddei,f,div.ric,recordatis.p.a.,milan,italy.farmaco,edizionescientifica(1983),38(1),45-56”记载了与i类似但不相同的式的新型酰肼化合物，但是其具有不同的制备方法。然而，这篇科学论文的作者没有评估化合物对抗结核分枝杆菌的作用，尤其是化合物ii，其结构最类似于i。值得注意的是，式i的化合物不能由ii产生，反之亦然。
在cattoa.等人的参考文献中所得的产物是化合物4
为了比较物质ii与本发明式i所含化合物的活性，合成了化合物4并测试其对抗结核分枝杆菌的作用。化合物4没有显示出好的活性且结果示于表1中并在实施例3和实施例4中描述。
因此，考虑到微生物对常规用于结核病治疗的药物特别是异烟肼(inh)的高水平耐药性，迫切需要开发可用于tb治疗的新药物。
技术实现要素：
本发明的主要目的是制造具有α-酮基酰基的新型异烟肼(inh)衍生物以促进对inh的保护以对抗n-乙酰化作用，以便获得在inh易感和耐药菌株中具有较高抗分枝杆菌潜力的物质。
本发明公开了式i的新型异烟肼(inh)衍生物，
其中：
本发明的目的是用于获得式i化合物的方法。
本发明的另一个目的涉及式i化合物在结核病治疗中的用途。
使用式i化合物的治疗方法也是本发明的目的。
在优选的实施方式中，获得式i化合物的方法包括以下：
(a)在乙腈和水的存在下，使5-取代的acillisatina与异烟肼在室温下搅拌反应16小时，然后真空过滤，用水和冰冷的乙腈进行洗涤并空气干燥；
(b)使相应的靛红(isatinas)与乙酸酐和硫酸在140℃下反应5分钟，然后真空过滤，并用活性炭、乙酸乙酯和己烷(1:1)重结晶。
(c)使氯乙酰氯与相应的靛红在回流温度下反应16小时，然后过滤。或
(d)在无水条件下且在氩氛下，在存在无水乙腈作为溶剂的情况下，使苯基乙醛酸氯化物与异烟肼在室温下反应16小时，然后过滤并用水和冰冷的乙腈进行洗涤。
在本发明的方法中，最终反应步骤的溶剂选自水和乙腈或二噁烷或四氢呋喃或其它极性质子惰性溶剂。
具体实施方式
现在将参考实施例描述本发明，这些实施例证实了式i包括的化合物的制备。然而，这些实施例不应被认为是限制本发明的范围。所有所得的式i化合物通过物理分析方法进行了充分表征。
实施例
有机合成
式i化合物的合成由靛红及其5-取代的衍生物实现。靛红可以用相应的酸酐进行n-乙酰化，提供n-乙酰基靛红，其在水的存在下在不同条件下与异烟肼在乙腈中反应，以得到如下面方案1概述的最终感兴趣的衍生物[a.nardi,d.；tajana,a.；portioli,f.；bolona,g.farmaco,edizionescientifica,37(12),815-23；1982/b.boeghat,n.；kover,w.b.；bastos,m.m.；pinto,a.c.；maciel,lc.；mayer,l.m.u.；silva,f.q.；sa,p.m.；
抗分枝杆菌分析
对于抗微生物活性的分析，通过微孔板比色法，阿拉玛蓝检定，根据franzblau[s.g.franzblau,r.s.witzig,j.c.mclaughlin,p.torres,g.madico,a.hernandez,m.t.degnan,m.b.cook,v.k.quenzer,r.m.fergusonandr.h.gilman,j.clin.microbiol.1998,36,362]，对研究中的分子进行对抗结核分枝杆菌的抗微生物活性检测的初步测试。
然后，相对于菌株h37rvatcc27294(americantypeculturecollection,rockville,md)，在筛选中进行最小抑制浓度的测定，直至浓度为6.25μg/ml。再次测试在6.25μg/ml浓度显示抑制作用的本发明的化合物，用于测定能够抑制生长的最小浓度，franzblau[s.g..franzblau,r.s.witzig,j.c.mclaughlin,p.torres,g.madico,a.hernandez,m.t.degnan,m.b.cook,v.k.quenzer,r.m.fergusonandr.h.gilman,j.clin.microbiol.1998,36,362]。
通过比色法所选择的所有化合物通过自动化方法bactecmgit960-tb(bectondicksoncorporationusa)以最低浓度进行测试。
在七天孵育期后，通过补充有oadc(difco,detroit,mich.)的middlebrook肉汤稀释法7h9基，然后对middlebrook7h11琼脂培养基(difco,detroit,mich.)中的菌落进行计数来评估显示色素沉着的本发明的化合物，根据franzblau[s.g.franzblau,r.s.witzig,j.c.mclaughlin,p.torres,g.madico,a.hernandez,m.t.degnan,m.b.cook,v.k.quenzer,r.m.fergusonandr.h.gilman,j.clin.microbiol.1998,36,362]。
实施例1-1-乙酰基吲哚啉-2,3-二酮(化合物1)的合成
n-乙酰基吲哚啉-2,3-二酮可以由靛红与乙酸酐的n-乙酰化作用回流4小时而获得，从而以83％的产率提供该化合物1。优化的替代方法由以下构成：使靛红与5当量的乙酸酐和2滴浓硫酸反应5分钟从而以95％的产率产生化合物1。该化合物1通过与气相色谱联接的质谱(gc-ms)表征，呈现与其化学结构相容的碎裂谱。熔点与文献中所公开的熔点一致。
在与回流冷凝器联接的双管(bitubulado)烧瓶中，加入1g吲哚啉-2,3-二酮、5当量乙酸酐和2滴硫酸。将反应介质在磁力搅拌下保持回流5分钟。然后将烧瓶冷却至室温，并送入冷冻器(-20℃)12小时。将所得固体用水洗涤并使其空气干燥。该产物使用活性炭由乙酸乙酯：己烷(1:1)重结晶。将所得固体过滤并用冰冷的己烷进行洗涤。
所得质量：1,22g，产率：95％。
cg-em：m/z189(11％)，m/z146(100％)，m/z147(22％)，m/z90(34％)，m/z43(45％)。
测得熔点：141～143℃/文献：141℃。
实施例2-n-(2-(2-(2-异烟酰基肼)-2-氧乙酰基)苯基)乙酰胺(化合物2)的合成
该衍生物化合物2是通过将化合物1与异烟肼在乙腈和水中在室温下反应16小时而合成的，产率68％(方案2)。
将500mg1-乙酰基吲哚啉-2,3-二酮(2.6mmol)、15ml乙腈、10ml蒸馏水和397mg(1.1当量)异烟肼加入到烧瓶中。将反应介质在室温下保持搅拌16小时。将所得悬浮液真空过滤，且将固体用10ml冰冷的乙腈洗涤3次，然后用蒸馏水进行洗涤，直至不再存在残留异烟肼(可通过薄层色谱中的紫外光检测)。将产物空气干燥，并在氩氛下储存在琥珀烧瓶中。
化合物2通过质谱(esi-ms(-))、1h和13c核磁共振、红外光谱和元素分析进行表征，已经提供了与其化学结构相容的实验数据。
化合物2的总产率为56％，分两个步骤，这使得该合成从工业观点和药物化学方面而言都相当有趣和可行。
所得质量：585mg/产率：68％。
esi-ms(-)：m/z325
1hnmr(dmsod6,400mhz,δ):2.17(s,3h),7.32(t,j＝7.7hz,1h),7.70(t,j＝7.7hz,1h),7.83(d,j＝5.2hz,2h),7.96(d,j＝7.7hz,1h),8.09(d,j＝7,7hz,1h),8.81(d,j＝5.2hz,2h),10.70(s,1h),11.01(s,2h)ppm。
13cnmr(dmsod6,100mhz,δ):24.42(s),121.16(s),121.39(s),121.93(s),123.37(s),132.62(s),135.29(s),139.08(s),139.50(s),150.58(s),163.50(s),164.07(s),169.20(s),191.53(s)ppm。
元素分析(chn)：
>实验：(％c)58.93、(％h)4.29、(％n)17.09
理论值：(％c)58.89、(％h)4.32、(％n)17.17
测得熔点：197～199℃。
方案2-获得化合物1的途径的反应
实施例3-1-苯甲酰吲哚啉-2,3-二酮(化合物3)的合成
该化合物由靛红与苯甲酰氯在乙腈中回流反应16小时获得，产率为94％(方案3)。
将500mg(0.0034mol)靛红、2当量蒸馏的苯甲酰氯、1ml三乙胺和20ml乙腈加入到烧瓶中。将介质在搅拌和回流条件下保持14小时。然后再加入2当量苯甲酰氯，并将反应介质在回流下保持另外4小时。将所得沉淀物过滤，并将溶解物浓缩一半，然后在干冰浴中用丙酮放置沉淀。将沉淀物用冰水进行洗涤并在高真空管线上干燥。
该化合物通过与气相色谱联接的质谱(gc-ms)进行表征，呈现与其化学结构相容的碎裂谱。熔点与文献中所公开的熔点一致。
所得质量：799mg/产率：94％。
cg-em：m/z251(17％)，m/z146(42％)，m/z105(100％)，m/z77(41％)，m/z90(11％)。
测得熔点：160～162℃/文献：158～160℃。
实施例4-n-(2-(2-(2-异烟酰基肼基-2-氧乙酰基)苯基)苯甲酰胺(化合物4)的合成
在文献研究中，只有一种与本专利申请中所提出的物质相似的物质(4)被识别，其由catto等人[catto,a.；cappelletti,r.；leonardi,a.；tajana,a.；maggi,f.；nardi,d.；taddei,f.farmacoedizionescientifica,1983,38,1,45.]得到。然而，在文献中，没有评估物质4的抗分枝杆菌活性，而是在大鼠中作为抗溃疡剂。因此，还合成了该物质4并评估了抗分枝杆菌活性，用于与本发明中所提出的序列化合物进行比较。
该物质由化合物3的杂环的开环与异烟肼在乙腈中在室温下合成8小时(方案3)。
向烧瓶中加入200mg(0.000796mol)1-苯甲酰基吲哚啉-2,3-二酮和15mlmecn，并将介质保持搅拌直到完全溶解。然后，加入1.1当量预先溶解在5ml水中的异烟肼。将反应介质在室温下保持搅拌8小时。将所得沉淀物真空过滤并用冰冷的mecn、冰冷的水进行洗涤并在高真空下干燥。
所得产率为56％(方案3)。物质4的总产率为53％，且通过质谱(esi-ms(-))和1h和13c核磁共振进行表征，数据与其结构一致。
所得质量：173mg/产率：56％。
esi-ms(-)：m/z325
1hnmr(dmsod6,400mhz,5):7.40(t,j＝7.5hz,1h),7.63(t,j＝7.3hz,2h),7.69(t,j＝7.2hz,1h),7.83(t,j＝6.5hz,3h),8.01(d,j＝7.1hz,2h),8.19(d,j＝7.0hz,1h),8.62(d,j＝8.3hz,1h),8.81(d,j＝5.3hz,2h),11.08(s,2h),11.71(s,1h)ppm。
13cnmr(dmsod6,100mhz,δ):120.18(s),120.87(s),121.34(s),123.44(s),127.23(s),129.01(s),132.43(s),133.80(s),134.02(s),136.35(s),138.92(s),140.74(s),150.52(s),163.75(s),164.08(s),165.22(s),193.36(s)。
测得熔点：209～211℃/文献：211～212℃。
方案3-获得衍生物4的途径的反应
实施例5-1-乙酰基-5-甲基吲哚啉-2,3-二酮(化合物5)的合成
将4g5-甲基吲哚啉-2,3-二酮化合物和15当量新鲜蒸馏的乙酸酐加入到与回流冷凝器联接的双管烧瓶中。将反应介质在磁力搅拌下保持回流4小时。然后将烧瓶冷却至室温，并送入冷冻器(-20℃)12小时。将所得固体用水进行洗涤并使其空气干燥。产物使用活性炭由乙酸乙酯：己烷(1:1)重结晶。将所得固体过滤并用冰冷的己烷进行洗涤。获得产物5，产率为89％，其中提供4.46g该产物。产物5通过质谱进行表征，得到与其结构相容的碎裂谱和熔点，这与文献中所公开的一致。
cg-em：m/z203(17％)，m/z161(52％)，m/z160(100％)，m/z133(21％)，m/z104(30％)，m/z43(27％)。
测得熔点：172～173℃/文献：173℃。
实施例6-n-(2-(2-(2-异烟酰基肼)-2-氧乙酰基)-4-甲基苯基)乙酰胺(化合物6)的合成
使用乙腈和水作为溶剂，由500mg化合物5与1.1当量异烟肼在室温搅拌下反应16小时而制备化合物6(方案4)。将所得固体真空过滤并用冰冷的乙腈和水进行洗涤，以63％的产率供应526mg化合物6。这通过质谱(esi-ms(-))和1h和13c核磁共振表征，数据与其结构一致。
esi-ms(-)：m/z339
1hnmr(dmsod6,400mhz,δ):2.14(s,3h),2.37(s,3h),7.52(dd,j＝8,4,1,6hz,1h),7.80(d,j＝1.2hz,1h),7.82(dd,j＝4.5,1.5hz,2h),8.00(d,j＝8.4hz,1h),8.00(d,j＝8.4hz,1h),8.80(dd,j＝4.5,1.4hz,2h),10.57(s,1h),10.96(s,2h)ppm。
13cnmr(dmsod6,100mhz,δ):20.20(s),24.33(s),121.23(s),121.37(s),121.86(s),132.51(s),132.65(s),135.83(s),137.21(s),139.10(s),150.53(s),163.59(s),164.13(s),168.97(s),191.67(s)ppm。
测得熔点：225～226℃。
方案4-获得衍生物6的途径的反应
实施例7-1-(2-氯乙酰基)吲哚啉-2,3-二酮(化合物7)的合成
使用5ml氯乙酰氯作为酰化剂和溶剂，由500mg靛红制备化合物7。将反应介质保持回流16小时，然后冷却至4℃。将形成的固体过滤并用己烷进行洗涤，得到705mg产物，产率为94％。产品7通过熔点和质谱进行表征，提供与文献及其结构一致的数据。
cg-em：m/z223(6％)，m/z197(9％)，m/z195(27％)，m/z147(11％)，m/z146(100％)。
测得熔点：210～211℃/文献：210～212℃。
实施例8-n-(2-(2-(2-异烟酰肼)-2-氧乙酰基)苯基)乙酰胺(化合物8)的合成
使用乙腈和水作为溶剂，由130mg化合物7与1.1当量异烟肼在室温搅拌下反应16小时而制备化合物8(方案5)。将所得固体真空过滤并用冰冷的乙腈和水进行洗涤，得到135mg化合物8，产率65％。这通过质谱(esi-ms(-))和1h和13c磁共振进行表征，数据与其结构一致。
esi-ms(-)：m/z359
1hnmr(dmsod6,400mhz,δ):11.41(s,1h),11.08(d,j＝31.9hz,2h),8.81(d,j＝5.8hz,2h),8.39(d,j＝8.4hz,1h),8.13(d,j＝7.2hz,1h),7.83(d,j＝5.9hz,2h),7.79(t,j＝7.9hz,1h),7.40(t,j＝7.6hz,1h),4.51(s,2h)。
13cnmr(dmsod6,100mhz,δ):192.71(s),165.81(s),164.11(s),163.82(s),150.54(s),139.42(s),138.92(s),136.14(s),133.53(s),124.02(s),121.33(s),120.87(s),120.70(s),43.37(s)。
测得熔点：274～275℃。
方案5-获得衍生物8的途径的反应
实施例9-抗分支杆菌评估
根据franzblau(flanzblau等人，1998)，通过微孔板比色稀释法，阿拉玛蓝检定，对研究中的分子进行对抗结核分枝杆菌的抗微生物活性检测的初步测试。相对于菌株h37rvatcc27294(americantypeculturecollection,rockville,md)，在筛选中进行最低抑制浓度的测定，直至达到3.12μg/ml的浓度。重新测试在3.12μg/ml的浓度证实抑制的化合物，以测定能够抑制生长的最低浓度。根据所有制造商的建议，通过自动化方法bactecmgit960-tb(bectondicksoncorporationusa)，在较低的浓度重新测试通过量热法评估的所有化合物。
评估物质2和4对抗对首选药物敏感的结核分枝杆菌菌株h37rvatcc27294(americantypeculturecollection,rockville,md)的抗分枝杆菌活性。
还对物质2用对异烟肼耐药的菌株进行了评估。使用利福平和异烟肼作为标准品。结果如表1所示。合成的inh(2)衍生物显示抗分枝杆菌活性优于结核病治疗中的所有首选药物。在对首选药物敏感的菌株中，它是异烟肼效力的两倍，是利福平的效力的三倍以上，是乙胺丁醇的效力的四十倍以上，并且几乎是吡嗪酰胺的活性的二千二百倍。此外，在对异烟肼耐药的菌株中，其是异烟肼的效力的大约四倍。还在本实验中评估了2-乙酰基异烟肼，如预期的那样，它不显示抗分枝杆菌活性。此外，化合物2是化合物4的效力的二十倍以上。
表1-抗分枝杆菌评估
实施例10-细胞毒性评估
化合物2的细胞毒性评估用j77-4谱系鼠巨噬细胞进行。该物质在任何评估浓度下，即使在该化合物的mic的约27万倍的高浓度下也未显示出细胞毒性。细胞毒性评估的结果列于表2。
表2-细胞毒性评估
lipinski五规则
当物质符合以下要求时，lipinski五规则提供了候选药物吸收和渗透性的潜力：分子量小于500da、高达10个氢键受体(hba)、高达5个氢键供体(hbd)和小于5的计算或实验辛醇-水分配系数(logpfclogp)(lipinski,c.a.；lombardo,f.；dominy,b.w.；feeney,p.j.adv.drugdeliv.,2001,46(1-3),3-26)。
式i的衍生物符合lipinski五规则的所有要求，这加强了其在抗结核药物领域的潜在用途。表3显示了本发明的式i化合物符合lipinski五规则的要求。
表3-式i化合物的lipinski五规则的数据。
如前述实施例的结果所示，本发明的衍生物2的实施例：
(a)是一种新物质，便宜且容易获得；
(b)在结核分枝杆菌的非耐药菌株中比所有用于tb治疗的首选药物具有更高的效力；
(c)是新物质4的效力的20倍以上；
(d)当对耐药菌株进行测试时，是异烟肼效力的4倍；
(e)在细胞毒性测试中未证明有毒，即使浓度是其mic的27万倍；且
(f)符合lipinski规则。