一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及DNA疫苗领域，具体而言，涉及一种分离的DNA片段、针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗、疫苗制剂、DNA疫苗的制备方法和疫苗制剂的制备方法。

背景技术：

布鲁氏菌病(Brucellosis)，又称布鲁氏杆菌病，简称布病。布病是由布鲁氏菌属细菌侵入机体后引起传染-变态反应性人畜共患的传染病。人类、家畜及动物普遍易感，人感染主要表现为发热、寒战、盗汗、全身不适等症状，而动物感染的临床症状主要是流产、不孕、生殖器官受侵害。世界动物卫生组织(OIE)已将布病列为B类动物疫病，我国也将其列为二类动物疫病。近年来，布病的人畜疫情在我国和世界其他国家和地区出现回升势头。中国疾病预防控制信息系统的数据表明，2004年以后，我国布病发病率不断上升，至2009年我国人间布病已报告发病35816人。我国每年因布病而产生的治疗费用、误工损失以及对畜牧业造成直接、间接经济损失已经成为一笔天文数字。因此，如何防治布病已经成为当务之急。

布病的病原是布鲁氏菌(Brucella)，属于革兰氏阴性菌，无质粒、芽孢和荚膜，兼性寄生于单核巨噬细胞内。该菌产生有毒性的内毒素，内毒素有致热性、致死作用和皮肤过敏原性。病菌主要经呼吸系统、消化系统、生殖系统等进入机体，随淋巴液达淋巴结，被吞噬细胞吞噬。如吞噬细胞未能将细菌杀灭，则细菌在胞内生长繁殖，形成局部原发病灶，随之大量细菌进入淋巴液和血液循环形成菌血症，并随血流带至全身，在肝、脾、淋巴结、骨髓等处的单核-吞噬细胞系统内繁殖，形成多发性病灶。

根据宿主差异、生化反应特点及菌体表面的不同结构,可将布鲁氏菌分成6个不同的种,包括羊种布鲁氏菌(B.melitensis)、牛种布鲁氏菌(B.abortus)、猪种布鲁氏菌(B.suis)、绵羊种布鲁氏菌(B.ovis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)和犬种布鲁氏菌(B.canis)；其中，羊种布鲁氏菌又包括1型、2型和3型。近年来，我国流行的布鲁氏菌主要是羊种3型布鲁氏菌，该布鲁氏菌对人、畜均有很强的毒力和侵袭力，致病力也很强，人畜感染后症状较严重，容易引起布病的爆发和流行。因此，采取有效措施防治羊种3型布鲁氏菌引起的布病对畜牧业和公共健康事业的发展至关重要。

目前，全世界范围内消灭该病的主要方法是扑杀与免疫结合，而在布病发生相对严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。现有的布鲁氏菌病疫苗主要集中在减毒活疫苗和灭活疫苗，其中，在广泛应用的疫苗主要有减毒活疫苗S19、Rev.1疫苗、羊种布鲁氏菌M5减毒活疫苗。但上述疫苗都属于传统的减毒活疫苗，仍保持一定毒力，容易出现病毒毒力回复，即“返祖现象”，存在安全性的问题。另外，活疫苗须在低温条件下保存及运输，对保存和运输的要求较高。

为了克服常规疫苗存在残余毒力等缺陷，科技人员也对布鲁氏菌病DNA疫苗进行研究。DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗具有接种载体(如质粒)结构简单，生产成本低，适于大批量生产、便于运输和保存、比传统疫苗更安全等优点。现有技术中已经成功制备出L7/L12、P39等DNA疫苗，但上述DNA疫苗存在诸多缺陷，例如，pCDNA3-L7/L12刺激的免疫反应只能保持较短的时间(4周)，P39真核疫苗只有较低的保护效力，在攻毒8周后免疫应答的效果才明显(log0.73)，但与传统的S19弱毒疫苗相比，还存在一定差距。总而言之，现有技术缺乏一种安全、稳定、抗体效价高、免疫效力时间长的布鲁氏菌病DNA疫苗，特别是缺少一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种分离的DNA片段，该DNA片段为分离自羊种3型布鲁氏菌的Omp31基因。

本发明的第二目的在于提供一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗，所述的DNA疫苗针对羊种3型布鲁氏菌的感染，具有安全无毒、免疫效力强、持续时间长、便于运输和保存等优点。

本发明的第三目的在于提供一种疫苗制剂。

本发明的第四目的在于提供一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗的制备方法，该制备方法简单易行，便于大规模生产。

本发明的第五目的在于提供一种疫苗制剂的制备方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种分离的DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明所述DNA片段为分离自羊种3型布鲁氏菌的Omp31基因，所述Omp31基因编码具有免疫作用的Omp31蛋白。因此，本发明所述DNA片段可以用于制备针对羊种3型布鲁氏菌的疫苗。

一种针对羊种3型布鲁氏菌感染的DNA疫苗，所述DNA疫苗为包含上述DNA片段的真核表达载体。

本发明所述DNA疫苗的抗原基因克隆自羊种3型布鲁氏菌的Omp 31基因。因此，本发明所述DNA疫苗对在我国广泛流行的羊种3型布鲁氏菌具有针对性，有利于防治由羊种3型布鲁氏菌引起的布病。另一方面，本发明所述DNA疫苗与传统减毒M5疫苗相比，具有更高的淋巴细胞增殖指数和更强的细胞杀死力。而就抗体表达水平和持续时间而言，本发明所述DNA疫苗与减毒M5疫苗的抗体表达水平和抗体持续时间基本相当。因此，本发明所述DNA疫苗具有比传统弱毒疫苗更好的免疫效果，具有与传统弱毒疫苗基本相当的抗体效价和持续时间，克服了现有技术中布鲁氏菌DNA疫苗的免疫力弱、效价低、抗体持续时间短的缺陷。

如上所述DNA疫苗，优选地，真核表达载体选自pVAX1、pCI、pcDNA3.1和pJW4303。

一种疫苗制剂，所述制剂包括上述DNA疫苗和佐剂。

如上所述的疫苗制剂，优选地，所述佐剂选自细胞因子基因佐剂和/或载体功能免疫佐剂中的一种或几种。

如上所述的疫苗制剂，优选地，所述细胞因子基因佐剂选自IL-2、IL-12、IFN-γ、GM-CSF中的一种或几种，所述载体功能免疫佐剂选自脂质体、免疫刺激复合物(Immune stimulating complexes,ISCOMs)和减毒的侵袭性胞内细菌中的一种或几种。

如上所述的疫苗制剂，优选地，所述DNA疫苗和所述佐剂的质量比为1：1-5。

本发明所述疫苗制剂将DNA疫苗与佐剂配合使用，发现佐剂能够显著增强DNA疫苗的免疫原性从而提高DNA疫苗的免疫效果。尤其是将DNA疫苗的真核表达载体与细胞因子基因佐剂，优选IL12、IL2基因佐剂，配合使用，能够极大地提高本发明所述免疫制剂的效果。本发明对DNA疫苗和佐剂的用量比进行优化，发现真核表达载体与佐剂的质量比为1：1-5时，本发明所述DNA疫苗的免疫效果尤其好。真核表达载体与佐剂的质量比还可以为1:2-4或1:3等。

一种制备上述DNA疫苗的方法，所述方法包括：构建包含权利要求1所述DNA片段的真核表达载体。

本发明所述制备方法主要涉及真核表达载体的构建，不需要直接接触致病菌，操作简单安全，易于大规模生产。

如上所述的方法，优选地，所述方法具体包括以下步骤：(1)通过PCR方法扩增得到上述DNA片段；(2)用EcoRⅠ和BamHⅡ分别酶切PCR扩增所得DNA片段和pVAX1载体；(3)连接酶切后的DNA片段和pVAX1载体，转化感受态细胞；(4)挑取阳性克隆，通过双酶切和测序方式对阳性克隆进行确认；(5)提取阳性克隆的质粒。

如上所述疫苗制剂的方法，将所述DNA疫苗与所述佐剂混合。

本发明所述疫苗制剂的制备方法将DNA疫苗与佐剂混合，能够显著地提高疫苗制剂的免疫效力。

一种预防羊种3型布鲁氏菌感染的方法，包括：将如上所述的DNA疫苗或所述疫苗制剂导入羊体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。

优选的，所述羊包括盘羊(Argali)、赤羊(Urial)、绵羊、家羊、摩弗伦羊(Mouflon)、大角羊(Bighorn sheep)、白大角羊(Dall sheep)、雪山盘羊(Snow sheep)或赤盘羊。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本发明所述DNA片段为克隆自羊种3型布鲁氏菌的Omp31基因，该基因可以用于制备特异性针对羊种3型布鲁氏菌的疫苗。

2)本发明所述DNA疫苗针对的是羊种3型布鲁氏菌，能够有效地防治在我国广泛流行地由羊种3型布鲁氏菌引起布病，现有技术中还没有针对羊种3型布鲁氏菌的疫苗，特别是DNA疫苗。与传统减毒疫苗相比，本发明所述DNA疫苗具有基本相当，甚至略强的免疫效果，但不存在毒力回复的危险，其安全性更高，且易于运输和保存。而与现有针对布鲁氏菌的DNA疫苗相比，本发明所述DNA疫苗具有更强的免疫效果和更长的抗体持续时间。

3)本发明所述DNA疫苗制剂将DNA疫苗与佐剂配合使用，并对佐剂的种类、DNA疫苗与佐剂的用量配比进行优化，所获得的疫苗制剂具有更好的免疫效果。

4)本发明所述DNA疫苗的制备方法和疫苗制剂的制备方法主要涉及载体构建、质粒提取等分子生物学操作，不需要与有毒致病菌接触，更为安全，并且本发明所述方法操作简单，便于大规模生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为受检菌的革兰氏染色结果；

图2为受检菌的柯兹洛夫斯基染色(柯氏染色)结果；

图3为受检菌的AMOS-PCR鉴定结果，其中M代表Marker，1代表猪种疫苗株S2，2代表羊种疫苗株M5，3代表受检菌，4代表大肠杆菌埃希菌；

图4为实施例2中Omp31基因PCR扩增产物的电泳图，其中M代表Marker，1～3代表PCR扩增产物；

图5为实施例2中双酶切验证实验的电泳图，其中M代表Marker，1代表阳性克隆；

图6为实施例2中SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色结果，其中M代表Marker，1代表对照，2、3代表阳性克隆；

图7为实施例2中WB检测结果，其中M代表Marker，1代表阳性克隆；

图8为实施例3中双酶切鉴定真核重组质粒的电泳图，其中M代表Marker,1代表被酶切的真核重组质粒；

图9为COS-7细胞中Omp31的免疫细胞化学鉴定结果；

图10为Omp31二级结构预测结果，其中最长竖线表示α-螺旋，次长竖线表示延伸链；次次长竖线表示β-转角，最短竖线表示无规卷曲；

图11为Omp31三级结构预测结果；

图12为Omp31分子表面可能性分析结果；

图13为Omp31分子亲水性分析结果；

图14为Omp31分子柔性分析结果；

图15为Omp31分子抗原指数分析结果；

图16为免疫小鼠的淋巴细胞增殖指数的分析结果，其中*VS.saline group,p<0.05；#Vs.M5group,p<0.05；

图17为免疫小鼠体外细胞杀伤实验结果；

图18为免疫小鼠血清抗体水平，其中M代表M5疫苗，S代表Omp31DNA疫苗，P代表磷酸盐缓冲液。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

羊种3型布鲁氏菌的鉴定

从青海省海晏县流产羔羊中分离出羊种3型布鲁氏菌，并对其进行鉴定。

1、菌株培养和染色镜检

将流产羔羊置于生物安全柜内进行组织取样，研磨所取组织样品，取研磨悬浮液接种于TSA培养基，放入培养箱生长24h后取出，将单个菌落接种于TSB培养基培养。观察菌落形态并按如下方法进行革兰氏染色和柯兹洛夫斯基染色(柯氏染色)。

革兰氏染色法：用接种环勾取少量菌液均匀涂抹于干燥的载玻片中央，火焰固定，滴加草酸铵结晶紫初染1min，将染液用蒸馏水冲去，加碘液覆盖涂面染约1min，用水冲洗、吸水纸吸去水分，加95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20s后水洗，吸去水分，蕃红染色液(稀)染30s后，蒸馏水冲洗，干燥，镜检。

柯兹洛夫斯基染色(柯氏染色)：用接种环勾取少量菌液均匀涂抹于干燥的载玻片中央，火焰固定，滴加沙黄溶液，酒精灯加热2min左右，直至出现气泡为止，水洗后滴加孔雀绿进行复染，蒸馏水冲洗，干燥，镜检。

受检菌经37℃恒温培养2d～4d后，在肝浸液固体培养基上可见无色、半透明菌落，边缘整齐，折光较明显，呈露滴状。革兰染色后菌体较小，圆形或球杆状，呈红色，无芽孢，无鞭毛，无荚膜；科兹洛夫斯基鉴别染色可见有红色细菌分布。革兰氏染色和科兹洛夫斯基染色的染色结果如图1～图2所示。

2、生化鉴定、单相特异性血清A和M凝集试验及噬菌体裂解试验

通过生化鉴定、单相特异性血清A和M凝集试验及噬菌体裂解试验对受检菌进行进一步鉴定。鉴定结果如表1所示。

表1生化鉴定、单相特异性血清A和M凝集试验即噬菌体裂解试验

3、AMOS-PCR鉴定结果

应用AMOS-PCR方法对受检菌进行进种型鉴定，AMOS-PCR的检测结果如图3所示。根据图3可知，受检菌经PCR扩增得到与羊种免疫株M5相同大小的特异性片段。

根据菌落观察、染色、生化鉴定、单相特异性血清A和M凝集试验及噬菌体裂解试验、以及AMOS-PCR试验的鉴定结果可以确定从海省海晏县流产羔羊中分离出的菌株为羊种3型布鲁氏菌。

实施例2

Omp31基因的克隆、在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定

1、Omp31基因的克隆

按照如下方法克隆Omp31基因：1)从实施例1分离获得的羊种3型布鲁氏菌中提取基因组DNA；2)参考Genebank基因编码区序列，设计羊种3型布鲁氏菌外膜蛋白Omp31基因的引物，预计扩增目的片段长度为685bp，合成引物，上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；3)利用步骤1)提取的基因组DNA和步骤2)设计的引物进行PCR扩增，获得目的片段；4)琼脂糖凝胶电泳分离扩增所得PCR产物；5)切胶，回收目的DNA条带；6)将回收的PCR产物与pMD19-T载体连接，连接产物转化入感受态细胞，将转化菌均匀涂布于含IPTG和X-gal的LB氨苄青霉素固体培养基上过夜，次日挑白色菌落，进行扩大培养；7)从扩大培养的菌液中提取质粒，用BamHⅠ以及XhoⅠ进行双酶切鉴定，挑出阳性克隆，送上海华大基因科技有限公司进行测序，阳性克隆命名为pMD19-T-Omp31。其中，PCR扩增结果和酶切结果如图4～5所示。经测序确认，PCR反应扩增得到的基因为Omp31，其基因序列如SEQ ID No：3所示，该基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2、Omp31基因在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

双酶切Omp31基因，之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，再连接目的片段与同样经过双酶切的原核表达载体。将连接产物转化入感受态细胞中，随后将其涂布于含有抗生素的固体培养基上，挑取单菌落，提取质粒，通过PCR和双酶切以及测序的方式对Omp31原核表达载体进行鉴定。将经鉴定含有Omp31原核表达载体的阳性单克隆菌落进行扩大培养，加入诱导剂诱导Omp31蛋白的表达。培养结束后，收集培养液，离心收集菌体，提取并纯化蛋白，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，用考马斯亮蓝进行染色，观察Omp31基因在大肠杆菌中的表达情况。染色结果如图6所示。使用电转仪将SDS-PAGE胶面蛋白转移至NC膜，进行Western-blot检测。检测结果如图7所示。根据图6～7可知，本发明在大肠杆菌中成功表达出Omp31蛋白。

实施例3

Omp31基因的克隆、在真核细胞表达和鉴定

1、真核重组质粒的构建以及酶切鉴定

用EcoRⅠ和BamHⅡ分别酶切Omp31基因和pVAX1载体，连接酶切后的Omp31基因与pVAX1基因，构建Omp31-pVAX1真核表达载体。将该真核表达载体转化大肠杆菌，用EcoRⅠ和BamHⅡ进行双酶切鉴定，筛选阳性重组质粒，并测序。具体酶切检测结果如图8所示。根据图8可知，本发明成功构建出Omp31-pVAX1真核表达载体。

2、转染COS-7细胞以及免疫细胞化学鉴定

根据Invitrogen公司脂质体说明书进行，分别将Omp31-pVAX1、pVAX1载体转染COS-7细胞，然后置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养。转染24h后，收集COS-7细胞，通过免疫细胞化学的方法鉴定Omp31基因在真核细胞COS-7中的表达情况。具体检测结果如图9所示。根据图9可知，Omp31基因可以在真核哺乳动物的细胞中高表达。

实施例4

Omp31蛋白分子抗原表位预测结果

1、蛋白分子的理化性质

利用生物学软件DNAstar和ExPASy服务器的ProtParam分析羊种3型布鲁氏菌外膜蛋白Omp31分子的理化性质，结果如表2所示。

表2外膜蛋白分子的理化性质结果

2、蛋白分子的二级、三级结构

通过NPS@IBCP服务器的SOPMA和DNAstar软件预测Omp31分子的二级结构，预测结果如图10所示。根据图10可见，Omp31分子ɑ–螺旋占14.54％，β–转角占13.22％，无规卷曲占36.12％，延伸链占36.12％。

通过同源建模服务器SWISS-MODEL建立Omp31蛋白分子的三级结构。Omp31三级结构预测结果如图11所示。

3、蛋白分子表面的可能性

利用DNAstar的Emini法分析Omp31蛋白分子表面的可能性，预测结果如图12所示。结果显示：Omp31分子的氨基酸残基的46aa～53aa，107aa～112aa，126aa～129aa，160aa～165aa，181aa～197aa区段，它们分布在分子表面的可能性较大，因此成为分子的抗原表位的可能性也较大。

4、蛋白分子的亲水性

利用DNAstar的Hydropathy-Kyte-Doolittle法分析Omp31蛋白分子的亲水性，分析结果如图13所示。根据图13可见：上述蛋白分子的亲水性区分布均远远大于疏水区，从而有利于蛋白的表达。Omp31蛋白分子的一级结构中34aa～57aa，71aa～79aa，86aa～93aa，104aa～129aa，149aa～167aa，176aa～228aa区段为高亲水区；这些区域暴露于分子表面的几率较大，成为分子的抗原表位的可能性也最大。

5、蛋白分子多肽链骨架区的柔韧性

利用DNAstar的Karplus-Schulz法预测Omp31蛋白质分子多肽链骨架区的柔韧性，分析结果如图14所示。图14所示结果表明：Omp31分子的8aa～26aa，36aa～63aa，79aa～112aa，127aa～166aa，183aa～211aa区段，它们在空间发生扭曲、折叠的几率高，能够形成丰富的二级结构。所以蛋白分子的这些肽段形成分子抗原表位的可能性较大。

6、蛋白分子抗原指数分析

利用DNAStar的Antigenic Index-Jameson-Wolf法进行Omp31蛋白分子抗原指数分析，分析结果如图15所示。图15所示结果显示：它们的一级结构氨基酸序列中抗原指数显著的区段为Omp31的34aa～57aa，71aa～79aa，86aa～93aa，104aa～129aa，149aa～167aa，176aa～228aa区段。上述区段形成分子的抗原表位的可能性十分大，也是研究相应蛋白分子的抗原决定簇的主要对象。

7、蛋白分子B细胞抗原表位分析

利用CBS Prediction Servers中的BepiPred预测Omp31蛋白分子的B细胞抗原表位，整理后将临界值大于0.5的输出，可见Omp31蛋白含有9个潜在的的抗原表位，预测最高的区域位于7aa～23aa区段。分析结果如表3所示。

表3 Omp31蛋白分子B细胞抗原表位分析结果

本试验扩增外膜蛋白Omp31分子基因序列，测序后，用DNAMAN软件对其与一些存在交叉反应的革兰氏阴性细菌的同源性进行了分析，发现羊种布鲁氏杆菌3型的外膜蛋白Omp31与小肠耶尔森氏菌肠等可能与布鲁氏杆菌发生交叉反应的细菌序无同源性，从而避免与其它革兰氏阴性细菌的交叉反应。

大部分抗体只与蛋白质表面的部分结合，且大部分抗原决定簇是亲水性的，另许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域，因此通对布鲁氏杆菌外膜蛋白Omp31分子表面可能性、亲水性、柔韧性、抗原指数和B细胞抗原表位进行综合分析：亲水性最强的部位被认为是和单抗结合的部位，有利于和抗体结合。根据图示Omp31分子预测其抗原表位可能位于6个最亲水的部位。这些区域暴露于分子表面的几率较大，成为分子的抗原表位的可能性也最大，抗原以此与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。

抗体通常特异性地识别抗原蛋白质表面的特定区域，这些区域被称为B细胞表位。从空间结构上看，B细胞表位的不连续性的空间构象性表位，是由那些在空间结构上接近，但顺序上不连续的氨基酸组成，具有高度的空间依赖性，蛋白质的二级结构与蛋白质的表位分布有较大的关系。本研究发现Omp31蛋白表位富含环状结构，而缺失螺旋和折叠结构。因为环状结构要比其他形式的二级结构灵活，利于抗体的结合。

实施例5

布鲁氏菌Omp31DNA疫苗的免疫学特性研究

分别采用实施例3获得的DNA疫苗，即Omp31-pVAX1真核表达载体(Omp31组)、传统M5减毒疫苗(M5组)和生理盐水(生理盐水组)免疫小鼠并通过淋巴细胞增殖实验(MTS)、CTL细胞杀伤实验和ELISA方法研究Omp31组、M5组和生理盐水组的免疫学特性。

1、淋巴细胞增殖实验(MTS)

采用本领域常规的淋巴细胞增殖实验(MTS)检测Omp31组、M5组和生理盐水组免疫小鼠的淋巴细胞增殖指数，检测结果如图16所示。从图16中可以看出，Omp31组经刺激后，平均刺激指数为1.61，明显高于M5组(1.46，P＜0.05)和生理盐水组(0.92，P＜0.05)。

2、CTL细胞杀伤实验

采用Promega公司的CytoToxNonRadioactive Cytotoxicity Assay进行CTL细胞杀伤实验(具体方法参考其说明书)，检测结果用杀伤活性表示，计算公式如下：

CTL细胞杀死实验的检测结果如图17所示。从图17可以看出，Omp31组在不同的效靶比均可诱导T细胞介导的特异性杀伤作用，且CTL效应随着效靶比值的升高而增强；Omp31组在相同效靶比下，其CTL效应值高于M5组。实验结果说明本发明DNA疫苗抗原不但能够诱导特异性淋巴细胞增殖作用同时还能够增强诱导的非特异性淋巴细胞增殖作用，能够明显地特异性地刺激淋巴细胞增殖，并且本发明所述DNA疫苗具有比传统M5减毒疫苗更强的CTL细胞杀伤作用。

3、ELISA法检测免疫鼠血清抗体效价

采用间接ELISA方法检测免疫小鼠的多克隆抗体效价，将免疫后第2、3、4、5、6、7、8周的小鼠断尾采血，分离血清用保温液进行倍比稀释，间接检测血清效价，检测结果如图18所示。图18所示结果表明，在用DNA疫苗免疫小鼠后，血清效价从第一周开始开始上升，直到免疫后第4周达到最高峰，血清效价最高达到1:1560000，免疫效价持续到免疫后第7周，第八周开始逐渐下降。本发明所述DNA疫苗的抗体效价水平与抗体持续时间与M5减毒疫苗基本相当。

实施例6

DNA疫苗与佐剂的配合试验

将实施例3所获得的DNA疫苗与不同类型、不同用量的佐剂配合使用，免疫小鼠，进行淋巴细胞增殖实验，检测其免疫效力，实验结果如表4-6所述。

表4淋巴细胞增殖实验结果

其中，PI代表淋巴细胞增殖指数，1代表实施例3所制备的DNA疫苗，IL2、IL12、IFNγ、GM-CSF为细胞因子基因佐剂，ISCOMs代表免疫刺激复合物。

根据表4的实验结果可知，DNA疫苗与佐剂配合使用可以有效增强其免疫效力。其中，DNA疫苗与细胞因子基因佐剂，特别是IL2和IL 12细胞因子基因佐剂配合使用，能够特别有效地增强DNA疫苗的免疫效力。

表5淋巴细胞增殖实验结果

PI代表淋巴细胞增殖指数，1代表实施例3所制备的DNA疫苗，IL2为细胞因子基因佐剂，表5中所列比值为质量比。

表6淋巴细胞增殖实验结果

PI代表淋巴细胞增殖指数，1代表实施例3所制备的DNA疫苗，IL12为细胞因子基因佐剂，表6中所列比值为质量比。

根据表5-6的实验结果可知，DNA疫苗与IL 2、IL12细胞因子基因佐剂之间的质量比在1：1-5之间能够较好地提高免疫效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青海大学

<120> 一种针对羊种3型布鲁氏菌的DNA疫苗及其制备方法

<130> 11111

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatgacacca tatggccgac gtggttgttt ctgaac 36

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacacctcga gttagaactt gtagttcaga ccgac 35

<210> 3

<211> 666

<212> DNA

<213> Brucella melitensis

<400> 3

gccgacgtgg ttgtttctga accttccgcc cctactgctg ctcctgttga caccttctcg 60

tggaccggcg gctatatcgg tatcaacgcc ggttacgcag gcggcaagtt caagcatcca 120

ttttctagct ttgacaagga agacaacgaa caggtttccg gttcgctcga cgtaacagct 180

ggcggcttcg tcggtggtgt tcaggccggt tacaactggc agctcgacaa cggcgtcgtg 240

ctcggcgcgg aaaccgactt ccagggatcg agcgttacgg gttcgattta cgccggtgcc 300

agcggtctcg aaggcaaagc tgaaaccaag gtcgagtggt tcggcacagt tcgtgcccgt 360

cttggctaca cggctaccga acgcctcatg gtttatggta ccggcggtct ggcctatggt 420

aaggtcaagt ctgcgttcaa cctgggtgat gatgcaagtg ccctgcacac gtggtccgac 480

aagacgaaag ctggctggac cctcggcgct ggtgctgaat atgccatcaa caacaactgg 540

acgctcaagt cggaatacct ctacaccgac ctcggcaagc gcaacctcgt cgacgttgac 600

aatagcttcc ttgagagcaa ggtcaatttc cacactgttc gcgtcggtct gaactacaag 660

ttctaa 666

<210> 4

<211> 221

<212> PRT

<213> Brucella melitensis

<400> 4

Ala Asp Val Val Val Ser Glu Pro Ser Ala Pro Thr Ala Ala Pro Val

1 5 10 15

Asp Thr Phe Ser Trp Thr Gly Gly Tyr Ile Gly Ile Asn Ala Gly Tyr

20 25 30

Ala Gly Gly Lys Phe Lys His Pro Phe Ser Ser Phe Asp Lys Glu Asp

35 40 45

Asn Glu Gln Val Ser Gly Ser Leu Asp Val Thr Ala Gly Gly Phe Val

50 55 60

Gly Gly Val Gln Ala Gly Tyr Asn Trp Gln Leu Asp Asn Gly Val Val

65 70 75 80

Leu Gly Ala Glu Thr Asp Phe Gln Gly Ser Ser Val Thr Gly Ser Ile

85 90 95

Ser Ala Gly Ala Ser Gly Leu Glu Gly Lys Ala Glu Thr Lys Val Glu

100 105 110

Trp Phe Gly Thr Val Arg Ala Arg Leu Gly Tyr Thr Ala Thr Glu Arg

115 120 125

Leu Met Val Tyr Gly Thr Gly Gly Leu Ala Tyr Gly Lys Val Lys Ser

130 135 140

Ala Phe Asn Leu Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu His Thr Trp Ser Asp

145 150 155 160

Lys Thr Lys Ala Gly Trp Thr Leu Gly Ala Gly Ala Glu Tyr Ala Ile

165 170 175

Asn Asn Asn Trp Thr Leu Lys Ser Glu Tyr Leu Tyr Thr Asp Leu Gly

180 185 190

Lys Arg Asn Leu Val Asp Val Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ser Lys Val

195 200 205

Asn Phe His Thr Val Arg Val Gly Leu Asn Tyr Lys Phe

210 215 220