糖基化溶酶体蛋白、生产方法和用途与流程

本发明涉及植物中重组蛋白表达的领域，用于获得与哺乳动物表达系统相比的修饰糖基化。

背景

溶酶体贮积病(lsd)是一组危及生命的遗传性病症；大多数是由单一溶酶体酶或蛋白的缺乏引起的，这导致细胞中底物异常积累。目前，酶替代疗法(ert)是几种lsd唯一可用的具体治疗。在这些疾病中，通过静脉内输注缺失的酶，可以在许多靶组织中清除溶酶体贮积。传统上，在培养的哺乳动物细胞中产生用于ert的重组酶。例如，us6083725描述了来自人细胞的α-半乳糖苷酶。最近，作为替代方法，已经利用基于植物的表达系统来生产用于治疗用途的溶酶体酶(shaaltieletal.(2007)plantbiotechnolj5:579-590;duetal.(2008)jlipidres49:1646-1657;demarchisetal.(2011)plantbiotechnolj9:1061-1073;heetal.(2012)natcommun3:1062)。相对于基于哺乳动物细胞的系统，基于植物的系统具有若干优点，包括降低生产成本，消除被哺乳动物病原体污染的风险，和在藓类的情况下，相对更容易地操作n-糖基化途径。然而，用于ert的植物细胞产生的酶的主要问题是它们与哺乳动物细胞产生的酶不同的n-聚糖结构。特别地，在植物细胞中表达的溶酶体酶在没有进一步的人工磷酸化的情况下，通常不会在末端甘露糖残基上获得甘露糖-6-磷酸(m6p)修饰。糖链在ert中发挥关键作用。静脉内给予的溶酶体酶通过识别酶的糖结构的细胞表面受体被组织摄取。m6p受体(m6pr)和甘露糖受体(mr)代表了该摄取系统的两个主要贡献者。

大多数溶酶体酶携带m6p残基。通常认为，在用于大多数lsd的ert中，m6pr介导的内吞途径对于足够的酶递送是至关重要的(slyetal.(2006)procnatlacadsciusa103:15172-15177;sandsetal.(2001)jbiolchem276:43160-43165)。相反，mr存在于巨噬细胞上，认为其仅促进这些细胞中旨在酶替代的ert的治疗效果。

wo02/08404和wo2012/098537描述了烟草中各种溶酶体酶的产生。

wo03/073839描述了植物种子中溶酶体酶的产生，特别是在烟草植物的种子中。

us7011831描述了在昆虫细胞中产生具有复合n-聚糖糖基化的溶酶体酶。

wo2008/132743描述了使用具有er信号肽和液泡靶向信号的表达构建体在烟草中生产高甘露糖糖基化的溶酶体酶。

ep2789686a1描述了植物糖基化途径的修饰以产生哺乳动物型磷酸化聚糖。

us2006/040353描述了将β-半乳糖转移到n-连接的聚糖上。提出具有甘露糖-6-磷酸的糖蛋白用于治疗溶酶体疾病。

chiba等人从酵母酿酒酵母(s.cerevisiae)产生人α-gala(chibaetal.(2002)glycobiology12:821-828)。在这种情况下，m6p被末端甘露糖覆盖，并且通过细菌α-甘露糖苷酶去除甘露糖残基导致培养的成纤维细胞中酶的m6pr依赖性摄取改善。最近，在另一个基因操纵的酵母菌株中表达了α-gala，该菌株过表达了mnn4，一种甘露糖基磷酸转移酶的正调节子(tsukimuraetal.(2012)molmed18:76-82)。该α-gala制备物中磷酸化的n-聚糖含量高于半乳糖苷酶α(agalsidasealfa)(28.7％对15.3％)。将这种酶重复注射到法布里小鼠中导致心脏和肾脏gb3与注射半乳糖苷酶α的小鼠相似的降低。最近，kizhner等人报道了从烟草细胞培养物产生的人α-gala的纯化和表征(kizhneretal.(2015)molgenetmetab114(2):259–267)。作为其它植物制造的溶酶体酶，该agal是非磷酸化的。然而，该蛋白是化学交联和peg化的。这些修饰与蛋白特征的显著变化相关，包括与半乳糖苷酶α或β相比，增加的体外稳定性和显著延长的循环半衰期(约10小时)。该酶的摄取机制仍有待阐明。然而，显著缓慢的血浆清除表明摄取不是通过m6pr或mr介导的内吞作用。

us6887696描述了在高等植物烟草植物中表达两种溶酶体蛋白即α-葡糖脑苷脂酶和α-半乳糖苷酶的方法。烟草产生的溶酶体蛋白具有多样化的糖基化模式，具有大量复合n-聚糖，特别是gnmxf、mgnxf、gngnxf、gnmx和mgnx。

本发明的目的是提供用于生产溶酶体蛋白的替代来源，所述溶酶体蛋白作为用于治疗需要合适糖基化的溶酶体贮积病的治疗剂是有活性的。

技术实现要素：

本发明的目的通过本发明来解决，其基于令人惊讶的发现：i)溶酶体蛋白上的少甘露糖苷(paucimannosidic)糖基化赋予了治疗选项的适用性，以及ii)在苔藓植物表达系统中可以容易地获得这样的少甘露糖苷糖基化。

本发明提供一种制备溶酶体蛋白组合物的方法，包括在苔藓植物或细胞中表达编码溶酶体蛋白的转基因，其中所述溶酶体蛋白用n末端分泌信号表达，其中任选地在细胞内加工期间除去所述分泌信号，特别是其中溶酶体蛋白缺乏具有序列vdtm(seqidno：1)的c-末端液泡信号，和所述方法还包括从所述植物或细胞获得表达的溶酶体蛋白。本发明还提供可通过本发明的方法获得的溶酶体蛋白组合物。

本发明还提供一种溶酶体蛋白组合物，其包含根据糖基化模式潜在地多样化糖基化的多种溶酶体蛋白，其中所述糖基化模式具有至少45％的少甘露糖苷n-聚糖(摩尔％)。这样的蛋白组合物可以通过本发明的方法获得。

还提供了一种加工包含复合n-聚糖的溶酶体蛋白的方法，所述方法包括在样品中提供溶酶体蛋白，并将样品与苔藓植物hexo酶、优选hexo3酶接触，由此苔藓植物hexo酶切割来自溶酶体蛋白的末端glcnac残基，从而产生少甘露糖苷n-聚糖。hexo酶可以在细胞中，特别是植物细胞中。溶酶体蛋白可以作为药物或在药物组合物中提供。

本发明还提供了适于进行本发明方法的苔藓植物细胞或植物，其包含所述编码溶酶体蛋白的转基因。

本发明还涉及一种治疗溶酶体贮积病的方法，包括将本发明的溶酶体蛋白组合物给予需要治疗的患者。

所有这些方面是相互关联的，同样地形成本文呈现的整个发明的一部分，并且任何组合的本发明的优选实施例可以涉及这些方面中的任何一个，例如，在产生根据本发明待糖基化的任何溶酶体蛋白中，可以提供或使用通过给定构建体或方法转化的植物或细胞。关于任何实施方案或优选特征的以下详细描述同样涉及所有方面。例如，溶酶体蛋白的产物特征意味着选择该方法以产生具有其产物特征的该溶酶体蛋白。特定方法步骤的描述同样描述了通过该方法步骤修饰的蛋白。转化本发明的细胞以促进任何本发明的细胞中制备方法。所有溶酶体蛋白可用于本发明的使用溶酶体蛋白的(治疗或非治疗)方法。本发明在权利要求书中进一步定义。

具体实施方式

溶酶体贮积病(lsd)是一组由溶酶体功能缺陷引起的约50种罕见遗传性代谢病症。溶酶体负责消化包括几种关键酶的各种分子。如果这些酶之一由于突变而有缺陷，则大分子积聚在细胞内，最终杀死细胞。溶酶体贮积病症是由溶酶体功能障碍引起的，通常是脂质、糖蛋白或粘多糖代谢所需的单一酶缺乏的结果。

溶酶体贮积病的治疗主要是对症性的，其中酶替代疗法是最常见的。ert需要通过摄取途径将活性溶酶体蛋白给予细胞。

传统上，在培养的哺乳动物细胞中产生用于ert的重组酶。最近，作为替代方法，已经利用基于植物的表达系统来生产用于治疗用途的溶酶体酶。相对于基于哺乳动物细胞的系统，基于植物的系统具有若干优点，包括降低生产成本，消除被哺乳动物病原体污染的风险，和在藓类的情况下，相对更容易地操作n-糖基化途径。然而，在考虑使用植物细胞产生的酶用于ert时，一个主要问题是它们与哺乳动物细胞产生的酶不同的n-聚糖结构。特别地，在植物细胞中表达的溶酶体酶通常不会在末端甘露糖残基上获得甘露糖-6-磷酸(m6p)修饰。

本发明提供了一种在植物细胞，特别是苔藓植物细胞中产生转基因溶酶体蛋白的新方法，其令人惊讶地导致形成具有高度少甘露糖苷糖基化(即在分支的–man<(man)2结构中以少量、例如2个甘露糖残基终止的糖基化)的糖蛋白。这些结构已被证明对于摄取是非常有效的，特别是在受溶酶体贮积病影响的细胞中。这种改变的糖基化对于溶酶体蛋白是非天然的，但令人惊讶的是，改变的蛋白仍然是非常有效的治疗性蛋白。

本发明方法中使用的溶酶体蛋白是转基因，例如哺乳动物来源的转基因，用于该哺乳动物来源的ert。这些在苔藓植物中产生的转基因溶酶体蛋白可以用作治疗溶酶体贮积病的治疗性蛋白。因此，当给予时，溶酶体蛋白是活性酶，特别是在溶酶体中存在的条件下(例如约5的ph)具有活性。当然，当冻干时，无活性的贮存形式是可能的。本发明的少甘露糖苷糖基化基本上不干扰酶活性，而是介导溶酶体蛋白的摄取和稳定性。令人惊讶的是，本发明的溶酶体蛋白上的n-聚糖导致高效力，使其具有治疗用途，特别是用于治疗溶酶体贮积病。

本发明可以依赖于将转基因引入苔藓植物的已知方法。已经开发了用于生物技术开发苔藓植物以生产异源蛋白的合适转化系统。例如，已经通过使用粒子枪指导dna转移到原丝体组织中进行了成功的转化。peg介导的dna转移到藓类原生质体中也已经成功实现。对于小立碗藓(physcomitrellapatens)已多次描述peg介导的转化方法，并导致瞬时和稳定的转化体(k.reutterandr.reski,pl.tissuecultureandbiotech.,2,142-147(1996))。此外，通过peg-介导的苔藓植物转化方法也可以实现无标记的转化(stemmerc,kochaandgorrg(2004),moss2004,the7thannualmossinternationalconference,freiburg,germany)，并且可以用于随后引入多个核苷酸序列。

关于适用于本发明的苔藓植物的培养的详细信息，例如生物反应器中的薄囊藓(leptobryumpyriforme)和中位泥炭藓(sphagnummagellanicum)，在现有技术中是已知的(e.wilbert,"biotechnologicalstudiesconcerningthemasscultureofmosseswithparticularconsiderationofthearachidonicacidmetabolism",ph.d.thesis,universityofmainz(1991);h.rudolphands.rasmussen,crypt.bot.,3,67-73(1992))。为了本发明的目的，特别优选的是使用小立碗藓，因为在该生物体上实施分子生物学技术(r.reskibot.acta,111,pp.1-15(1998))。对于苔藓植物的培养，可以使用含(bauretal.(2005)plantbiotechnolj3,331-340)或不含补充物例如痕量元素的培养基(weiseetal.(2006)appl.microbiol.biotechnol.,70,337-345)。

制备溶酶体蛋白组合物的本发明方法优选包括在苔藓植物或细胞中表达编码溶酶体蛋白的转基因，其中所述溶酶体蛋白用n末端分泌信号表达，并且溶酶体蛋白缺乏具有序列vdtm(seqidno：1)的c-末端液泡信号。这将避免液泡靶向，这将导致溶酶体蛋白在液泡中贮积(与分泌相反)，并且可能导致在液泡中不同的糖加工，其中在一定程度上少甘露糖苷糖形仍然可能。在高尔基体中，没有液泡靶向，基于苔藓植物特异性重组蛋白相互作用，不同的糖基化途径令人惊讶地导致不依赖于液泡加工的大量的少甘露糖苷糖基化。这是非常令人惊讶的，因为在烟草中，分泌性非液泡途径导致主要复合的n-聚糖形成，而不是少甘露糖苷糖基化(us6887696)。显然，苔藓植物对溶酶体蛋白有独特的识别，导致这种修饰。

seqidno：1是c-末端植物液泡靶向信号，导致有效的液泡靶向。在一些实施方案中，可能存在其它液泡靶向信号，特别是非植物信号，导致效率较低的液泡靶向和避免液泡的分泌途径下游的某些表达。然而，在最优选的实施方案中，在表达期间或甚至在最终获得的产物中不存在液泡靶向信号。在从细胞中获得蛋白之后，也可人工去除液泡信号。

少甘露糖苷n-聚糖基于复合n-聚糖的修剪(trimming)。在高尔基体中，末端glcnac从复合聚糖中除去，留下末端甘露糖，在苔藓植物系统的情况下，这非常有效地将末端甘露糖留在(原复合)n-聚糖的两个分支上。

根据本发明，通常在氨基酸序列的n-末端使用分泌信号序列。n末端分泌信号也称为转运肽或er信号序列。它是编码和表达的氨基酸序列的一部分。分泌信号导致直接进入细胞er的表达，设定分泌途径(或如果存在液泡信号，则指定液泡)。分泌信号通常在表达过程中从蛋白氨基酸序列中内在地去除。这是植物细胞中的自然过程。为了允许转基因表达产物的适当定位，可以修饰溶酶体蛋白的基因以允许在植物细胞中定位。优选地，杂合核酸序列用于构建体中用于植物或植物细胞的转化。例如哺乳动物酶的定位相关结构域被植物序列替代以实现正确的定位和细胞转运，例如在植物中的er和/或高尔基体中。植物分泌信号的一个实例是seqidno：5，但可以使用任何其它植物分泌信号。它可能是使用的苔藓植物物种的内源序列，或它也可能是外源植物序列，但优选仍然是苔藓植物序列。

本发明的方法包括没有植物(苔藓植物)液泡信号的溶酶体蛋白的表达，所述信号具有序列vdtm(seqidno：1)。这导致从er到高尔基体的表达途径，最终导致分泌，避免了液泡中的最终定位。在苔藓植物中，分泌物可以直接进入培养基。在其它植物中，它可能进入植物细胞的质外体区室。令人惊讶的是，即使没有液泡放置，也可以通过本发明的方法实现高度的少甘露糖苷糖基化。

作为最终步骤，然后获得来自所述植物或细胞的表达的溶酶体蛋白。为此，可以从提取过程中从细胞收集溶酶体蛋白，该过程可能是破坏性的或非破坏性的。优选地，表达的溶酶体蛋白是从植物或细胞的分泌物质获得的，例如从培养基，优选不破坏生产细胞或植物。然后可以纯化获得的溶酶体蛋白，例如至至少80％(m/v)，优选至少90％(m/v)，特别优选至少95％(m/v)，或至少98％(m/v)或至少99％(m/v)。

优选苔藓植物或细胞是藓类，优选小立碗藓植物或细胞。苔藓植物可以是任何苔藓植物，但优选选自藓类、苔类和金鱼藻，特别优选藓纲(bryopsida)或以下属：小立碗藓属(physcomitrella)、葫芦藓属(funaria)、泥炭藓属(sphagnum)、角齿藓属(ceratodon)、地钱属(marchantia)和囊果苔属(sphaerocarpos)。小立碗藓是一种特别优选的系统，因为它具有高的同源重组率。

本发明的主题是植物和植物细胞。本文所用的“植物细胞”可以指分离的细胞，单一化细胞，也可以是植物组织中的细胞或植物组织的细胞，优选选自愈伤组织、原丝体、韧皮部、木质部、叶肉、树干、叶、叶状体、绿丝体、轴丝体、假根或配子托的组织，或植物生物体中的细胞。细胞可以是原生质体细胞。在优选的实施方案中，分离的植物细胞或甚至植物组织根据本发明转化，然后生长成植物或植物组织，或保持植物细胞培养物，例如悬浮培养物，例如生物反应器(hohe&reski,plantcell,tissueandorganculture81,2005:307-311)。

优选地，溶酶体蛋白还缺乏具有序列kdel(seqidno：2)的c末端er滞留信号。er滞留信号使得滞留在er或高尔基系统中。这可对所表达蛋白中观察到的糖基化模式产生深远的影响，因为糖基化是一种竞争过程，其中几种糖基化酶争夺待修饰的底物蛋白。尽管可以预期这种少甘露糖苷修剪将从er滞留中受益，但令人惊讶的是，本发明的溶酶体蛋白在没有这种(或任何)er滞留信号的情况下表达有大量的少甘露糖苷n-聚糖。

seqidno：2是导致高效er或高尔基体滞留的c-末端er滞留信号。另外，在一定程度上也负责er滞留的优选c末端二赖氨酸基序(kxkx)也缺失。在一些实施方案中，可存在其它er滞留信号，特别是非植物信号，导致er/高尔基体滞留效率较低，并且从区室间转向分泌的加工更快。然而，在最优选的实施方案中，在表达期间或甚至在最终获得的产物中都不存在er滞留信号。在从细胞获得蛋白之后也可以人为地去除er滞留信号。

对于本发明的任何实施方案特别优选的是，溶酶体蛋白缺乏植物c末端er滞留信号序列和植物c末端液泡信号序列，特别优选，其缺乏任何c末端er滞留信号序列和任何c-末端液泡信号序列。植物信号来自植物来源，并存在于植物中，特别是苔藓植物。它们在苔藓植物中起作用。如上所述，甚至对于本发明的苔藓植物表达系统中的高度少甘露糖苷糖基化，er滞留不是必需的，甚至也不需要液泡加工。

优选地，溶酶体蛋白包含在c末端以天然溶酶体蛋白或其截短的氨基酸终止的表达氨基酸序列。这意味着蛋白序列不存在添加。截短是可能的，即使不是优选的。当然，截短基本上不影响本发明的溶酶体蛋白的活性，这仍然是如上所述的要求。酶活性可以例如，在哺乳动物，特别是人细胞，例如在ph5的溶酶体条件下与天然溶酶体蛋白相比降低高达20％。截短可以是天然溶酶体蛋白的c-末端氨基酸至多50个、优选至多40个、至多30个、最多20个、至多10个、至多5个或1个的缺失，或者这些值之间的任何范围(例如1至10等)。对于例如描述于us6887696b2(通过引用并入本文)的截短，已知截短的α-半乳糖苷酶具有活性。

优选地，苔藓植物或细胞包含或不包含hexo3转基因。hexo3是一种在植物中天然存在的酶。其可以提供(或不)作为转基因以进一步增加hexo3活性。可以通过与溶酶体蛋白转基因掺入植物或细胞中相同的方法来促进转基因的引入，例如，通过基因组重组杂交或质粒引入。认为hexo3负责植物质膜内衬的质外体中的一些少甘露糖苷糖基化(liebmingeretal.,jbiolchem2011,286:10793-10802;boschetal.,currpharmdes.2013;19(31):5503-12)，然而，liebminger在拟南芥(arabidopsisthaliana)中发现的hexo活性不能解释苔藓植物中发现的高度少甘露糖苷糖基化。相关酶hexo1负责一些液泡的少甘露糖苷糖基化，并且hexo2似乎在拟南芥中几乎没有活性。在苔藓植物中可以有更高的活性或更好的可及性。

显然苔藓植物hexo在溶酶体蛋白上特别具有高度活性。因此，本发明提供了一种加工包含复合n-聚糖的溶酶体蛋白的体外方法，所述方法包括在样品中提供溶酶体蛋白，并使样品与苔藓植物hexo酶、优选hexo3酶接触，由此苔藓植物hexo酶切割来自溶酶体蛋白的末端glcnac残基，从而产生少甘露糖苷n-多糖。实质上，苔藓植物中存在的天然溶酶体蛋白糖基化途径也可以在苔藓植物细胞外进行，特别是在体外用分离的hexo酶进行，或者在另一个细胞，优选植物细胞中，用来自苔藓植物特别是藓类例如小立碗藓的活性hexo酶替代该植物。该植物可以是非苔藓植物，例如高等植物或苔藓植物，以增加hexo、优选hexo3基因载量，如上详述的。

优选苔藓植物或细胞抑制或消除α1,3-岩藻糖基转移酶和/或β1,2-木糖基转移酶。这样的植物酶可以至少在其天然活性的位点(例如高尔基体)中降低活性或浓度。优选去除的酶是如wo2004/057002中所述的α-1,3-岩藻糖基转移酶和/或β-1,2-木糖基转移酶。因此，根据优选的实施方案，所述植物细胞还具有降低的活性，优选完全丧失α-1,3-岩藻糖基转移酶和/或β-1,2-木糖基转移酶的功能，特别是通过敲除，特别优选通过中断所述植物的α-1,3-岩藻糖基转移酶和/或β-1,2-木糖基转移酶编码基因，优选通过重组表达的蛋白中的任一种的基因。此措施防止形成在哺乳动物例如人中可能是免疫原性的植物型糖基化。

还提供了适用于执行该方法的苔藓植物细胞或植物。所述细胞或植物包含如对于上述方法所述的编码溶酶体蛋白的转基因，和任选如上所述的任何其它修饰或转基因。

本发明还提供可通过本文所述的任何制备方法获得的溶酶体蛋白组合物。溶酶体蛋白可以具有如上所述的方法或优选变型实施方案实现的任何特征。溶酶体蛋白通常在多种这样的溶酶体蛋白中获得，在苔藓植物中观察到(转基因)溶酶体蛋白的本发明的溶酶体糖基化模式。

特别地，本发明提供了一种溶酶体蛋白组合物，其包含根据糖基化模式潜在地多样化糖基化的多种溶酶体蛋白，其中所述糖基化模式具有至少45％、优选至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％的少甘露糖苷n-聚糖。

本文给出的所有百分比值均为摩尔百分比，除非另有说明。

多种涉及本发明的蛋白的制备，所述蛋白包含，即不是个体化蛋白，而是从细胞或植物获得的这种蛋白的宏观制备物，其在表达时包含多于一种溶酶体蛋白。该制备物可以具有至少1000个蛋白分子，特别优选至少100000个分子或至少1百万个分子。

优选地，由本发明方法或在本发明方法中产生或使用的组合物的溶酶体蛋白是选自以下的任何一种：α-半乳糖苷酶，优选α-半乳糖苷酶a(gla)；β-葡糖神经酰胺酶，β-葡糖苷酶(葡糖脑苷脂酶)；α-甘露糖苷酶；天冬氨酰葡糖胺酶；β-甘露糖苷酶；酸性神经酰胺酶；α-岩藻糖苷酶；β-半乳糖苷酶，β-己糖胺酶激活物蛋白；半乳糖脑苷脂酶，半乳糖神经酰胺酶；溶酶体酸性脂肪酶(lal)；α-艾杜糖苷酸酶；艾杜糖苷酸-2-硫酸酯酶；葡糖胺-n-硫酸酯酶，硫酸乙酰肝素硫酸胺酶(sgsh)；α-n-乙酰葡糖胺酶(naglu)；(乙酰肝素)α-氨基葡糖苷-n-乙酰转移酶；n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶；β-半乳糖苷酶；n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶；β-葡糖苷酸酶；神经氨酸酶；鞘磷脂酶，鞘磷脂磷酸二酯酶；酸性α-1,4-葡糖苷酶；β-己糖胺酶或其α亚基；α-n-乙酰半乳糖胺酶(naga)，α-半乳糖胺酶；β-己糖胺酶a；半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶；透明质酸酶。在本发明的所有实施方案中特别优选的是α-半乳糖苷酶。优选的α-半乳糖苷酶是人α-半乳糖苷酶，例如可以从seqidno：4的核酸序列表达的seqidno：3的人α-半乳糖苷酶，或其截短的α-半乳糖苷酶。葡糖脑苷脂酶也是优选的，例如人葡糖脑苷脂酶，例如seqidno：6的人葡糖脑苷脂酶，其可以从seqidno：7的核酸序列表达。还优选的是α-葡糖苷酶，例如人α-葡糖苷酶，例如seqidno：8的人α-葡糖苷酶，其可以从seqidno：9的核酸序列表达。在其它实施方案中，葡糖脑苷脂酶和α-葡糖苷酶被排除在根据本发明的溶酶体蛋白组外。

优选地，溶酶体蛋白具有一个或多个包含式1结构的少甘露糖苷n-聚糖：

(式1)

其中正方形表示n-乙酰葡糖胺(glcnac)，圆表示甘露糖(man)，和具有t的圆表示末端甘露糖。本文中也称为“mm”聚糖的式1表示可以进一步修饰的核心结构-在少甘露糖苷n-聚糖中，只要t-甘露糖保持末端，即在糖链的非还原末端，该进一步修饰也是可能的。末端甘露糖可以被甲基化，特别是o-甲基化。常见的修饰是，其中一个或多个glcnac或man亚基可以是α1,3-岩藻糖基化的、α1,6-岩藻糖基化的和/或β1,2-木糖基化的。α1,3-岩藻糖基化和α1,6-岩藻糖基化通常存在于还原性glcnac。β1,2-木糖基化通常存在于非末端甘露糖(式1中没有t的圆)。根据本发明，由于在如上所述的制备过程中相应酶的抑制，优选地防止或降低α1,3-岩藻糖基化和/或β1,2-木糖基化。α1,6-岩藻糖基化可能存在或可能不存在。在植物中不常见，但可以通过在表达细胞或植物中引入α1,6-岩藻糖基转移酶来实现。优选至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的本发明组合物的溶酶体蛋白的n-聚糖包含式1的结构或由其组成(摩尔％)。

本发明的少甘露糖苷n-聚糖结构也可以由式(2)表示：

(式2)

式2还示出了糖亚基连接的类型。右侧的glcnac与溶酶体蛋白的氨基酸序列结合。通常用最右侧的还原性末端单糖残基和最左侧的非还原末端(如例如式2中所示)来绘制寡糖的还原性和非还原性末端。注意，还原性glcnac显示在本文给出的短式中的左侧，例如-glcnac2-man3。在n-聚糖中，还原性glcnac与溶酶体蛋白的氨基酸链中的天冬酰胺结合。这由左边的“-”表示，为与asn残基的键。在少甘露糖苷糖形中，存在两个非还原性甘露糖末端(在式2中左侧，在式1中上方)。

式(2)是大多数n-聚糖的共同核心，包括高甘露糖和复合n-聚糖(参见rayonetal.,jexp.botany,1998,49(326):1463-1472)。在少甘露糖苷结构的情况下，如式(2)所示的左侧上方和下方的man均为末端，而在高甘露糖和复合n-聚糖中，至少一个man含有与另一个man或glcnac的另外的键。该核心的α1,3-岩藻糖基化、α1,6-岩藻糖基化和/或β1,2-木糖基化是任选的。α1,3-岩藻糖基化和β1,2-木糖基化在植物中是常见的，除非相应的酶被抑制(例如，如wo2004/057002或coxetal.,naturebiotechnology24(12),2006:1591-7中所示)。

如果表达的溶酶体蛋白具有大量mgn聚糖(在一个末端man上一个另外的末端n-乙酰葡糖胺，如式2所示)或gg聚糖(在每个末端man上一个另外的末端n-乙酰葡糖胺，如式2所示)，这些mgn和gg聚糖可通过用β-n-乙酰葡糖胺酶处理而转化成式1或2的结构。β-n-乙酰葡糖胺酶处理可以用任何藓类生产的溶酶体蛋白进行，以增加少甘露糖苷聚糖。藓类表达的α-半乳糖苷酶a通常不需要β-n-乙酰葡糖胺酶，因为少甘露糖苷聚糖天然是高浓度的。根据培养条件，藓类产生的葡糖脑苷脂酶和α-葡糖苷酶有时可能需要β-n-乙酰葡糖胺酶处理。产生本发明的糖基化溶酶体蛋白的其它方法包括在昆虫或昆虫细胞中表达，例如sf9细胞，在糖工程酵母细胞中表达和用液泡靶向信号在藓类中表达(尽管不太优选，因为该信号在哺乳动物患者中可能是免疫原性的)。本文中“藓类生产的”或“苔藓植物产生的”溶酶体蛋白的任何描述涉及可通过在藓类中生产获得的产物，即具有如本文所述的高量的本发明的少甘露糖苷n-聚糖，而与实际的制备方法无关。可以选择任何制备方法来生产本发明的产品，并且“藓类生产的”或“苔藓植物生产的”也指用非藓类生产方法的这些产品。“藓类生产的”或“苔藓植物生产的”用于表示在藓类中发现的独特的糖基化模式，并且在本文中特别地定义，例如在本文产品权利要求和这些产品的描述中。

根据本发明方法的溶酶体蛋白的苔藓植物n-糖基化的独特特征是在本发明的n-聚糖中存在甲基化己糖(hex)，优选甲基化甘露糖(man)。这些甲基化的甘露糖，如果是末端，则不会干扰本发明的溶酶体蛋白的摄取，甚至可以增强摄取。优选地，本发明组合物的糖基化模式具有至少1％、更优选至少2％、至少3％或至少4％的式glcnac2-hex2-甲基-hex的n-聚糖，其中hex优选甘露糖(摩尔％)。根据本发明的方法，甲基化通常是甘露糖的氧的甲基化，特别是2-o-甲基化。这些是本发明组合物的溶酶体蛋白的优选甲基化。优选地，组合物的n-聚糖的至少1％、更优选至少2％、至少3％或至少4％具有甲基化，特别是o-，例如2-o-甲基化(摩尔％)。优选地，在这些甲基化n-聚糖中，至少两个末端(非还原性)甘露糖中只有一个被甲基化。

优选地，糖基化模式包含以下n-聚糖：

i)0%至35%，优选0.5%至30%，-glcnac2-(man2甲基-hex);

ii)30%至80%，优选40%至70%，特别优选45%至60%，-glcnac2-man3;

iii)0%至30%，优选4%至22%，-glcnac2-man3-glcnac;

iv)0%至15%，优选2%至12%，-glcnac2-man3-glcnac2;

v)0%至5%，优选0%至3%，-glcnac2-man3-hex2;

vi)0%至11%，优选1%至8%，-glcnac2-man3-hex3;

vii)0%至10%，优选1%至7%，-glcnac2-man3-hex4;

viii)0%至10%，优选1%至7%，-glcnac2-man3-hex5;

其中所有这些化合物一起总计100％或小于100％，这是不言而喻的(全部％为摩尔％)。小于100％是可能的，因为可能存在上面列表未指定的其它n-聚糖。所述其它n-聚糖可以在0％至30％之间，优选在0.01％至20％之间，特别优选在0.1％至10％之间。指定的n-聚糖i)至viii)中的任何一种可以为至少0.01％而不是0％的量。glcnac是n-乙酰葡糖胺亚基，man是甘露糖亚基，hex是己糖亚基，甲基hex是甲基化的己糖亚基，优选是2-o甲基己糖。在该糖基化模式中，-glcnac2-(man2甲基-hex)和-glcnac2-man3一起总计至少45％(摩尔％)，即这些是促成该量的少甘露糖苷n-聚糖，如发明内容中提到的。特别优选的hex是上述n-聚糖i)至viii)中的任何一种的man。聚糖还原性末端的glcnac可以在上述n-聚糖i)至viii)中的任何一种中是岩藻糖基化的或不是岩藻糖基化的。在上述n-聚糖i)至viii)中的任何一种中，分支点的man是木糖基化的或不是木糖基化的。

在一个特别优选的实施方案中，上述i)至viii)中列出的所有n-聚糖都是前面段落中给出的优选量。

还优选的是，糖基化模式包含至少0.5％、至少1％、至少2％或至少3％的量的n-聚糖i)，-glcnac2-(man2甲基-hex)。特别优选为至多30％、至多25％、至多20％或至多15％的量。其量可以在0.5％至30％、1％至25％或2％至20％的范围内。

还优选的是，糖基化模式包含至少30％、至少40％、至少45％或至少50％的量的n-聚糖ii)，-glcnac2-man3。特别优选为至多80％、至多75％、至多70％或至多65％的量。其量可以在30％至80％、40％至70％或45％至60％的范围内。这是根据本发明的最重要的n-聚糖，并且可以在本发明的任何实施方案中以这些量存在。

还优选的是，糖基化模式包含至少0.5％、至少2％、至少4％或至少6％的量的n-聚糖iii)，-glcnac2-man3-glcnac。特别优选为至多30％、至多25％、至多20％或至多15％的量。其量可以在0.5％至30％、1％至25％或2％至20％的范围内。

还优选的是，糖基化模式包含至少0.2％、至少0.5％、至少1％或至少2％的量的n-聚糖iv)，-glcnac2-man3-glcnac2。特别优选为至多20％、至多15％、至多12％或至多10％的量。其量可以在0.5％至15％、1％至12.5％或2％至10％的范围内。

还优选的是，糖基化模式包含至少0.01％、至少0.05％、至少0.1％或至少0.5％的量的n-聚糖v)，-glcnac2-man3-hex2。特别优选为至多5％、至多4％、至多3％或至多2％的量。其量可以在0.1％至5％、0.2％至4％或0.5％至3％的范围内。

还优选的是，糖基化模式包含至少0.1％、至少0.2％、至少0.75％或至少1％的量的n-聚糖vi)，-glcnac2-man3-hex3。特别优选为至多11％、至多10％、至多8％或至多6％的量。其量可以在0.5％至11％、1％至10％或2％至9％的范围内。

还优选的是，糖基化模式包含至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％或至少0.4％的量的n-聚糖vii)，-glcnac2-man3-hex4。特别优选为至多10％、至多8％、至多6.5％或至多5％的量。其量可以在0.1％至10％、0.2％至8.5％或0.3％至7％的范围内。

还优选的是，糖基化模式包含至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％或至少0.4％的量的n-聚糖viii)，-glcnac2-man3-hex5。特别优选为至多10％、至多8％、至多6.5％或至多5％的量。其量可以在0.1％至10％、0.2％至8.5％或0.3％至7％的范围内。

本发明的溶酶体蛋白可以是任何来源，优选哺乳动物，特别是人或非人动物，例如啮齿动物、狗、猫、马、牛、骆驼、猪。

植物产生的糖蛋白，包括本发明的苔藓植物产生的溶酶体蛋白，通常不是甘露糖磷酸化的。亦根据本发明，n-聚糖可以是非甘露糖磷酸化的，特别是完全不磷酸化。磷酸化可以通过将磷酸化酶引入表达细胞或通过从细胞中分离蛋白后的磷酸化来人工进行。因此，根据本发明的溶酶体蛋白组合物包含非磷酸化或磷酸化的溶酶体蛋白。优选地，组合物的溶酶体蛋白的磷酸化n-聚糖的量低于20％，特别优选低于15％，低于10％，低于5％，低于2％，低于1％，或甚至低于0.5％，例如0％(摩尔％)。

本发明的溶酶体蛋白可以是peg化的或非peg化的。peg化可以改变给予患者时的溶解度、生物利用度和体内半衰期。鉴于与哺乳动物产生的溶酶体蛋白相比，由于较小的n-聚糖结构，本发明的少甘露糖苷糖基化的溶酶体蛋白的半衰期缩短，因此特别优选peg化来补偿该缺点。特别优选的是可逆的peg化，导致体内peg化的至少部分丧失，例如通过引入可水解的键，例如席夫碱，以便不干扰细胞摄取。同样作为减少细胞摄取干扰的措施，peg化可以是短peg链，例如具有4至1000个、优选8至100个或10至50个亚基的peg。代替peg，可以使用任何短的亲水性聚合物来增加半衰期，优选分子量小于100kda、小于10kda或小于1kda。peg优选具有2-200、优选3至100或4至50个乙二醇亚基。可以通过作为与peg分子间接连接的手段的连接部分将溶酶体蛋白peg化。或者，也可以直接连接。

优选地，本发明的溶酶体蛋白是非交联的。交联可干扰细胞摄取和稳定性，不太优选。优选将交联与peg化结合。例如，peg可以用作交联剂，特别是在具有至少两个用于结合蛋白的官能团的双官能或多官能peg的情况下，例如双-cooh-peg或双-nhs-peg。peg化可以掩盖导致干扰细胞摄取和稳定性的交联的负面方面。

交联可导致形成多聚体溶酶体蛋白，特别是优选的二聚体溶酶体蛋白，例如，对于α-半乳糖苷酶描述的是wo2011/107990(通过引用并入本文)。在交联蛋白中，至少两个溶酶体蛋白直接或通过连接部分间接连接。

交联和/或peg化可以通过连接部分进行。例如，连接部分任选是下述部分，其共价连接到溶酶体蛋白单体的侧链、n末端或c末端的部分或者与溶酶体蛋白单体的翻译后修饰相关的部分(例如，糖部分)，以及共价连接到另一种溶酶体蛋白单体的侧链、n-末端或c末端的部分或者与另一种溶酶体蛋白单体的翻译后修饰相关的部分(例如，糖部分)。示例性的这种连接部分在下文中详细描述。

或者，连接部分形成被连接的溶酶体蛋白单体的一部分(例如，溶酶体蛋白单体的侧链、n末端或c末端或者与溶酶体蛋白单体的翻译后修饰相关的部分(例如，糖部分)的一部分，其也是另一溶酶体蛋白单体的侧链、n末端或c末端或者与另一溶酶体蛋白单体的翻译后修饰相关的部分(例如，糖部分)的一部分)。因此，例如，连接部分可以是单体的侧链、n-末端、c-末端或与翻译后修饰相关的部分的官能团(例如胺)与另一单体的侧链、n末端、c末端或与另一单体的翻译后修饰相关的部分的互补官能团(例如羧基)之间的共价键(例如酰胺键)，其中这种共价键不存在于天然形式的α-半乳糖苷酶。还考虑了其它共价键，例如酯键(羟基和羧基之间)；硫酯键；醚键(两个羟基之间)；硫醚键；酸酐键(两个羧基之间)；硫代酰胺键；氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯键。任选地，连接部分没有二硫键。然而，在不形成单体之间的连接(例如，二硫键的裂解不会裂解单体之间的连接)的位置处包括二硫键的连接部分在本发明的该实施方案的范围内。没有二硫键的连接部分的潜在优点是它不易如二硫键一样受到温和还原条件的裂解。任选地，连接部分是非肽部分(例如，连接部分不由酰胺键、氨基酸、二肽、三肽、寡肽或多肽组成)。或者，连接部分可以是或可以包含肽部分(例如氨基酸、二肽、三肽、寡肽或多肽)。任选地，连接部分不仅仅是连接到其上的任何溶酶体蛋白单体的线性延伸(即，肽部分的n末端和c末端不是直接连接到任何溶酶体蛋白单体的c末端或n末端)。或者，通过将溶酶体蛋白单体的n末端与另一种溶酶体蛋白单体的c末端直接共价连接而形成连接部分，从而产生融合的多肽。这种多肽不是天然形式的α-半乳糖苷酶，尽管它可以包含基本上呈其天然形式的两种溶酶体蛋白单体。然而，本文所述的α-半乳糖苷酶单体的共价连接优选为除了n-末端与c-末端的直接连接以外的形式。连接部分优选为10至1000da、优选20至500da的小部分。

在交联和/或peg化中，连接部分可以包含一个或多个结合溶酶体蛋白的反应性基团。这样的反应性基团可以例如与硫醇基反应或与胺基反应形成酰胺键。如本文所用，短语“反应性基团”描述了能够经历通常导致键形成的化学反应的化学基团。根据本实施方案的键优选为共价键(例如，对于每个反应性基团)。导致键形成的化学反应包括例如亲核和亲电子取代、亲核和亲电子加成反应、烷基化、加成-消除反应、环加成反应、重排反应和涉及官能团的任何其它已知的有机反应，及其组合。反应性基团可以任选地包含非反应性部分(例如烷基)，其可以用于例如将反应性基团的反应性部分连接到本文所述的连接部分(例如聚(亚烷基二醇)或其类似物)。优选选择反应性基团以使其能够与溶酶体蛋白缀合。示例性的反应性基团包括但不限于羧酸基(例如-co2h)、硫醇基(-sh)、胺基(-nh2)、卤素、叠氮基(-n3)、异氰酸酯基(-nco)、异硫氰酸酯基(-n=c=s)、羟基(-oh)、羰基(例如醛)、马来酰亚胺基、硫酸基、磷酸基、磺酰基(例如甲磺酰基、甲苯磺酰基)等，以及活化基团例如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(例如nhs酯)、磺基-n-羟基琥珀酰亚胺、酸酐、酰卤(-c(=o)-卤素)等。在一些实施方案中，反应性基团包括离去基团，例如易亲核取代的离去基团(例如，卤素、硫酸基、磷酸基、羧酸基、n-羟基琥珀酰亚胺)。

本发明还提供作为药物的本发明的溶酶体蛋白或组合物。还提供了一种治疗溶酶体贮积病的方法，包括向患者例如哺乳动物给予溶酶体蛋白组合物。与此相关，本发明提供了用于治疗溶酶体贮积病的本发明的溶酶体蛋白。患者可以是哺乳动物，特别是人或非人动物，例如啮齿动物、狗、猫、马、牛、骆驼、猪。优选地，溶酶体蛋白来自与患者相同的物种，以防止对蛋白氨基酸链的免疫反应。

优选地，疾病和溶酶体蛋白选自下表：

给予的剂量优选为0.05-100mg/kg体重，优选为0.1-50mg/kg体重，特别优选为0.3-10mg/kg体重重量，例如0.3、1或3mg/kg体重。

由于溶酶体贮积病无法治愈，因此需要进行慢性治疗，以规律的间隔重复给予酶替代物。优选地，本发明的溶酶体蛋白以1至30天、优选2至25天、更优选3至23天、甚至4至22天、5至21天、6至20天、7至19天、8至18天、9至17天、10至16天或11至15天的间隔给予。特别优选14天的间隔。以这样的间隔进行给药使得细胞溶酶体中的酶活性稳定，抵抗蛋白清除。

溶酶体蛋白可以通过导致功能酶到达血管系统、特别是血流的任何途径给予。优选静脉内(i.v.)输注。其它给药途径包括腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)和皮下(s.c.)给药。i.p.、i.m.和s.c.给药途径可导致目标组织(例如心脏、肾脏、肝脏和脾脏)中溶酶体蛋白的分布减少，但仍然可以通过这些途径向这些组织给予足够量。这些非i.v.途径，特别是i.p.，i.m.和s.c.，受益于更好的患者接受性并且通常益处胜过减少的靶组织分布。此外，非i.v.给药的药代动力学特征是有益的，因为治疗酶在长时间内在患者血浆中可用。

在优选的实施方案中，用本发明的溶酶体蛋白(苔藓植物产生的)的本发明医学治疗与相同类型和定性酶活性的但在非植物(特别是哺乳动物或真菌)细胞中产生的溶酶体蛋白组合。非植物产生的溶酶体蛋白可具有磷酸化甘露糖用于甘露糖-6-磷酸受体(m6pr)识别和细胞摄取。而且，任何来源的具有(人工)磷酸化甘露糖的溶酶体蛋白可以与本发明的溶酶体蛋白组合使用。已经使用了这种磷酸化或非苔藓植物溶酶体蛋白，例如在适用于治疗法布里病的α-半乳糖苷酶的情况下，半乳糖苷酶α(replagal®)和半乳糖苷酶β(fabrazyme®)；适用于治疗戈谢病的alglucerase(ceredase®)、imiglucerase、velagluceraseα(vpriv)作为β-葡糖脑苷脂酶；适用于治疗庞贝病的alglucosidaseα(myozyme®)；适用于治疗亨特综合征(mps-ii)的溶酶体酶艾杜糖苷酸-2-硫酸酯酶idursulfase(elaprase®)。还可能的是组合使用的其它植物产生的溶酶体蛋白，例如葡糖脑苷脂酶taligluceraseα(elelyso®)。磷酸化和/或非苔藓植物溶酶体蛋白可以与少甘露糖苷溶酶体蛋白交联。交联的二聚体或多聚体优选进一步被peg化。这提高了稳定性、半衰期和摄取。

本发明的具有少甘露糖苷糖基化的溶酶体蛋白也可以与蛋白伴侣(chaperon)，特别是相同类型和定性酶活性的溶酶体蛋白的特异性或非特异性蛋白伴侣组合。溶酶体蛋白的药理学蛋白伴侣是例如1-deoxygalactonojirimycine(米加司他)。蛋白伴侣能够在溶酶体贮积病中修饰、重新建立功能障碍的内源性溶酶体蛋白的某些活性。内源性溶酶体蛋白可以是并且通常是磷酸化的溶酶体蛋白，并且可以补充本发明的少甘露糖苷溶酶体蛋白的受体相互作用-如上对于给予磷酸化或非苔藓植物蛋白的组合疗法所述。不限于特定疗法，伴侣蛋白似乎可以恢复或增加溶酶体蛋白的酶活性，其由于导致溶酶体贮积病的突变而具有受损的活性。特别优选的是，米加司他与本发明的少甘露糖苷α-半乳糖苷酶或苔藓植物产生的α-半乳糖苷酶组合使用和/或用于治疗法布里病。

与磷酸化或非苔藓植物溶酶体酶(特别是由于磷酸化而具有m6pr识别的酶)的组合补充了本发明酶的摄取活性，允许以更高的效率和更广泛的治疗应用范围到达所有治疗相关的细胞。

通过以下附图和实施例进一步说明本发明，而不限于本发明的这些实施方案。实施例的任何要素可与上述的本发明构思组合。

附图：

图1：用于溶酶体蛋白表达的线性表达盒(蛋白序列：gla)表达

图2：典型纯化α-gala的中间和最终结果(银染sds-page)

图3：从培养上清液纯化葡糖脑苷脂酶(考马斯染色的sds-page)

图4：从培养上清液中纯化α-葡糖苷酶。来自cona色谱的浓缩洗出液的考马斯染色的sds-page。a)藓类gaa洗出液与α-葡糖苷酶(myozyme)。b)藓类gaa洗出液与分子量标准品。

图5：酶的体外表征。(a)在sds-page中分离并用考马斯蓝染色的酶制剂。泳道1和2分别是藓类-agal和半乳糖苷酶α。泳道3和4是用pngasef消化的藓类-agal和半乳糖苷酶α。箭头号，消化后的α-gala酶；箭头，pngasef(36kda)。蛋白标准品和分子量显示在左边。(b)使用特异于人α-gala的多克隆抗体通过蛋白印迹检测藓类-agal和半乳糖苷酶α(每个1ng)。显示了来自3个独立实验的代表性数据。(c)使用人造底物4-mu-α-d-吡喃半乳糖苷测定的酶制剂的α-gala比活。通过bca测定法测定蛋白浓度。(d)在缓冲的人血浆中稀释并在37℃加热的酶的稳定性(数据是一式三份的平均值)。高甘露糖：高甘露糖agal；藓类-agal：来自藓类的α-半乳糖苷酶；agal-α：半乳糖苷酶α；agal-β：半乳糖苷酶β。

图6：体外摄取研究。(a)在存在或不存在5mmm6p或2mg/ml酵母甘露聚糖的情况下，用不同的酶过夜孵育后，法布里患者成纤维细胞(dmn96.125)的细胞内α-gala活性。(b)gb3免疫荧光染色显示未经治疗的法布里患者成纤维细胞中gb3的大量溶酶体积累(上图)，并且在用藓类-agal治疗的细胞中gb3显著降低(下图)。(c和d)在法布里患者的成纤维细胞和微血管内皮细胞imfe1中的mr表达。imfe1细胞通过蛋白印迹(c)和免疫荧光染色(d)确定为mr阳性，而成纤维细胞为mr阴性。(e)在存在或不存在5mmm6p或2mg/ml酵母甘露聚糖的情况下，用不同酶过夜孵育后imfe1细胞的细胞内α-gala活性。(f)imfe1细胞中不同酶的摄取速率。在指定的时间点收获细胞，并测量细胞内活性。***p<0.001，藓类-agal相对于高甘露糖agal或半乳糖苷酶α。(g)用不同酶制剂孵育3小时后imfe1细胞中内化α-gala的蛋白印迹分析。(h)不同酶与imfe1细胞的结合。在4℃孵育3小时后，通过酶测定法测定细胞表面结合的酶。虚线表示在该测定法中模拟治疗的imfe1细胞的活性水平(即背景水平)。*p<0.05，***p<0.001。图中的所有数据以平均值±sem表示(n=3-4)。

图7：血浆药代动力学。(a)通过酶活性分析的输注藓类-agal和半乳糖苷酶α的血浆清除率。(b)输注后10分钟血浆中α-gala的蛋白印迹。(c)输注后5分钟和10分钟时α-gala蛋白在血浆中的量；通过光密度法分析蛋白印迹条带的强度。(d)注射后10分钟血浆中α-gala蛋白量与酶活性的相关性。(a)和(c)中的数据表示为平均值±sem(n=4-5)。*p<0.05，**p<0.01。

图8：输注的酶的组织分布。将酶制剂注入法布里小鼠，注射后2小时测定肾脏、心脏、脾脏和肝脏中的α-gala活性。(a)器官的比活。数据以平均值±sem(n=5)表示。*p<0.05，**p<0.01。(b)计算全部器官的活性，数据以4个器官回收的总活性的%表示。(c)通过蛋白印迹检测的肾匀浆中的α-gala蛋白。箭头号，在藓类-agal注射的小鼠中特异性α-gala条带。在注射半乳糖苷酶α的小鼠中没有观察到可检测的特异性条带。箭头，其中半乳糖苷酶α条带可迁移到的近似位置(基于图2b、4b所示的发现)。

图9：输注藓类-agal和半乳糖苷酶α的细胞定位。通过免疫组织化学(n=2)测定心脏和肾脏中输注的酶的细胞分布。显示了代表性的照片。(a)心脏。星号表示具有免疫染色阳性细胞(最可能是内皮细胞)的血管，箭头号表示阳性血管周围细胞(大概是巨噬细胞)。(b)肾脏。箭头号表示免疫染色阳性管状上皮细胞。比例尺：25μm。原始放大倍数：400x。

图10：输注酶的组织动力学。将酶制剂注入法布里小鼠，注射后2、24、48和96小时测量肾脏(a)、心脏(b)、脾脏(c)和肝脏(d)中的α-gala活性。数据以平均值±sem表示(n=4-5)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图11：藓类-agal清除组织中积累的gb3的功效。在不同剂量的单次输注藓类-agal或半乳糖苷酶α后7天分析肾脏(a)、心脏(b)和肝脏(c)中的gb3含量。数据以平均值±sem表示(n=4-5)。*p<0.05，***p<0.001。显示在各半乳糖苷酶α注射组的顶部的统计学显著性表示半乳糖苷酶α和相同剂量的moss-agal之间的差异。

图12-14：i.p.(图12)、i.m.(图13)和s.c.(图14)给药的血浆和组织活性。

实施例：

实施例1：藓类中人α-半乳糖苷酶的制备

实施例1.1：表达品种构建

合成了编码不含天然信号序列(seqidno：3)的α-半乳糖苷酶a(α-gala)的人gla基因(ncbi参考序列：nm_000169.2)的dna序列作为密码子优化形式(seqidno：4)，并由geneart/thermofisherscientific(geneartag,regensburg,germany)亚克隆至藓类表达载体中。使用限制酶将含有α-gala表达构建体和新霉素抗性赋予基因(nptii)构建体的序列从质粒切割为线性表达盒(图1)。

为了生成稳定的产生α-gala的藓类细胞系，在其n-聚糖上没有植物特异性α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖残基的藓类双重敲除系的原生质体koprivovaetal.(2004)plantbiotechnol.j.2,517–523;weiseetal.(2007)plantbiotechnol.j.5(3),389-401;wo2004/057002)用纯化的表达盒在基于peg的转化方法中(streppetal.(1998)proc.natl.acad.sci.u.s.a.95,4368)转化。转化的藓类细胞经再生并针对抵抗抗生素g418的抗性进行选择。以连续两轮，针对每个生物量的总α-gala积累，筛选2000株抗性藓类植株，其中最佳品种成为标准生产品种。

线性化表达盒包含以下遗传元件：小立碗藓属肌动蛋白启动子(p肌动蛋白)和5'utr、植物信号肽(sp)、没有天然信号序列(gla)的人α-gal的cdna序列、小立碗藓属微管蛋白3'utr、花椰菜花叶病毒35s启动子(p35s)、新霉素磷酸转移酶基因(nptii)和花椰菜花叶病毒35s终止子(t35s)(图1)。植物信号肽含有序列mafykissvffifcfflialpfhsya(seqidno:5)。

表达品种是一种完全再生的藓类植物，其具有在藓类衍生的调节元件的遗传控制下稳定整合到其基因组中的agal-转基因。

实施例1.2：酶生产：

在放置在wave™reactorrocker(biowave20sps,wavebiotechag,switzerland)中的20l一次性袋中，将α-gala生产品种培养4周(27天)。培养参数为：25-30rpm摇摆速率,8°角,sm07-培养基(100mmnacl,6.6mmkcl,2.0mmmgso4x7h2o,1.8mmkh2po4,20.4mmca(no3)2x4h2o,0.05mmfena-edta,4.9mmmes,0.1%(w/v)peg4000,100.26µmh3bo3,0.11µmcocl2x6h2o,0.1µmcuso4x5h2o,5µmki,85.39µmmncl2x4h2o,1.03µmna2moo4x2h2o,0.11mmnicl2x6h2o,0.04µmna2seo3x5h2o,0.039µm乙酸锌x2h2o),25°c,0.3lxmin^-1加压空气，补充有2%-4%co2和以130-310µexm^-2xs^-1,24h光/天的光照，自配备有osramfq24w840ho,lumiluxcoolwhite的光面板递送。根据制造商的说明书，还向培养基补充了1000xnitsch维生素混合物(nitschvitaminmixture,duchefa,netherlands)。通过用0.5mh2so4和0.5mnaoh滴定，借助wavepodi(gehealthcare)与pump20(gehealthcare)组合，自动控制发酵ph在ph5-6。

培养结束后，培养液经过以下三步过滤级联，以提供无藓类、澄清的无菌滤液：1)在配备zetaplus(01spb3002,3m,germany)的定制pp过滤室(grosseetal.(2014)wo2014/013045a1)中通过滤饼过滤收获藓类，2)通过双层scale-upcapsule(e0340fsa60sp03a,3m,germany)深度过滤，和3)最终的无菌过滤步骤(milliporeexpresstmplus,0,22µm,millipore,germany)。

随后，使用切向流过滤(tff)(pallcentramate500s，30kda截止纤维素膜)浓缩无菌滤液并进行缓冲液交换。在一系列三个色谱步骤(butyl-650m，deae，s)后，分离的α-gala和高甘露糖α-gala分别浓缩至约0.5mg/ml，转移到制剂缓冲液中并进行表征。将酶保存在≤-65℃直至进一步使用。典型的纯化过程的结果如图2所示。

酶活性测定：

使用5mm4-甲基伞形酮基-α-d-吡喃半乳糖苷在ph4.4下，在0.1mn-乙酰半乳糖胺(α-半乳糖苷酶b的特异性抑制剂)存在下，通过荧光测定法测量α-gala活性。根据供应商说明书，使用bca蛋白测定试剂盒(pierce)测定蛋白浓度。活性表示为μmol/mg蛋白/小时。结果总结在图5c。

sds-page银染：

将样品在补充还原剂(invitrogen)的sds样品缓冲液中在95℃下变性5分钟。使用nupagebis-tris4-12％凝胶(invitrogen)进行蛋白分离。根据供应商手册，使用silverquest^tm染色试剂盒(invitrogen)进行银染。

宿主细胞蛋白(hcp)-elisa

为了定量纯化的α-gala中的剩余hcp水平，开发了一种新型hcpelisa(biogenesgmbh,germany)。简而言之，用相应野生型进行模拟发酵，收获培养基并浓缩。将浓缩的蛋白溶液用于兔的免疫。总igg用于产生用于hcp定量的夹心elisa。结果显示整个纯化过程中hcp的典型耗尽因数为10000。

实施例1.4：生产总结

藓类-agal的生产在安装在wave™-rocker上的10l一次性用完即可丢弃的袋中的光自养发酵过程中完成。在没有任何抗生素的情况下生长的藓类将藓类-agal分泌到纯矿物培养基中。培养袋的光照来自外部，平均光子通量为200μmol/m²s。达到其最终培养密度后，通过滤饼过滤从培养基中分离出藓类，培养基通过双层深度过滤系统和最终无菌过滤而澄清。通过切向流过滤将所得到的澄清培养基浓缩并再次缓冲。

从该浓缩收获物中，酶通过连续使用疏水相互作用(hic)-、阴离子交换(aie)-和阳离子交换(cie)-柱的三步色谱方法纯化。最后，将来自最后柱的洗出液再次缓冲并浓缩至0.5mg/ml。纯化方案提供纯藓类-agal(宿主细胞蛋白(hcp)水平约100ppm，考马斯sds-page单条带，se-hplc纯度99％)，其典型产率为30％。

实施例2：α-半乳糖苷酶a比较

实施例2.1：酶生产和活性测定：

如实施例1所述获得少甘露糖苷藓类agal。该生产品种另外用靶向唯一的小立碗藓n-乙酰葡糖胺基转移酶i基因(gnti)的敲除构建体转化，以获得高甘露糖agal的生产品种。为了测试末端甘露糖基残基数目增加对酶的细胞摄取的影响，在遗传上耗尽其β-1,2-n-乙酰葡糖胺基转移酶(gnt-1)活性的品种中也产生α-gala。敲除修饰导致藓类不能进行任何复合型聚糖加工，因为所有后来的酶促步骤都缺乏其底物。因此，在顺式-高尔基体中α-甘露糖苷酶i介导的修剪是最后的加工步骤，因此该品种的所有n-聚糖都是高甘露糖型的。在该品种中产生的人α-半乳糖苷酶被称为高甘露糖agal。生产和纯化遵循与实施例1相同的方案。

获得哺乳动物细胞产生的半乳糖苷酶α(shire,replagal®)和半乳糖苷酶β(genzyme,fabrazyme®)进行比较测试。

细胞沉淀或小鼠组织在冰冷的0.2％tritonx-100/盐水中裂解。将裂解物在4℃以14000rpm离心15分钟，并将上清液用于酶测定法。在0.1mn-乙酰半乳糖胺(α半乳糖苷酶b的特异性抑制剂)存在下，使用5mm4-甲基伞形酮基-α-d-吡喃半乳糖苷在ph4.4下通过荧光测定法测量α-gala活性。使用bca蛋白测定试剂盒(pierce)，测定蛋白浓度。活性表示为nmol/mg蛋白/小时。

实施例2.2：聚糖分析：

使用hilic-uplc-ms由protagenproteinservices(dortmund，germany)进行藓类-agal和半乳糖苷酶α的聚糖分析。简言之，使用pngasef从蛋白中酶促释放n-聚糖。清洁和脱盐后，使用2-氨基苯甲酰胺(2-ab)标记分离的聚糖。在acquityuplcbehglycan(2.1×100mm)柱上使用78％至55.9％b(缓冲液a：100mm甲酸铵ph4.5，缓冲液b：乙腈)的线性梯度以流速0.5ml/min在60℃下在38.5分钟内分离标记的聚糖。通过荧光检测器(在330nm激发，420nm发射)记录洗脱聚糖的信号。使用记录的m/z值(xevo-qtofms,waters)和maslynx软件(v4.1,waters)对各聚糖分配荧光峰。

高甘露糖agal的聚糖分析如下进行。将约25μg的α-gal还原(15mmdtt)、脲基甲基化(55mm碘乙酰胺)和丙酮沉淀(丙酮：水相4:1)。将沉淀重新溶解在0.1m碳酸氢铵缓冲液中，用37℃的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶(两种测序级蛋白酶，roche，mannheim)消化12小时。

使用60μmm甲酸铵缓冲液作为水性溶剂，将约3μg的各消化物装载在biobasicc18柱(biobasic-18,150×0.32mm，5μm，thermoscientific)上。以6μl/min的流速在25分钟内利用3至75％乙腈的梯度展开。用配备有标准esi源的watersq-tofultima质谱仪以正离子模式进行检测。数据分析用masslynx4.0手动进行。

表1：藓类agal和比较酶的n-聚糖分析结果

鉴于聚糖生物化学，可以认为hexnac是n-乙酰葡糖胺，hex是甘露糖。第1和第2行的藓类agal、man3和man3+甲基代表少甘露糖苷糖基化。令人惊讶的是，这一部分产率约为80％。高甘露糖和半乳糖苷酶α代表比较产品。

与半乳糖苷酶α相比，藓类agal具有非常均匀的结构组成，具有高的批次一致性。高的批次间一致性是保证重现性和功能预期的所需性质。

表2：糖同质/批间稳定性

实施例2.3：体外热稳定性：

将酶在从健康个体获得的血浆中稀释，并在37℃下加热指示时间长度。为了保持中性ph，将hepes加入终浓度为20mm的血浆中。加热后，测量α-gala活性。

实施例2.4：体外表征

藓类-agal具有非常均匀n-聚糖，其中核心型man3glcnac2作为主要结构(图5)。藓类-agal的糖链几乎完全由甘露糖和glcnac构成，其中约85％是甘露糖封端的，约10％具有甘露糖和glcnac末端残基两者，约4％是glcnac封端的(表1)。相比之下，man5glcnac2是高甘露糖agal中最丰富的聚糖结构(表1)，伴有少量man4、man6和man7。如预期的那样，在藓类-agal和高甘露糖agal中没有磷酸化聚糖。半乳糖苷酶α显示高度异质的聚糖结构，其中约24％是磷酸化聚糖，约7％是甘露糖封端的聚糖，63％是多样化结构(表1)。

在sds-page中，藓类-agal被检测为具有比半乳糖苷酶α更快的迁移率的单个主要条带(图5a)，反映了藓类-agal中较低的糖含量。在通过pngasef除去n-聚糖之后，藓类-agal和半乳糖苷酶α均迁移到相同的位置(图5a)。高甘露糖agal具有与藓类-agal相似的迁移率。在蛋白印迹分析中，通过针对人α-gala的多克隆抗体检测到藓类-agal和半乳糖苷酶α(图5b)。蛋白载量相同的情况下，蛋白印迹中的藓类-agal条带的强度为半乳糖苷酶α的2.14±0.58倍(n=3)，这可能是由于藓类-agal中可能促进抗体对于表位的可及性的较短糖链。

藓类-agal和高甘露糖agal的比活类似于半乳糖苷酶α和半乳糖苷酶β(图5c)。

当在人血浆中稀释并在37℃下加热时，藓类-agal和高甘露糖藓类-agal具有与半乳糖苷酶α或半乳糖苷酶β几乎相同的稳定性(图2d)。

实施例3：在藓类中生产适用于治疗戈谢病的人葡糖脑苷脂酶

实施例3.1表达品种构建

人gba基因的cdna序列(uniprot标识符p04062-glcm_human，ncbi参考序列：nm_000157.3)被合成并亚克隆到geneart^tm(thermofisherscientific，geneartag，regensburg，germany)的藓类表达载体。使用的序列(seqidno：7)编码人gba(seqidno：6)，不含天然注释信号肽(sp)，其被26个aa的植物sp代替(精确切割被预测为具有0.522评分，根据signalp4.1网络工具)。使用氨基酸赖氨酸的替代密码子以促进克隆(避免hindiii限制性位点)，在一个单一碱基中修饰gba序列(seqid7中的碱基位置21，aaa→aag)。使用限制酶从质粒切除含有gba表达构建体和新霉素抗性赋予基因(nptii)构建体的序列作为线性表达盒。

使用如实施例1.1所述的基于在其n-聚糖上缺乏植物特异性α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖残基的双重敲除系的藓类细胞系。为了产生稳定的产生葡糖脑苷脂酶的藓类细胞系，如实施例1.1所述，在基于peg的转化方法中用纯化的表达盒(图1)转化来自该糖工程改造的基础细胞系的原生质体。线性化表达盒包含与实施例1.1和图1所述相同的遗传元件，除了使用人gba序列代替α-gal序列(gla)。转化的藓类细胞经再生并针对抵抗抗生素g418的抗性进行选择。以连续两轮，针对每个生物量的总葡糖脑苷脂酶积累，筛选约700株抗性藓类植株，其中最佳品种成为标准生产品种。在该品种中产生的人葡糖脑苷脂酶被称为藓类-gba。

实施例3.2：酶生产和表征

使用与实施例1.2和实施例2所述相同的条件和步骤进行生产。通过用10kda纤维素盒的切向流过滤纯化葡糖脑苷脂酶，阳离子交换色谱(captos)用于捕获和凝胶过滤(sephadex)用于抛光过滤(polishing)。纯化/富集的葡糖脑苷脂酶通过蛋白印迹、考马斯/银染sdspage和酶活性测定法进行分析。将纯化的酶保存在-20℃直到进一步使用。纯化步骤如图3所示。获得了类似的高度富含甘露糖的糖基化。在重新运行中，发现了更高度的glucnac末端化聚糖，其形式为mgn和gngn。用β-n-乙酰葡糖胺酶处理恢复了大量的少甘露糖苷聚糖形式分布。

实施例3.3：酶测定法

纯化的葡糖脑苷脂酶的活性通过体外酶活性测定法来评估。在37℃下将葡糖脑苷脂酶在60mm柠檬酸钠，1.3mmedta，0.15％triton-x100,0.125％牛磺胆酸钠，1mmdtt，2mm4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷，ph6中孵育。用1mnaoh终止反应，并在405nm光谱测定产物形成。

实施例4：在藓类中生产适用于治疗庞贝病的人溶酶体α-葡糖苷酶

实施例4.1表达品种构建

人gaa基因的cdna序列(uniprot标识符p10253(lyag_human)，ncbi参考序列：nm_000152.4)被合成并亚克隆到geneart^tm(thermofisherscientific，geneartag，regensburg，germany)的藓类表达载体。使用的序列(seqidno：9)编码人gaa前体(seqidno：8)，不含天然注释信号肽(sp)，其被26个aa的植物sp(精确切割被预测为具有0.847评分，根据signalp4.1网络工具)和前肽代替。使用氨基酸苏氨酸的替代密码子以促进克隆(避免pvui限制性位点)，在一个单一碱基中修饰gaa序列(seqid9中的基因位置2484，acg→aca)。使用限制酶从质粒切除含有gaa表达构建体和新霉素抗性赋予基因(nptii)构建体的序列作为线性表达盒。

使用如实施例1.1所述的基于在其n-聚糖上缺乏植物特异性α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖残基的双重敲除系的藓类细胞系。为了产生稳定的产生葡糖脑苷脂酶的藓类细胞系，如实施例1.1所述，在基于peg的转化方法中用纯化的表达盒(图1)转化来自该糖工程改造的基础细胞系的原生质体。线性化表达盒包含与实施例1.1和图1所述相同的遗传元件，除了使用人gaa序列(seqid9)代替α-gal序列(gla)和不同的藓类启动子。转化的藓类细胞经再生并针对抵抗抗生素g418的抗性进行选择。以连续两轮，针对每个生物量的总葡糖脑苷脂酶前体积累，筛选约600株抗性藓类植株，其中最佳品种成为标准生产品种。在该品种中产生的人溶酶体α-葡糖苷酶被称为藓类-gaa。

实施例4.2：酶生产和表征

使用与实施例1.2和实施例2相同的条件和步骤进行生产。使用conasepharose4b通过亲和色谱纯化α-葡糖苷酶。将含有α-葡糖苷酶的培养基与相同体积的50mm乙酸钠，1mnaclph5.2混合，以调整适当的结合条件并加载到色谱柱上。通过逐步增加α-d-甲基葡糖苷的浓度来实现洗脱。纯化/富集的α-葡糖苷酶通过蛋白印迹、考马斯/银染sdspage和酶活性测定法分析。将纯化的酶在4℃或-20℃下储存直到进一步使用。富集的藓类-gaa的sds-page分析如图4所示。通过ms分析证实含有藓类-gaa的条带的身份。

α-葡糖苷酶具有7个糖基化位点，称为g1-g7。用ms/ms检测每个位点的糖形。大多数位点(gs2-gnm除外，73％)的最强烈峰被发现是gngn-糖形。因此，酶制剂用β-n-乙酰基葡糖胺酶处理以切割末端glcnac以将gnm和gngn转化为少甘露糖苷聚糖。

实施例5：藓类制造的α-半乳糖苷酶a的甘露糖受体介导的递送有效地纠正法布里病的酶缺陷

实施例5.1：体外摄取研究：

将法布里患者来源的皮肤成纤维细胞(dmn96.125)和内皮细胞系(imfe1)分别在含10％fbs的dmem和egm-2mv(lonza)中培养。两种细胞系均具有非常低的α-gala活性，并且具有可通过免疫染色检测的溶酶体gb3积累(shenetal.(2008)molgenetmetab95:163-168)。在存在或不存在5mmm6p或2mg/ml酵母甘露聚糖的情况下，将细胞与α-gala制剂(终浓度为10μg/ml)一起孵育指示时间长度。之后，通过胰蛋白酶处理(0.25％胰蛋白酶/edta，37℃)收获细胞，该胰蛋白酶处理也消除细胞外α-gala。用pbs洗涤后，将细胞沉淀裂解以用于酶测定法或蛋白印迹。

为了测试藓类酶在积累的gb3降解中的能力，将dnn96.125细胞与α-gala制剂(10μg/ml)一起孵育4天，每1-2天更换培养基。将模拟治疗的细胞用作未治疗的对照。如下所述的通过免疫染色检测gb3。

使用终浓度为10μg/ml的外源酶在法布里患者来源的成纤维细胞中进行酶摄取研究。孵育18小时后，加载有半乳糖苷酶α或半乳糖苷酶β的成纤维细胞具有明显增加的细胞内α-gala活性(分别为未治疗细胞活性的116-和134倍)(图6a)。这些酶的摄取几乎被m6p完全抑制，并被酵母甘露聚糖部分抑制，证实这种摄取主要通过m6pr。与藓类-agal或高甘露糖agal孵育的成纤维细胞的细胞内α-gala活性增加显著较低(分别为未治疗细胞的6.4和4.8倍)(图6a)。藓类-agal和高甘露糖agal的摄取均未被m6p或甘露聚糖抑制。这与这些细胞中mr的表达很少或没有一致(图6c、d)。尽管摄取量低，但法布里患者成纤维细胞中gb3的溶酶体积累在用藓类-agal或高甘露糖agal治疗4天后显著降低(图6b)，表明藓类α-gala酶能够降解溶酶体中累积的底物。

在ert中静脉输注的酶最好被血管内皮摄取，血管内皮构成血液与组织其余部分之间的第一个屏障。此外，内皮细胞是一些lsd例如法布里病中的主要疾病相关细胞类型。因此，我们测试法布里患者来源的微血管内皮细胞(imfe1)中的酶摄取。当通过蛋白印迹和免疫染色测定时，imfe1细胞为mr阳性(图6c、d)。过夜孵育后，藓类α-gala酶被imfe1细胞有效摄取(图6e)。通过imfe1细胞摄取藓类-agal或高甘露糖agal主要被酵母甘露聚糖阻断(约60-80％抑制)，并在较少程度(约2-10％)被m6p抑制，表明mr主要促成该摄取。通过imfe1细胞摄取半乳糖苷酶α或半乳糖苷酶β主要被m6p(约75-82％)抑制，但也被甘露聚糖抑制。

孵育过夜后，体外摄取通常达到平台期。为了比较不同α-gala制剂在动态期的摄取速率，将imfe1细胞与酶(10μg/ml)孵育较短时间。高甘露糖agal和半乳糖苷酶α的摄取大约是线性的，长达3小时，且高甘露糖agal的摄取速率高于半乳糖苷酶α(图6f)。在1小时孵育后，藓类-agal的摄取明显高于高甘露糖agal和半乳糖苷酶α，并在1-3小时内达到平台(图6f)。在重复实验中获得了类似的结果，包括具有较高酶量(40μg/ml)的实验。蛋白印迹在蛋白水平进一步证实了这些结果(图6g)。

为了评估酶结合效率，在存在或不存在m6p或甘露聚糖的情况下，将imfe1细胞与不同的酶制剂(10μg/ml)在4℃下孵育。三小时后，通过酶活性测定法测定细胞表面结合的α-gala。在该实验条件下，在与高甘露糖agal或半乳糖苷酶α一起孵育的细胞中，未检测到高于背景水平的α-gala活性(未治疗细胞的活性)(图6h)。藓类-agal具有比高甘露糖agal或半乳糖苷酶α显著更高的细胞结合(图6h)。藓类-agal的结合被甘露聚糖而不是m6p显著阻断。

这些结果表明，在使用培养的微血管内皮细胞的测定法系统中(与培养的成纤维细胞相比，其与体内ert可能更相关)，藓类α-gala酶的结合和摄取比半乳糖苷酶α更有效，并且这种结合/摄取通过mr发生。这些体外数据还表明，藓类产生的酶可适用于体内ert。由于藓类-agal的结合/摄取比高甘露糖agal更有效，因此我们选择前者进行后续动物研究。

实施例5.2：体外结合研究：

将多孔板中的imfe1细胞与α-gala酶(10μg/ml)在存在或不存在5mmm6p或2mg/ml甘露聚糖的情况下在4℃孵育。使用补充有25mmhepes的培养基egm-2mv。3小时后，将细胞用冰冷的pbs洗涤4次，并直接在0.2％triton中在4℃裂解。裂解物用于蛋白测定法和α-gala酶测定法。

实施例5.3：sds-page和蛋白印迹：

将样品在具有2.5％2-巯基乙醇的lds样品缓冲液(invitrogen)中在70℃变性10分钟。使用nupagebis-tris4-12％或10％凝胶(invitrogen)进行蛋白分离。如先前所述进行蛋白印迹(shenetal.(2008)biochembiophysrescommun369:1071-1075)。使用的第一抗体是抗人α-gala的兔多克隆抗体(shirehumangenetictherapies，cambridge，ma)，抗甘露糖受体的小鼠单克隆抗体(克隆15-2，abcam，cambridge，ma)和抗gapdh的山羊多克隆抗体(santacruzbiotechnology，santacruz，ca)。通过使用imagej软件的光密度测定法来定量α-gala蛋白水平。

实施例5.4：免疫荧光：

如先前所述进行荧光免疫染色(shenetal.(2008)molgenetmetab95:163-168)。使用的第一抗体是抗gb3(seikagaku，tokyo，japan)和甘露糖受体(克隆15-2，abcam)的小鼠单克隆抗体。细胞用dapi复染色。

实施例5.5：动物和程序：

法布里小鼠通过半合子雄性和纯合雌性的育种对来产生。在整个研究中使用成年(3-6个月龄)的雄性法布里小鼠。对于每个实验，使用具有相同年龄的动物。对于gb3清除研究，雌性法布里小鼠比雄性法布里小鼠更适合，因为雄性小鼠在肾脏中具有睾酮诱导的gb3合成，其混淆了输注的酶在累积gb3降解中的作用。对于所有注射，酶制剂在盐水中稀释至总体积200μl/小鼠，并通过尾静脉注射到法布里小鼠中。

实施例5.6：血浆药代动力学：

以1mg/kg体重(n=5)的剂量注射酶制剂。注射后1、5、10、20和30分钟，使用肝素化毛细管通过尾部出血收集血样。分离血浆，测定血浆中的α-gala酶活性。

通过尾静脉以1mg/kg体重(bw)的剂量将藓类-agal或半乳糖苷酶α注射到法布里小鼠中，并通过体外α-gala酶测定法分析血浆清除。藓类-agal比半乳糖苷酶α更快地从循环中清除(图7a)。为了验证藓类-agal的较短的血浆半衰期是由于组织中更强的摄取而不是循环中更快的酶失活(变性)，小鼠血浆中的酶通过蛋白印迹分析(图7b)。根据抗体对藓类-agal的较高反应性(图5b)，藓类-agal条带的强度以2.14的因数校正。结果显示输注后5和10分钟，藓类-agal-输注小鼠的α-gala蛋白水平明显低于注射半乳糖苷酶α的小鼠(图7c)。5和10分钟血浆中藓类-agal蛋白水平分别为半乳糖苷酶α的37％和28％，这与酶活性数据大致一致(在这两个时间点藓类-agal注射小鼠血浆中的比活分别为半乳糖苷酶α注射小鼠的49％和28％)。此外，血浆中蛋白水平与酶活性之间存在很强的相关性(图7d)。与体外摄取研究结果一起(图6f-h)，这些数据表明，与半乳糖苷酶α相比，静脉内给予的藓类-agal在组织中被血管内皮细胞和其它细胞类型更有效地摄取。

实施例5.7：生物分布：

以1mg/kg体重的剂量注射酶制剂(各组n=5)。注射后2小时，用盐水灌注小鼠(去除血液)，收获心脏、肾脏、脾脏和肝脏。将整个器官匀浆化，并测定α-gala活性。对于肾脏，将两个肾合并并匀浆化。

将藓类-agal或半乳糖苷酶α静脉注射到法布里小鼠(1mg/kgbw)后两小时，评估每种酶制剂的组织分布。来自藓类-agal注射的小鼠的肾脏具有比半乳糖苷酶α显著更高的酶活性(图8a)。心脏和脾脏中的藓类-agal和半乳糖苷酶α的水平是相当的(图8a)。肝脏中藓类-agal的水平显著低于半乳糖苷酶α(图8a)。计算每个完整器官的活动，并比较不同器官之间的比例(图8b)。在总回收活性中，94.9％的藓类-agal和97.5％的半乳糖苷酶α被递送至肝脏(p<0.05)。藓类-agal注射小鼠的肾脏总活性为1.96％，这显著高于(p<0.05)半乳糖苷酶α注射小鼠(0.58％)。蛋白印迹分析证实，与半乳糖苷酶α相比，肾脏中藓类-agal的摄取量更高(图8c)。

为了研究输注的酶的细胞分布，在注射1mg/kgbw的藓类-agal或半乳糖苷酶α后24小时，对法布里小鼠组织进行免疫组织化学。具体信号显示颗粒细胞质模式，大概反映酶的溶酶体定位。这两种酶在心脏和肾脏中的细胞定位基本相同。在心脏中，在毛细血管和血管周围细胞而不是在肌细胞中检测到藓类-agal和半乳糖苷酶α(图9a)。仅在肾皮质管状上皮细胞中检测到任一酶的特异性染色(图9b)。这些结果与半乳糖苷酶α的细胞分布一致。

实施例5.8：免疫组织化学：

通过尾静脉以1mg/kg体重的剂量注射藓类-agal或半乳糖苷酶α(各n=2)。酶输注后1天收获心脏和肾脏。未治疗的雌性法布里小鼠组织用作阴性对照。将组织固定在福尔马林中，包埋到石蜡中，制备5微米切片。在georgetownuniversity(washington,d.c.)的histopathologyandtissuesharedresource进行免疫组织化学。简言之，在柠檬酸盐缓冲液中热诱导的表位修复后，用3％过氧化氢和10％正常山羊血清处理切片，并与抗人α-gala的兔多克隆抗体(shire)一起孵育。用hrp标记的第二抗体孵育后，用dab色原体检测信号，切片用苏木精复染。用对照染色验证信号特异性，其中省略了第一抗体孵育。与未治疗对照中的轻度和弥漫性非特异性染色相比，特异性信号显示颗粒状细胞质模式。

实施例5.9：组织稳定性：

通过尾静脉以1mg/kg体重的剂量注射藓类-agal或半乳糖苷酶α。在注射后24、48和96小时，灌注小鼠(每组n=4-5)，收集器官并匀浆化，如上文生物分布中所述。

实施例5.10：组织动力学

在单次静脉内注射后研究了各种器官中藓类-agal和半乳糖苷酶α的体内动力学。在注射后2和24小时，来自藓类-agal注射的小鼠的肾脏与半乳糖苷酶α注射的小鼠相比具有显著更高的酶活性(图10a)。然而，在48和96小时活性相似(图10a)。在心脏中，两种形式的酶在2和24小时之间没有显著差异；然而，在注射后48和96小时，藓类-agal的活性低于半乳糖苷酶α(图10b)。与注射半乳糖苷酶α的小鼠相比，注射藓类-agal的小鼠在脾脏中具有相似的活性水平，并且在所有分析的时间点在肝脏中的活性显著降低(图10c、d)。肾脏和心脏中藓类-agal和半乳糖苷酶α的半衰期范围为2至3天。藓类-agal在两个器官中的半衰期缩短了约25％。藓类-agal在肝脏中的半衰期明显短于半乳糖苷酶α(24对57小时)。脾脏中两种酶形式的半衰期相似(约30小时)。

实施例5.11：组织gb3的清除：

使用6个月龄的雌性法布里小鼠。通过尾静脉以0.3、1和3mg/kg体重的剂量注射藓类-agal或半乳糖苷酶α(各组n=4-5)。单次注射后1周收获心脏、肾脏和肝脏。年龄和性别匹配的未治疗的法布里和wt小鼠用作对照(n=5)。将组织匀浆化，并如前所述通过质谱法进行糖鞘脂提取和随后的gb3分析(durantetal.(2011)jlipidres52:1742-1746)。分析八种同种型，结果显示这些同种型的总和。gb3含量以μg/mg总蛋白表示。

在单次静脉内注射任一酶至6个月龄的法布里小鼠后7天比较了藓类-agal或半乳糖苷酶α降解积累gb3的功效。测试三种不同剂量(0.3、1和3mg/kgbw)。未治疗的法布里小鼠与未治疗的wt对照相比，肾脏、心脏和肝脏中的gb3水平显著增加(图11a-c)。两种形式的酶以剂量依赖性方式在这些器官中降低gb3(图11a-c)。除了在最高剂量(3mg/kg)下半乳糖苷酶α更好的心脏gb3清除之外，藓类-agal和半乳糖苷酶α在清除肾脏和心脏中的gb3方面具有相当的功效(图11a、b)。在清除肝脏gb3时，在0.3和1mg/kg剂量下，半乳糖苷酶α比藓类-agal更有效(图11c)。在较高剂量(3mg/kg)下，这两种酶导致类似的肝脏gb3水平。

实施例6：通过非静脉内途径将藓类生产的重组人α-半乳糖苷酶a递送至法布里病小鼠模型

这些实验的目的是测试非静脉内途径在将藓类αgal递送至小鼠模型中的靶组织的潜在有用性。

实施例6.1：方法

使用实施例1中所述的藓类-agal，浓度为0.69mg/ml。使用成年(8-11个月)雄性法布里小鼠。通过腹膜内(i.p.)、肌内(i.m.)或皮下(s.c)途径注射藓类-agal。对于后两种途径，将酶分别注射到大腿肌肉(两侧)和肩膀之间的松弛皮肤下。测试了1、3或10mg/kg体重的剂量。在注射后0.5、1、2、4、6和24小时收集血液，并在24小时解剖器官。将样品保存在-80℃直到使用。来自未治疗的法布里小鼠(n=5)的血浆用于基线活性。使用标准4mu方法测量血浆和组织中的α-gala活性。

光谱法：酶反应后，使用spectromaxm5(moleculardevices)测量释放的4mu的荧光强度。该设备用于分析来自i.p.和i.m.注射小鼠的样品(以及我们近5年来测定的所有样品)。然而，由于最近出现的机械问题，对于s.c.注射的小鼠样品，使用spectromaxparadigm(moleculardevices)测量荧光。spectromaxparadigm中的4mu标准曲线显示出优良的线性，并且分析的小鼠组织和血浆的α-gala活性与之前使用spectromaxm5测定的非常接近(测试相同的样品)。因此，本研究中使用2种不同光谱的数据差异应该非常小。

实施例6.2：结果和讨论：

i.p.途径(图12)：注射后0.5-2小时血浆活性达到峰值，此后下降并在6小时时恢复至基线水平。活性是剂量依赖性的。心脏、肾脏、肝脏和脾脏中的活性以剂量依赖性方式增加。

i.m.途径(图13)：注射后0.5小时血浆活性达到峰值，此后迅速下降，在4小时时恢复至基线水平。心脏、肾脏、肝脏和脾脏中的活动以剂量依赖性方式增加。一只小鼠(＃14，剂量为10mg/kg)的组织活性明显高于同组；该样品从数据分析中删除。

s.c.途径(图14)：血浆活性显示出与i.m.给药相似的模式。总体而言，组织活性以剂量依赖性方式增加。然而，剂量1和3mg/kg之间的心脏和肾脏活性没有显著差异；这可能是由于该途径的吸收率相对有限。剂量为10mg/kg时，组织活性呈现较大差异；5只小鼠中的2只具有比其余小鼠高得多的活性。

实施例6.3：比较

酶递送效率为i.p.>s.c.>(或类似)i.m.的顺序。

i.p.vs.i.v.：在i.p.注射小鼠中(1mg/kg)α-gala在心脏、肾脏、肝脏和脾脏中的活性分别为i.v.注射小鼠的16％、49％、17％和35％(来自组织稳定性研究的数据，1mg/kg，注射后24小时)。

s.c.vs.i.p./i.v.：虽然s.c.注射导致酶递送至组织少于i.p.注射，但不同器官的缩减比不成比例。在1mg/kg的剂量下，在心脏、肾脏、肝脏和脾脏中的α-gala活性分别为i.p.注射小鼠的67％、43％、22％和24％。这表明s.c.途径趋向于相对于肝脏和脾脏递送更多的酶到心脏和肾脏。与i.v给药相比，出现了类似的模式。s.c.的上述器官的活性分别为i.v注射小鼠的11％、21％、4％和9％。

非iv途径是ert的替代方法。i.p.似乎是很好的方法。考虑用于人，s.c.可能是很好的候选。尽管组织量低于i.v.给药，由于在组织中只需要低量，因此能够给予足量。如果单次给药的低组织活性(例如，s.c.vsi.v.)不足以降解心脏和肾脏中积累的gb3，重复注射可以克服这个问题。总之，i.p.、i.m.和s.c.的积极方面如改善患者接受度超过了减少的靶组织分布。

实施例7：讨论

根据蛋白特征以及其计划应用，选择不同的表达宿主。尽管用于工业和食品/饲料应用的大量蛋白主要在诸如大肠杆菌(escherichiacoli)的原核宿主中表达，但药物蛋白生产通常依赖于在高等真核细胞例如cho-(中国仓鼠卵巢)或植物细胞中的表达。后者的选择主要是基于以下事实：主要是人源的药物蛋白需要复杂的翻译后修饰(ptm)，例如n-糖基化。因此，相同蛋白在不同真核表达系统中的平行重组表达产生了相对于ptm的不同产品质量。例如，在n-糖基化的情况下，哺乳动物细胞表达系统倾向于在相同的蛋白产物上产生具有数十至数百种不同n-聚糖物质的非常异质的产物混合物。相比之下，基于植物的表达系统具有非常同质的n-糖基化模式特征，其中在产生的蛋白上仅存在几种(通常低于10种)不同的聚糖物质。

在药物蛋白生产的情况下，生产系统的选择往往是由产品的结构和质量要求引发的。本发明由生产重组溶酶体蛋白来治疗患有lsd的患者的需要所驱动。因为这些患者由于可遗传基因突变而缺乏该酶的功能性形式，因此通过常规酶替代疗法(例如静脉内输注)将重组产物用作替代物。为了通过与靶细胞表面上的甘露糖受体结合从血流中有效摄取，需要用携带末端甘露糖残基的n-聚糖修饰酶。

为了在植物表达系统中产生具有甘露糖封端的n-聚糖的agal形式，常规方法将通过向n末端加入分泌信号和向c末端加入液泡靶向信号来利用蛋白的液泡靶向。在这种方法中，分泌信号将新生蛋白引导到内质网(er)中，其中该蛋白用前体聚糖修饰。在默认的分泌途径后，将蛋白运送到高尔基体，其聚糖将进一步修剪并加工成典型的复合植物n-聚糖形式。这些聚糖以两个末端n-乙酰葡糖胺(glcnac)残基结束，覆盖这种聚糖的可能的甘露糖末端。

然后通过第二个靶向肽、c-末端的液泡靶向信号，使在两个聚糖臂的倒数第二位置的这两个甘露糖暴露。该肽结合反式高尔基体网络(tgn)中的液泡分选受体，并启动将附着蛋白靶向液泡。这里，β-n-乙酰基己糖胺酶切除末端glcnac，从而暴露出甘露糖残基。所得聚糖被分类为“少甘露糖苷的”，并且对于植物液泡蛋白是典型的。

相比之下，本发明省略了将c-末端液泡信号掺入蛋白序列的步骤。因此，重组产物没有被分选到tgn中的液泡，而是进一步遵循默认的分泌途径。在这种方法中，不期望修剪复合n-聚糖和伴随的末端甘露糖暴露，因为少甘露糖苷结构被指定为液泡特异性的(castilho&steinkellner,2012,biotechnologyjournal,7(9),1088–1098)。

本发明在苔藓植物中实现n-聚糖修剪以产生在其n-聚糖上具有暴露的末端甘露糖而没有液泡信号的溶酶体蛋白的重组形式。尽管如此，在溶酶体蛋白的情况下，这使得分泌途径，独立于液泡糖加工，导致具有大量少甘露糖苷糖蛋白的产物。

藓类-agal被表达mr的内皮细胞有效地摄取，并且这种摄取被mr介导的内吞作用的特异性抑制剂酵母甘露聚糖阻断。藓类-agal没有被不表达mr的人皮肤成纤维细胞有效地摄取。这些发现表明，藓类-agal的摄取是由mr介导的。相比之下，半乳糖苷酶α的摄取涉及mr和m6pr。动物研究表明，小鼠心脏和肾脏中藓类-agal的酶活性和贮积清除能力与半乳糖苷酶α总体相当。这些结果表明，在治疗法布里病和其它lsd中，甘露糖封端的酶可以与携带m6p的酶一样有效。

测试的藓类-agal的蛋白序列和结构与人对应物相同。通过在定制的藓类品种中表达来实现同质且主要是甘露糖封端的n-糖基化。此外，为了生产高甘露糖agal，已经敲除了gnt-1(n-乙酰转移酶-葡糖胺基转移酶i)。通过这种酶将n-乙酰葡糖胺转移到新生聚糖形成用于其进一步加工成复杂形式的必需底物。因此，在该敲除中阻断复合聚糖加工，并且所有糖形式均为高甘露糖型。

我们的研究表明，藓类是表达α-gala和其它溶酶体酶的有用平台。在一个方面，藓类本身具有显著同质的n-糖基化特征，即，与例如哺乳动物细胞相比，其蛋白表现出显著减少的糖形式数量，具有高度可重复的百分比分布。关于药物生产，在n-聚糖质量对于蛋白的治疗功效是决定性的情况下，这是非常有利的。

内皮细胞对藓类-agal的摄取比半乳糖苷酶α有效得多。这与输注的藓类-agal从体内循环的更快清除是一致的。鉴于内皮细胞可能在法布里病的血管病变和其它表现的病理生理学中起重要作用，对内皮细胞的有效递送有利于预防和纠正疾病病理学。我们的研究还表明，尽管末端甘露糖残基增加，高甘露糖agal与内皮细胞的结合/内皮细胞对高甘露糖agal的摄取效率明显低于少甘露糖苷的藓类-agal。这表明mr结合效率可能更多地取决于聚糖的构象，而不是暴露的甘露糖残基的绝对数量。

通过免疫组织化学检测，在心脏的血管内皮细胞和血管周围细胞中检测到藓类-agal，其总体与mr分布模式一致。已知心肌细胞通过mr或mr样受体内吞甘露糖基化的配体。尽管在肌肉细胞中没有检测到酶，但是显著降低的心脏gb3(法布里小鼠的约45％减少接受1.0或3.0mg/kg藓类-agal)表明，在我们的免疫染色方法的检测限下的少量酶可能被递送到心肌细胞。在肾脏中，仅在管状上皮细胞中检测到藓类-agal。这种摄取的机制尚不清楚，因为没有报道肾小管表达mr。可能的解释是管状细胞表达介导甘露糖封端的糖蛋白的内吞作用的其它受体。已经报道了在小鼠脾脏和淋巴结中存在具有mr样结合活性的这种未鉴定受体。管状细胞过滤的酶通过巨蛋白介导的胞吞作用而再吸收是另一种可能性。

输注后2小时分析时，藓类-agal和半乳糖苷酶α显示出不同的组织分布。相对于半乳糖苷酶α，将藓类-agal靶向肾脏显著增强，并且向肝脏递送显著降低。藓类的该分布模式是有利的，因为肾脏是这种疾病中受影响的主要器官之一。在肝脏中，可通过m6pr、去唾液酸糖蛋白受体和mr向肝细胞和窦内衬细胞(内皮和/或kupffer细胞)递送输注的半乳糖苷酶α。输注的磷酸化酶可及的大多数m6pr被包含在肝脏中。相比之下，藓类-agal将通过mr优先递送到内皮细胞和kupffer细胞。

心脏和肾脏中内化的藓类-aga的半衰期短于半乳糖苷酶α。这可能与藓类-agal中较低的糖含量有关，这可能导致酶对溶酶体中蛋白水解降解的敏感性增加。由于更快的更新(turnover)，输注后4天，藓类-agal在肾脏中的活性与半乳糖苷酶α的活性相似。在注射后4天，肾脏和心脏中gb3贮积的减少反映残留的酶活性。

藓类-aga和半乳糖苷酶α的比较可用作研究m6pr和mr在半乳糖苷酶α组织摄取中的作用的有用模型。如上所述，m6pr和mr两者均在体外介导半乳糖苷酶α的递送，因此难以确定哪种受体途径更多负责该酶在特定靶器官中的生物分布和治疗反应。尽管糖链显著不同，但在心脏和肾脏中，半乳糖苷酶α和藓类-agal的细胞定位令人惊讶地相似。这些器官的贮积清除功效也相似。换句话说，与完全非磷酸化的酶相比，在半乳糖苷酶α中的m6p残基没有导致更广泛的分布和更完整的gb3清除，如可能预期的。这些发现表明，在将半乳糖苷酶α靶向心脏和肾脏方面，mr途径可能比m6pr起更重要的作用。