本发明涉及一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板、其试剂盒及其制备方法，属于微生物法检测领域。
背景技术：
目前，国内外关于烟酸的检测方法都比较复杂，一般有微生物法、高效液相法和酶联免疫法。其中，高效液相法检测的下限较微生物法要高出很多，精度较好，但是需要昂贵的精密仪器和试剂，样品处理过程较为复杂，难以在生产上进行推广应用；另外，酶联免疫法检测结果与实际数值出入较大。而微生物法可灵敏地检测出具有生物活性的烟酸，这是微生物法区别于其他方法的最大特点及优势。
现有的微生物方法利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)对烟酸的特异性和灵敏性，定量测定出试样中烟酸的含量。在测定用培养基中供给除烟酸以外的所有营养成分，这样微生物生长产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中烟酸的含量相对应；以不同浓度标准溶液的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出试样中烟酸的含量。
但是包被有植物乳杆菌的试剂盒却存在诸多缺陷，现有方法在-80℃使微孔板中的微生物悬浮液冷冻休眠，然后将微孔板中的微生物团在真空下冷冻干燥。一些微生物为了适应不利环境，发生变异或重组，因此加入水或样品后，有些微生物在无维生素的条件下仍能生长，导致高检测背景，而且在个别情况下还会导致错误结果。另外，现有方法采用在真空下冷冻干燥，还可导致至少约25％的菌种损失。
因此，需要进一步改进微生物方法利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)对烟酸检测的方法。
技术实现要素：
为了克服上述现有方法的不足，本发明提供一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板，可减少菌种损失，提高烟酸的检测结果的准确性。
本发明的另一目的在于提供上述微孔板的制备方法。
本发明的还一目的在于提供包含该微孔板的试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种用于微生物法定量检测烟酸的试剂盒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明所述的一种用于微生物法定量检测烟酸的微孔板，其由如下步骤制备而成：
1)活化植物乳杆菌，将活化后的植物乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-36℃培养16-20h，2200转/min离心1-2min，弃去上清液；
2)加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1-2min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；
3)将所述测试菌液2-4μl添加至微孔板各孔中，分别在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在33-37℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥36-48h，或者冷冻后再以升华的方式干燥36-48h。
其中，步骤1)中的活化植物乳杆菌采用活化方式：
将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；
将0.3g粉末植物乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0-4℃保存；
将0.3ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳；
重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。
所述植物乳杆菌菌株为植物乳杆菌ATCC8014。
步骤2)中海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为180-190mM、10-12mM。
为了实现本发明的另一目的，提供一种制备用于微生物法定量检测烟酸的微孔板的方法，其由如下步骤制备而成：
1)活化植物乳杆菌，将活化后的植物乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-36℃培养16-20h，2200转/min离心1-2min，弃去上清液；
2)加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1-2min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；
3)将所述测试菌液2-4μl添加至微孔板各孔中，分别在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在33-37℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥36-48h，或者冷冻后再以升华的方式干燥36-48h，从而制得定量检测烟酸用微孔板。
其中，步骤1)中的活化植物乳杆菌采用活化方式：
将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；
将0.3g粉末植物乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0-4℃保存；
将0.3ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳；
重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。
所述植物乳杆菌菌株为植物乳杆菌ATCC8014。
步骤2)中海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为180-190mM、10-12mM。
本发明还提供一种包含上述微孔板的试剂盒。
所述试剂盒，还包含烟酸标准品、烟酸测试培养基以及无菌水。
具体地说，本发明所述试剂盒，包含包被有植物乳杆菌ATCC8014菌株的上述微孔板、3×3.2μg烟酸标准品、3×(0.75-0.76)g烟酸测试培养基(12.0g/L酪蛋白氨基酸、40.0g/L葡萄糖、20.0g/L醋酸钠、0.4g/L L-胱氨酸、0.2g/L DL-色氨酸、20.0mg/L硫酸腺嘌呤、20.0mg/L盐酸鸟嘌呤、20.0mg/L尿嘧啶、200.0μg/L盐酸硫胺素、200.0μg/L泛酸钙、400.0μg/L盐酸吡哆醇、400.0μg/L核黄素、200.0μg/L p-氨基苯甲酸、0.8μg/L生物素、1.0g/L磷酸氢二钾、1.0g/L磷酸二氢钠、0.4g/L硫酸镁、20.0mg/L氯化钠、20.0mg/L硫酸亚铁、20.0mg/L硫酸锰)以及3×30ml无菌水。
本发明所述的试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：
a.先制备包含包被有植物乳杆菌菌株的微孔板：
1)活化植物乳杆菌，将活化后的植物乳杆菌菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，32-36℃培养16-20h，2200转/min离心1-2min，弃去上清液；
2)加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀后离心1-2min，弃去上清液，重复前述操作一次，然后再加入10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液，混匀，制得菌悬液；吸1-2ml菌悬液至10-12ml海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，混匀制成测试菌液；
3)将所述测试菌液2-4μl添加至微孔板各孔中，分别在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下稍稍加热测试菌液，使测试菌液在33-37℃的温度条件下沸腾而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥36-48h，或者冷冻后再以升华的方式干燥36-48h，从而制得定量检测烟酸用微孔板；
b.然后制备包含烟酸标准品及烟酸测试培养基(12.0g/L酪蛋白氨基酸、40.0g/L葡萄糖、20.0g/L醋酸钠、0.4g/L L-胱氨酸、0.2g/L DL-色氨酸、20.0mg/L硫酸腺嘌呤、20.0g/L盐酸鸟嘌呤、20.0mg/L尿嘧啶、200.0μg/L盐酸硫胺素、200.0μg/L泛酸钙、400.0μg/L盐酸吡哆醇、400.0μg/L核黄素、200.0μg/L p-氨基苯甲酸、0.8μg/L生物素、1.0g/L磷酸氢二钾、1.0g/L磷酸二氢钠、0.4g/L硫酸镁、20.0mg/L氯化钠、20.0mg/L硫酸亚铁、20.0mg/L硫酸锰)。
其中，所述活化植物乳杆菌采用活化方式：
将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，115℃灭菌15分钟，即为液体培养基；
将0.3g粉末植物乳杆菌菌株加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳，得凝乳状菌种，放置于0-4℃保存；
将0.3ml上步骤中培养好的凝乳状菌种加入10ml所述液体培养基中，37±1℃培养直至凝乳；
重复几次上一步骤，不同的是每次使用的菌种均是上一步骤获得的培养物，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。
所述植物乳杆菌菌株为植物乳杆菌ATCC8014。
所述海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液中，各自的浓度分别为180-190mM、10-12mM。
本发明所述的用于微生物法定量检测烟酸的微孔板及其试剂盒，通过在制备中加入特定浓度及用量的海藻糖/蔗糖和氯化钙混合液保护剂，以及改进菌液的干燥方法(特定梯度的低真空环境及干燥方式)，可降低了试剂盒中的菌种损失，提高了烟酸检测结果的准确性，经活菌计数，制备的微孔板中的植物乳杆菌干燥泡沫中保存的活性菌种数，均超过了所添加菌液中菌种总数的95％(普通冷冻干燥法至少损失约25％的菌种)。
附图说明
图1为本发明所述的用于微生物法定量检测烟酸的检测标准曲线。
具体实施方式
下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
下面结合附图对本发明做进一步描述。
实施例1
1.微孔板制备
(1)活化植物乳杆菌ATCC 8014
将11g脱脂奶粉加入89ml蒸馏水中，混匀，以10ml为单位分装至试管中，115℃灭菌15分钟，此溶液即为液体培养基。
将0.3g粉末植物乳杆菌ATCC 8014菌株加入10ml培养基中，37±1℃培养直至凝乳，放置于冰箱4℃下保存。
将0.3ml上步骤中培养好的菌种加入10ml培养基中，37±1℃培养直至凝乳。
重复几次上一步骤，待凝乳时间稳定后表明菌种已活化好。
(2)测试菌液制备
将活化后的植物乳杆菌ATCC 8014菌株接种到乳杆菌肉汤培养基中，36℃±1℃培养24h，2200转/min离心2min，使其停止培养，弃去上清液；
加入190mM海藻糖和10mM CaCl2混合溶液10ml，混匀，2200转/min离心2min，弃去上清液，再加10ml保护剂，混匀。如前离心操作，弃去上清液。再加12ml保护剂，混匀。吸1ml该菌悬液至10ml保护剂中，混匀制成测试菌液。
(3)微孔板包被
将2μl测试菌液等分添加至微孔板各孔中，依次在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下稍稍加热菌液(此时可以使微生物更好地包被在微孔板上，并最大限度地保持微生物的活性)，使菌液在35℃的室温条件下沸腾从而产生泡沫，并在所述低真空环境和室温下蒸发干燥约48小时从而制得所述烟酸检测用微孔板。
经活菌计数，上述方法制备的微孔板中的植物乳杆菌干燥泡沫中保存的活性菌种数，均超过了所添加菌液中菌种总数的95％(普通冷冻干燥法至少损失约25％的菌种)。
2.标准品制备
定量获取3.2μg烟酸标准品至棕色带盖试剂瓶中，每个试剂盒中包含3瓶标准品。使用时用2ml试剂盒中的无菌水溶解1瓶标准品，获得0.16mg/100ml的标准品储备液，然后根据操作说明书稀释至所需浓度，0标准品为无菌水。
3.培养基制备
称量12.0g酪蛋白氨基酸、40.0g葡萄糖、20.0g醋酸钠、0.4g L-胱氨酸、0.2gDL-色氨酸、20.0mg硫酸腺嘌呤、20.0g盐酸鸟嘌呤、20.0mg尿嘧啶、200.0μg盐酸硫胺素、200.0μg泛酸钙、400.0μg盐酸吡哆醇、400.0μg核黄素、200.0μg p-氨基苯甲酸、0.8μg生物素、1.0g磷酸氢二钾、1.0g磷酸二氢钠、0.4g硫酸镁、20.0mg氯化钠、20.0mg硫酸亚铁、20.0mg硫酸锰，混匀。称取0.75混合培养基粉末加入1个培养基瓶中，每个试剂盒包含3瓶。
4.无菌水制备
将双蒸水在121℃高压灭菌15分钟，每瓶30ml，每个试剂盒中包含3瓶无菌水。
5.其它
试剂盒中还包含2片粘合箔。
实施例2
1.微孔板制备
包被植物乳杆菌株采用植物乳杆菌ATCC 8014，步骤如下：将活化后的菌株(活化处理方式同实施例1)接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，38℃±1℃培养18h，以2200转/分钟离心3min，使其停止培养，弃去上清液。加入180mM蔗糖和12mM CaCl2保护剂混合液12ml，混匀，再离心2min，弃去上清液，再加10ml保护剂，混匀。如前离心操作，弃去上清液。再加12ml保护剂，混匀。吸2ml该菌悬液至12ml保护剂中，混匀制成测试菌液。
将1μl所述菌液等分添加至微孔板各孔中，分别在20mTorr、55mTorr、510mTorr、5Torr、45Torr、210Torr的低真空环境下稍稍加热菌液，使菌液在37℃的室温条件下沸腾从而产生泡沫，而后将泡沫冷冻随后以升华的方式干燥36小时，从而制得所述烟酸检测用微孔板。
经活菌计数，上述方法制备的微孔板中的植物乳杆菌干燥泡沫中保存的活性菌种数，均超过了所添加菌液中菌种总数的95％(普通冷冻干燥法至少损失约25％的菌种)。
2.标准品制备
定量获取3.2μg烟酸标准品至棕色带盖试剂瓶中，每个试剂盒中包含3瓶标准品。使用时用2ml试剂盒中的无菌水溶解1瓶标准品，获得0.16mg/100ml的标准品储备液，然后根据操作说明书稀释至所需浓度，0标准品为无菌水。
3.培养基制备
称量12.0g酪蛋白氨基酸、40.0g葡萄糖、20.0g醋酸钠、0.4g L-胱氨酸、0.2gDL-色氨酸、20.0mg硫酸腺嘌呤、20.0g盐酸鸟嘌呤、20.0mg尿嘧啶、200.0μg盐酸硫胺素、200.0μg泛酸钙、400.0μg盐酸吡哆醇、400.0μg核黄素、200.0μg p-氨基苯甲酸、0.8μg生物素、1.0g磷酸氢二钾、1.0g磷酸二氢钠、0.4g硫酸镁、20.0mg氯化钠、20.0mg硫酸亚铁、20.0mg硫酸锰，混匀。称取0.76g混合培养基粉末加入1个培养基瓶中，每个试剂盒包含3瓶。
4.无菌水制备
将双蒸水在121℃高压灭菌15分钟，每瓶30ml，每个试剂盒中包含3瓶无菌水。
5.其它
试剂盒中还包含2片粘合箔。
采用上述试剂盒对烟酸进行检测，在精密度和准确度上均表现优良。
实验例1
本实验例在于研究本发明所述试剂盒的精密度。
使用3批次试剂盒(实施例1制备的试剂盒)检测1849F美国国家标准与技术研究所奶粉参考物质1849F(烟酸浓度为10.9mg/100g)，做平行实验，结果见表1。每个批次检测奶粉参考物质1849F的1种稀释(最终浓度在标准曲线范围内)。
表1
测定奶粉参考物质浓度的变异系数非常小(1.62％)，表明精密度高。3个批次间标准品原始结果的变异低于10％。
使用3批次试剂盒(实施例2制备的试剂盒)检测奶粉参考物质1849F【美国国家标准与技术研究所奶粉参考物质，烟酸浓度目标值为10.9mg/100g】，做平行实验，结果见表2。每个批次检测奶粉参考物质1849F的1种稀释(最终浓度在标准曲线范围内)。
表2
测定奶粉参考物质浓度的变异系数非常小(1.62％)，表明精密度高。3个批次间标准品原始结果的变异低于10％。
实验例2
本实验例在于研究本发明所述试剂盒的准确度。
分别采用本实施例1试剂盒与对比试剂盒检测奶粉参考物质1849F，按各自产品操作说明书进行样品提取，并分别做4个稀释(最终浓度均在标准曲线范围内)，每个稀释做3个平行，结果见表3。
现有试剂盒微孔板的制备方式：
植物乳杆菌ATCC 8014的培养物过量接种于10ml乳酸杆菌培养基中，培养36小时。在对数生长期通过离心(2500G×5分钟)停止培养，将细胞团用0.85％NaCl溶液洗涤3遍，悬浮于10ml分析培养基中，然后用分析培养基1-10倍稀释。微孔板的每个微孔中加入3μl微生物悬浮液，在-80℃使微孔中的微生物悬浮液冷冻休眠，然后将微孔中的微生物团在真空下冷冻干燥。
准确度＝检测结果/实际浓度×100％
表3
校准曲线
该检测标准曲线的范围为0.016-0.16mg/100g。为了得到样品中烟酸的含量，必须将从标准曲线读取的样品结果乘以稀释倍数。数据处理软件在最终计算时包含稀释系数，并输出结果为mg烟酸/100克样品。典型的曲线如图1所示。
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。