一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法与流程

本发明属于分子育种领域，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas9系统敲除大鳞副泥鳅色素基因从而生产白化大鳞副泥鳅的方法。

背景技术：

随着观赏水族行业在国内的稳步发展，观赏类生物的品种的逐年激增，以鳅科鱼类为代表的原生鱼种也逐渐为广大水族爱好者所熟知。其中，白化鳅科鱼种从外观上可以看到其皮肤白色或浅红色，眼睛红色并且透明。因为这种性状的奇异性和稀少性，所以尤其受到广大水族消费者的追捧。目前，这些新的观赏鱼类资源主要由野外捕捞筛选，随机性大，产量极少，难已满足广大水族爱好者的猎奇需求。并且由于白化鱼种的白化鱼苗发育胚胎的透明性，它们经常被用来做单性发育的研究材料，为研究遗传基因在正常鱼体所发挥的作用提供可见的有力的证据。因此，运用现代生物技术定向改造鱼类体色，稳定批量生产符合市场及科研需求的白化鳅科鱼类将具有很大的发展空间。

CRISPR/Cas9基因敲除系统是近两年发展起来的一种来源于细菌获得性免疫系统的基因编辑技术，经过人工的改造，目前已被广泛运用于多种模式生物的研究，成为一种强大的研究工具。酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)是催化黑色素形成的关键酶，主要存在于黑色素细胞中。黑色素细胞广泛存在于鱼类等脊椎动物的表皮中。TYR基因主要在皮肤、脑和眼中都有表达，其中眼部和黑色皮肤表达最高。从青鳉鱼中分离出多个白化突变体，对它们TYR突变基因的分析表明，缺失突变和转座子插入是导致白化的两种主要突变类型。将正常的TYR基因转移到白化鱼体内，转基因鱼的体色得到了不同程度的恢复。是一种常染色体隐性遗传病。

因此，在分子育种领域中，利用CRISPR/Cas9系统敲除鳅科鱼类TYR基因生产白化鳅科鱼种的技术，将是一种具有重大意义的发明，且目前还没有出现相关研究的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9系统敲除鳅科鱼类大鳞副泥鳅的TYR基因，从而生产白化大鳞副泥鳅的分子育种技术。用于定向改造鱼类体色，不仅可以有效解决观赏鱼市场白化鱼种供需困难的问题，还可以提供科学研究所需要的白化鱼类胚胎。

本发明通过以下内容实现：

1、大鳞副泥鳅TYR基因序列信息的确定：

①首先，使用RNAiso Plus试剂(TaKaRa，日本)提取大鳞副泥鳅皮肤总RNA，再使用逆转录试剂盒1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)体外合成第一链cDNA。

②由NCBI数据库中获取斑马鱼，草鱼，团头鲂等鱼类TYR基因全长cDNA序列，后进行多重比对，读取这些鱼类保守区域氨基酸序列的保守区域设计合成1对简并引物，用于克隆大鳞副泥鳅TYR基因核心片段，回收产物送公司测序，得到其序列信息。

③使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,USA)试剂盒，参照试剂盒推荐方法合成5’、3’-RACE cDNA第一链。再在②步骤中得到的核心片段序列上的设计RACE引物，分别以5’、3’-RACE cDNA第一链为模板，克隆大鳞副泥鳅TYR基因5’和3’末端片段，回收产物送公司测序，得到其序列信息。

④拼接得到大鳞副泥鳅TYR基因全长序列信息。大鳞副泥鳅TYR基因全长序列信息如SEQ ID NO：1所示。

2、CRISPR/Cas9靶位点设计及确认：

在大鳞副泥鳅TYR基因的ORF序列上，按照CRISPR/Cas敲除原理，设计TYR基因靶位点。靶位点通式为：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’(N为任意碱基)，尽量在ORF前端设计。同时在靶位点周围300-500bp大小范围内设计引物进行PCR扩增，扩增产物直接送测序。要求：①正反向引物距离靶位点处至少100bp。②PCR条带清晰，无杂带。③测序结果与设计的靶位点序列相同，且测序峰图显示为纯合子(即未出现叠峰)。大鳞副泥鳅TYR基因靶位点序列信息如SEQ ID NO：2所示。

3、Cas9mRNA和gRNA的制备：

以纯化后的线性化Cas9质粒(pSP6-2sNLS-SpCas9vector)为模版，进行体外转录得到Cas9mRNA，将其纯化后于-80℃保存。保存浓度为830ng/μL。设计含有TYR基因靶位点序列的上游引物及与其匹配的下游引物，以gRNA骨架质粒为模版进行PCR扩增，再以纯化后的产物为模版，进行体外转录得到gRNA，将其纯化后于-80℃保存，保存浓度为1210ng/μL。含有TYR基因靶位点序列的上游引物如SEQ ID NO：3所示，与其匹配的下游引物如SEQ ID NO：4所示。

4、体外显微注射：

注射前一天晚上，挑选2对发育较好的大鳞副泥鳅，进行人工催产，人工催产药物的剂量为每kg雌亲鱼注射LRH-A₂ 40ug、DOM 4mg，雄鱼减半。然后将亲本置于水温为27℃的黑暗环境中静养。第二天早上即可进行人工授精，获得受精卵后将其置于显微注射专用培养皿上，用显微注射仪对到达1细胞期的受精卵进行显微注射。之后将注射完毕的受精卵置于28℃恒温箱进行孵化培育。Cas9mRNA的终浓度为500ng/μL，gRNA的终浓度为30ng/μL，每次注射的量为2nL，注射部位为动物极。

5、TYR基因敲除鱼的筛选：

在步骤4中得到的受精卵孵化48小时之后，对比相同孵化条件下的野生型大鳞副泥鳅胚胎，在显微镜下挑选出体色素出现异常的基因敲除鱼。

6、能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅的获得：

将步骤5中得到的TYR基因敲除鱼进行杂交，获得的F1代中无体色素出现的个体，即为能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅。

本发明具有以下优点：

1、TYR基因敲除鱼的筛选

本发明敲除效率极高，且无需通过分子手段筛选，只需通过肉眼观察，即可以高效获得大量TYR基因敲除成功个体。

2、能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅的获得

将TYR基因敲除鱼作为亲本杂交，F1代即可得到能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅，仍无需通过分子手段，只需肉眼观察筛选。简单高效，周期短。

附图说明

图1是T7E1酶切检测突变体的琼脂糖凝胶电泳图。

图2是TYR基因敲除大鳞副泥鳅的杂交策略示意图。

图3是野生、G0代、F1代白化大鳞副泥鳅的对比照片。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明实施应用进行说明。

1、大鳞副泥鳅皮肤总RNA的提取

使用TaKaRa公司RNAiso Plus试剂进行大鳞副泥鳅总RNA的提取，具体步骤如下：

1)提取RNA：所用器皿、手术剪、镊子均要用DEPC处理过夜；所用到的水为TaKaRa公司购买的RNase-free Water；离心EP管，各型号枪头为提RNA专用的或者用DEPC水浸泡过夜并高压灭菌处理。注意：提取总RNA过程中要及时佩戴口罩，更换手套，避免说话。实验前将取样器械置于冰上预冷；

2)处死大鳞副泥鳅，快速分离皮肤组织，并取30mg-50mg组织样品于2mL离心管中，离心管置于冰浴，事先加入1.5mL RNAiso Plus试剂，3颗经DEPC水浸泡过夜并高压灭菌处理的玻璃珠。加好后使用组织破碎仪破碎至呈无颗粒透明状即可；

3)取出离心管，室温静置5min；

4)将离心管移至低温高速离心机，12000r/min、4℃离心5min；

5)离心后取出，吸取上清液转移到新的1.5mL离心管中；

6)向上述匀浆裂解液中加入氯仿，用量为RNAiso Plus试剂体积的1/5，盖上离心盖，用手剧烈震荡15s，待充分乳化后，再室温静置5min；

7)将离心管移至低温高速离心机，12000r/min、4℃离心15min；

8)由离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，无色上清液，中间白色蛋白质层及带有鲜红颜色的下层有机层，吸取上清液到另一新离心管中；

9)向上清液中加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温条件下静置10min；

10)于低温离心机中，12000r/min离心批评，试管底部会出现沉淀；

11)RNA沉淀的清洗：小心弃去上清液，缓慢地沿管壁加入75％乙醇溶液1mL，轻轻颠倒混匀洗涤管壁，12000r/min、4℃离心5min后小心弃去乙醇；

12)于超净工作台中室温干燥沉淀2-5min，加入10-20μL RNase-free Water溶解沉淀；

13)将充分溶解的RNA样品取1-2μL，用1-2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取结果；

14)将充分溶解的RNA样品取1-2μL，用紫外分光光度计检测RNA浓度与纯度。

2、大鳞副泥鳅皮肤cDNA第一链的合成

1)大鳞副泥鳅皮肤cDNA第一链的合成使用逆转录试剂盒1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)；记录由紫外分光光度计测定的RNA样品浓度。

2)在提取RNA专用离心管中配制10μL如下反应体系：

3)将该反应体系置于PCR仪上42℃2min后，冰上急冷。

4)另取提取RNA专用离心管中配制10μl如下反应体系：

5)混合均匀，置于PCR仪运行程序：37℃15min；85℃5s；4℃停止。

3、大鳞副泥鳅皮肤cDNA基因核心区序列引物设计

由NCBI数据库中获取斑马鱼，草鱼，团头鲂等鱼类TYR基因全长cDNA序列，后进行多重比对，读取这些鱼类保守区域氨基酸序列的保守区域设计合成1对简并引物：

F：ACTTYACCAKCCCKTACTSGGACTGGC

R：ATGTCTTCMGTGYAGGGGBCCGCCAACG

预期PCR产物片段大小为500bp左右。经合成的引物12000r充分离心，后用去离子双蒸水(ddH₂O)将引物溶解至浓度为20μmol/L,置于-20℃条件下保存备用。

4、大鳞副泥鳅TYR核心片段的PCR扩增

1)配制如下60μl PCR反应体系：

2)将反应体系混匀，离心后置于PCR仪上，进行PCR反应。大鳞副泥鳅TYR基因核心片段PCR扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。注意：配制反应体系时必须在冰上进行。

3)PCR纯化产物与pMD-19T载体的连接，小型离心管中10μl反应体系如下：

纯化PCR产物 4μl

pMD19-T载体 1μl

SolutionⅠ 5μl

4)将该10μL体系混合均匀，置于PCR仪上，设置程序16℃30min反应，取全部反应产物转化入DH5α(100μl)感受态细胞中，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落置于5ml LB/Amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊；取500μl菌液测序送往上海生工生物技术有限公司，引物为M13反向引物，使用ABI PRISMTM全自动荧光测序仪完成序列测定，测序要求为双向测序，并进行校对与拼接，得到大鳞副泥鳅TYR基因核心序列。

5、大鳞副泥鳅TYR基因5’、3’-RACE cDNA的合成

1)5’-RACE引物的设计

根据步骤4中克隆得到的大鳞副泥鳅TYR基因cDNA核心序列，使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,USA)试剂盒，按照试剂盒说明设计5’-RACE上游引物如下：

扩5’端：

OUTER1：GGCGGATCCCTGCACTGAAGACAT

INER1：CTCATACTCTGTCAGTCTGAGCACCGA

下游引物UPM(通用混合引物Universal Primer Mix)、NUP(UPM的嵌套引物Nested Universal Primer)由试剂盒提供。

2)大鳞副泥鳅TYR基因cDNA 5’末端

使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech,USA)试剂盒，进行5’-RACE PCR扩增(使用巢式引物扩增)，1st PCR反应体系(10μl体系)如下:

PCR扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。

嵌套PCR反应(60μl)体系：

PCR扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。

3)5’-RACE PCR产物的pMD-19T载体克隆

将5’-RACE PCR产物按照步骤4中的操作步骤进行pMD-19T载体克隆，最后将阳性克隆送往公司测序，得到大鳞副泥鳅TYR基因cDNA 5’末端序列信息。

4)再按照上述方法得到大鳞副泥鳅TYR基因cDNA3’末端序列信息。其中，3’-RACE上游引物如下：

扩3’端：

OUTER2：CTTCACCATCCCGTACTGGGACTGGC

INER2：TCAGTCCATCCTCTGTATTCTCCTCGT

1st PCR反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。嵌套PCR94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。

6、大鳞副泥鳅TYR基因序列信息的确定

将步骤4和步骤5中得到的序列拼接，得到大鳞副泥鳅TYR基因全长序列信息。大鳞副泥鳅TYR基因全长序列信息如SEQ ID NO：1所示。

7、CRISPR/Cas9靶位点设计及确认

根据靶位点通式：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’(N为任意碱基)及靶位点基本设计原则，在大鳞副泥鳅TYR基因的ORF序列上，设计TYR基因靶位点。设计靶位点序列信息如SEQ ID NO：2所示。同时在靶位点周围设计如下正反引物进行PCR扩增，

F：TGCTTCTCTTCATCATTCAGTACC

R：GCTCGTGCCGTTGTTCATT

体系如下：

PCR扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。

根据步骤4所述方法得到扩增产物序列信息，然后和靶位点序列比较，发现结果相同，说明靶位点可用，可以进行下一步。当然，大鳞副泥鳅TYR基因靶位点不限于SEQ ID NO：2所示序列，符合要求能够敲除TYR基因的其它靶位点也在保护范围之内。

8、gRNA的制备

首先，设计含有TYR基因靶位点序列的gRNA上游引物及与其匹配的下游引物：

F：TAATACGACTCACTATAGCTCCAGAGGTTCTCCTAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

R：AAAGCACCGACTCGGTGCCA

在灭菌PCR管中配制如下反应体系，其中模板DNA：p-T7-gRNA质粒(购自http://www.biovector.net/product/99362.html)：

PCR扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。

再利用AXYGEN公司的AxyPrep PCR清洁试剂盒对产物进行清洗回收，主要步骤如下：

1)在PCR产物中加150μl的Buffer PCR-A；

2)混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，12,000×g离心1min，弃滤液；

3)将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心1min，弃滤液；

4)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加25μl Eluent，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱回收DNA。

然后利用Ambion公司的T7 Kit试剂盒对洗脱回收DNA进行体外转录，主要步骤如下：

将上述试剂加入灭菌EP管中，37℃水浴1h，然后加入1μL TURBO DNase，37℃水浴15min以去除DNA模板，最后用Ambion公司的mirVana^TM miRNA Isolation Kit进行回收，步骤如下：

用RNase-free water将gRNA转录体系稀释到300μL，加入330μL无水乙醇；

2)将溶液加到回收柱中，10000g离心15s；

3)加入700μL的miRNA Wash Solution I，离心10s；

4)加入500μL的Wash Solution II，离心10s；重复一次；

5)弃去收集管中的液体，离心1min，去除残余的液体；

6)加入适量95℃预热的RNase-free water，最大转速离心30s，收集得到gRNA溶液，测得浓度为1210ng/μL，零下80℃保存。

9、Cas9mRNA的制备

通过XbaI单酶切线性化pSP6-2sNLS-spCas9载体(37℃水浴，4h以上)，取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物。以纯化后的线性化Cas9质粒为模版，进行体外转录得到Cas9mRNA，将其纯化后于-80℃保存。保存浓度为830ng/μL。纯化回收和体外转录同步骤8。

10、体外显微注射

注射前一天晚上，挑选2对发育较好的大鳞副泥鳅，进行人工催产，人工催产药物的剂量为每kg雌亲鱼注射LRH-A₂ 40ug、DOM 4mg，雄鱼减半。然后将亲本置于水温为27℃的黑暗环境中静养。第二天早上即可进行人工授精，获得受精卵后将其置于显微注射专用培养皿上，用显微注射仪对到达1细胞期的受精卵进行显微注射。之后将注射完毕的受精卵置于28℃恒温箱进行孵化培育。Cas9mRNA的终浓度为500ng/μL，gRNA的终浓度为30ng/μL，每次注射的量为2nL，注射部位为动物极。

11、TYR基因敲除鱼的筛选

在受精卵孵化约6小时之后，对比相同孵化条件下的野生型大鳞副泥鳅胚胎，在显微镜下可以看出TYR敲除鱼的眼睛仍为无色透明，而野生型的已经开始出现黑色素。可以初步判断靶位点有效。孵化48小时后，就可以从外观明显区别G0代是否为敲除成功的鱼。然后随机选取10尾基因敲除成功的鱼，分别提基因组DNA，进行T7E1法验证，T7E1酶切检测突变体实验步骤来自http://www.docin.com/p-1292084266.html。发现全部切开，结果如图1所示。因此，TYR基因敲除鱼的筛选，可以直接通过体色出现异常这个特点判断。最后统计发现，共存注射400余颗受精卵，12颗畸形或死亡，18颗表现出正常体色(不一定未敲除成功)，突变率超过95％。

12、能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅的获得

繁殖策略是将得到的TYR基因敲除鱼进行杂交，如图2所示，获得的F1代中无体色素出现的个体，即为能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅。如图3所示。

综上所述，本发明是一种简单，高效，周期短，易实施的分子育种技术，且该技术只是破坏本身基因功能，不涉及外来基因，不存在转基因问题，便于推广运用。

序 列 表

<110>华中农业大学

<120>一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法

<160> 4

<210> 1

<211> 2111

<212> DNA

<213>大鳞副泥鳅TYR基因

<400> 1

TGGGAGGGAG GGCAGTGCGT AAAAGAAAGA GAGAGAGAAC TGAATAAAGT TTTTCTTACT 60

CTTCTGAAAA TGTTTCACGC TCATGCACTG CGTGTCTAAT TTAAAGCACC GTCTTTAGAT 120

AGCTCACCAT GAACCCTTTA TGTGCCTTTC TGCTTCTCTT CATCATTCAG TACCCGGGTC 180

CATCTCTCCA GCAGTTTCCT CGACCATGCA CCACTCCAGA GGTTCTCCTA AGCAAACAAT 240

GCTGTCCGGT TTGGCCAGGG GACGGCTCGG TGTGTGGGAG TCTCTCGGGT CGAGGCTTCT 300

GCCAGGACGT CACGGTCTCT GAGCTTCCCA ACGGGCCTCA GTACCCCCAC TCCGGCCTAG 360

ATGACCGGGA ACGGTGGCCT CTGGTGTTTT ACAACCAAAC CTGCCAGTGC GCAGGTAACT 420

ACATGGGGTT CAACTGCGGC GAGTGCAAGT TCGGGTATTT TGGTGCCAAT TGCGCGGAGA 480

GAAGAGAGTC CGTGCGCAGG AACATCTTCC AGCTGTCGGT AACGGAGAAA CAGCGGTTTA 540

TCTCCTACCT GAACCTTGCC AAAAACACAA TCAGCCCGGA TTACATGATC GCGACGGGCA 600

CGTACGCGCA AATGAACAAC GGCACGAGCC CCATGTTCGC TAACATCAGC GTGTATGATC 660

TGTTCGTGTG GATGCACTAC TACGTGTCCC ATGACACGCT GCTCGGCGGG CCCGGTAACG 720

TGTGGAGAGA CATCGACTTC GCGCACGAGT CTGCGGCGTT CCTACCCCGG CACCGCGTTT 780

ATTTGCTGTT CCGGGAGCAT GAGATCCGGA AACTGACCGG AGACTTTAAC TTCACCATCC 840

CGTACTGGGA CTGGCGTGAC GCGGAGGATT GTCAGGTGTG CACGGATGAA CTGATGGGGG 900

CGCGCAGCTC ACTGAACCGA GGCTTAATCA GTCCATCCTC TGTATTCTCC TCGTGGAAGG 960

TGGTCTGTTC ACAAGCTGAA GACTACAACA ATCGTGAGGT TCTGTGCGAC GGGTCTCCTG 1020

AAGGGCCTTT ACAGCGTAAC CCTGGTGACC ACGACCGAAC CCGTGTCAGA CGGCTGCCGA 1080

CCTCTGCAGA TGTGGAGTCG GTGCTCAGAC TGACAGAGTA TGAGACCGGG TCAATGGACC 1140

GGCAGGCCAA CATGAGTTTC CGTAACGCTC TGGAAGGTTT TGCGAGTCCA GAAACAGGTC 1200

TGGCAGTAAC AGGTCAGAGT CTGATGCACA ACTCACTACA CGTCTTCATG AATGGATCCA 1260

TGTCTTCAGT GCAGGGATCC GCCAACGACC CCATTTTTAT TCTGCATCAT GCCTTTATAG 1320

ACAGCATTTC CGAGCAGTGG TTAAGGCGAC ACCAGCCTCC GCGCACACAT TACCCGACAG 1380

CCAACGCCCC AATCGGGCAC AACGATGGAT ATTTCATGGT TCCCTTCATC CCACTGTACA 1440

GAAACGGAGA TTATTTCTTG TCCACCAAAG CTTTGGGATA CGAATATGCA TATTTAATGG 1500

ACCCTGGCCA GCGGTTCGTA CAAGAGTTTT TGACGCCATA TCTACAGCAA GCTCAGCAGA 1560

TCTGGCACTG GCTGCTGTCC GCAGGAATTT TGGGGGCGCT TGTGGCAGGA ATTATCGCAA 1620

CAATAATCGC CGCAACATGC CGCAGACGGC AAAAAAGACG AAAGCTGTCG GGATACGGAG 1680

AGAGACAGCC GCTTCTGAAC AGCAGCGAGG AAGAGGGTTC GACTTCGTAT CAGACAACGC 1740

TGTGAATCAA ACACATACAC ACTACAGGCA CGTGTCAGTG AGGACAGATA CAATACATAC 1800

TGTAACCAAT GGGAAAAGAC ACAACAGACA GTTAACAAAG TCAGTTTACT TAGTCATGTG 1860

AACAACGGAG GCCTCACCAC TGAATCTTAT GCTGAGGTCT CGCACCTGTA CCAGTTATGA 1920

GATAATGTTG GGAAATGCAT ACTACTGTAA AATAAGTAGG GCGGTCAAAC GATTAATATT 1980

TTAAAAACTT TTAGATTACA GGTTTTAACA GTGGATATTG TACGCAGTAT GCAAACTGTC 2040

TATATAAACC ATTAATACTA CTAATATTAA AAAGATCAAA GTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2100

AAAAAAAAAA A 2111

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

CTCCAGAGGT TCTCCTAAGC 20

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

TAATACGACT CACTATAGCT CCAGAGGTTC TCCTAAGCGT TTTAGAGCTA GAAATAGC 58

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

AAAGCACCGA CTCGGTGCCA 20