一株含油污泥降解功能菌及其应用的制作方法

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株含油污泥降解功能菌以及使用该功能菌降解油污的方法。
背景技术：
：含油污泥是石油石化行业在石油开采、储运和炼化等生产过程中产生的主要污染之一，它是影响油田及周边环境质量的一大难题，其处理与处置一直是人们关注的热点。含油污泥性质粘滞性、比阻和可压缩性系数均较大，具有污染严重、处理难度大的特点。含油污泥的来源主要是油田开采过程、油田集输过程和炼油厂污水处理厂。目前我国每年产生的含油污泥总量已超过500余万吨，并且产量还呈现逐年增加的趋势。含油污泥中除含有大量残留油类外，还含有苯系物、蒽、酚类、芘等有毒物质，大量的寄生虫、病原菌以及Cr(27～80mg/kg)、Cu(32～120mg/kg)、Pb(0.001～0.120mg/kg)等重金属，以及多氯联苯、二噁英、放射性元素等有毒有害物质。含油污泥体积庞大，若不进行处理而直接排放，会占用大量耕地，而且对周围的水体、土壤、空气都会造成严重污染。这些污染物还能通过食物链在动植物和人体内逐级富集，造成严重的危害。生物修复技术通过几十年的实践应用成为一项重要的污染治理技术，它的原理是通过微生物的新陈代谢将污染环境中的有毒有害物质降解转化，因而它是能从根本上消除含油污泥污染并不产生二次污染的绿色环保技术。生物修复技术的关键是筛选出能够高效降解目标污染物的微生物。石油烃类的化学成份有四类,按生物降解由易到难的顺序依次为饱和烃、芳香烃、氮硫氧化合物和沥青质，因此石油烃类的生物降解速度因烃类的化学组份不同而存在明显差异。Sood等筛选出新型酵母菌株TERIASN6降解被酸性含油污泥污染的土壤，生物降解135d后对土壤中总石油烃(初始含量为160g/kg)的降解率为81.99％(SoodN，PatleS，LalB.Bioremediationofacidicoilysludge-contaminatedsoilbythenovelyeaststrainCandidadigboiensisTERIASN6[J].EnvironSciPollutRes，2010，(17):603－610.)。宋绍富等筛选出的含油污泥降解菌YC-1与YC-13，35d对含油污泥(初始油质量分数为15％)降解率分别为43.41％和54.02％(宋绍富，杜雯，屈撑囤，含油污泥微生物堆制处理研究[J].西安石油大学学报，2011，26(3)：86-88.)。耿雪丽等从孤东油田原油污染的土壤中筛选出3株可以降解原油的细菌用于含油泥砂的降解，10d后含油量由最初的12.3％降至2.9％(耿雪丽，汪卫东，王新，等，用于处理含油泥砂的菌种性能实验研究[J].油气田环境保护，2005，15(2):37～39.)。生物技术与物理化学处理技术相比，且具有成本低，节约能源，无二次污染的特点，但其缺点是修复周期长。技术实现要素：本发明的目的包括：提供一种可降解含油污泥的微生物；提供该该微生物降解含油污泥、去除环境中的原油污染物和/或生物修复原油污染地下水中的用途；提供一种含油污泥的生物处理或生物降解方法；提供一种快速降解含油污泥的方法。本发明公开了一株克雷伯菌属(Klebsiellasp.)细菌，微生物保藏编号为CGMCC13201；其16SrDNA的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。同时，本发明提供了该克雷伯菌属细菌的用途，图降解原油污染物的用途；所述原油污染物包括含油污泥、原油污染物和/或原油污染的地下水。此外，本发明还提供了一种降解含油污泥的方法，包括：将克雷伯菌属(Klebsiellasp.)细菌CGMCC13201的菌悬液接种至含油污泥中恒温培养；其中，可向含油污泥中添加适当的水，例如，5g含油污泥，添加30ml水，CGMCC13201菌悬液的接种量为10％(体积比)。其中，所述克雷伯菌属细菌CGMCC13201的培养PH值为5～9，优选为PH值为7；所述克雷伯菌属细菌CGMCC13201的培养温度为33～37℃，优选为35℃。本发明公开了一株从原油中筛选得到的克雷伯菌属(Klebsiellasp.)细菌。该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC13201，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株在本发明及实验中可简称为C-5。本发明同时公开了该菌株16SrDNA的核苷酸序列。基于该序列，可鉴定克雷伯菌属菌株CGMCC13201。本发明公开的克雷伯菌属菌株CGMCC13201可用于降解原油污染物；包括含油污泥、被原油污染的地下水，及环境中其他原油污染物的用途。有益效果从环境保护的角度出发，针对含油污泥等原油污染物的无害化处理选用成本低，简单操作无二次污染的生物技术，对于含油污泥等的处理具有重要的社会经济效益。本发明提供的微生物克雷伯菌属菌株CGMCC13201，可提高降解效果，缩短修复时间，达到快速修复的目的。微生物材料保藏本发明所述枯克雷伯菌属(Klebsiellasp.)细菌，于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC13201，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。附图说明图1不同温度下C-5菌株对油污的降解情况图2不同pH下C-5菌株对油污的降解情况图3C-5菌株对含油污泥的降解曲线图4PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果图5C-5菌株发育树图谱图6不同N-P比下菌株对原油的降解率图7不同Nacl浓度下菌株对原油的降解率具体实施方式本申请实施例涉及的原油降解率计算公式如下：原油含量通过非分散红外法进行测定；在计算时忽略降解过程中微生物吸附的影响。实施例1、含油污泥降解菌C-5的分离、纯化及鉴定(一)培养基的配制富集培养基：LB培养基，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0-7.2，如配固体培养基，需加入琼脂2％。无机盐培养基：NaCl1.0g，(NH4)2·SO40.617g，KH2PO40.50g，K2HPO41.0g，MgSO40.50g，CaCl20.1g，KCl0.10g，FeSO4·7H2O0.01g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0-7.2，如配固体培养基，需加入琼脂2％。选择培养基：无机盐培养基+琼脂+0.1％油驯化培养基：无机盐培养基+琼脂+(0.1％，0.2％，0.5％，1％)油复筛培养基：无机盐培养基+1％油以上培养基使用前均在121℃高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。(二)样品来源：含油污泥：取自四川珙县油田被石油污染土壤。原油：从含油污泥中提取出来的原油。(三)分离和纯化步骤：筛选步骤：富集：称取10g土壤，加90ml蒸馏水，搅拌均匀，采用移液枪取10ml混合液加至装有100mlLB富集培养基的锥形瓶中，用硅胶塞封口，然后将锥形瓶放入恒温培养箱中，35℃，190rpm/min恒温培养24h后，取10ml浑浊富集液接入到新鲜的LB培养基中，在相同的条件下连续富集3代。富集液采用梯度稀释法经选择培养基进行选择培养24h后，分离获得的单一菌株再经驯化培养基、复筛培养基进行驯化、复筛和纯化，将生长快、生长量大、降解率较高的菌株接于斜面上，4℃低温保存备用。进一步接种至原油复筛培养基中测定其原油降解能力，最后得到一株高效含油污泥降解菌C-5。菌悬液的制备：接种前，将菌株C-5富集培养基富集培养，将处于对数生长期的菌液以8000rpm离心10min，用磷酸盐缓冲液(PH7.0)洗涤3次并稀释。以珙县油田含油污泥提取出原油为唯一碳源筛选出的高效含油污泥降解菌C-5，LB平板培养后观察其形态特征。细菌的形态鉴定结果表明，菌株C-5呈杆状，格兰氏染色结果为阴性。表1含油污泥降解菌表性特征观察(四)含油污泥降解菌C-5的分子生物学鉴定：1、反应物准备：试剂盒采用2、PCR反应体系及程序：以1μL的菌株基因组DNA为模板利用PCR技术扩增，设立50μL的反应体系：2μLTemplate25μL2×TaqPCRMasterMix通用引物27F和1492R各1.6μL19.8μL无菌去离子水PCR反应程序：95℃预变性5min；29个循环(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，)；72℃延伸5min，12℃保温10min。3、核酸凝胶电泳得到的PCR产物进行凝胶电泳测试，试验方法如下：(1)将制胶槽膜置于电泳槽中，于制胶槽膜中放置好预定规格的梳子。(2)于三角烧瓶中以1×TAE电泳缓冲液配制1％的琼脂糖溶剂25ml，放入微波炉加热至琼脂糖溶解，取出摇匀。(3)待琼脂糖胶泠却至约60℃左右时，加入0.25μL溴化乙锭(EB)，摇匀。将凝胶倒入制胶槽中，使凝胶的厚度约在5mm左右，制胶过程中注意避免气泡。待凝胶固后，移去梳子。(4)加入足量TAE缓冲液，保证液面高于胶面。(5)将样品与溴酚蓝液按5：1混合后，加到胶孔中。(6)开启电泳仪，当酚蓝条带移动到距凝胶另一端约2cm处时，停止电泳。取出凝胶，于凝胶成像系统上观察电泳结果。5、PCR产物纯化根据凝胶电泳实验的结果，切割含有目的DNA的琼脂糖凝胶进行纯化：(1)称量胶块重量，计算胶块体积。向胶块中加入3倍体积溶胶液PN。50℃水浴放置10分钟，直至胶块完全溶解。(2)进行柱平衡：向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。(3)将步骤(1)所得溶液加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心60S，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。(4)向吸附柱中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。重复本操作一次。然后将吸附柱放回收集管中再次以12000rpm离心2min，以达到完全去除漂洗液的目的。吸附柱于室温下放置数分钟至彻底晾干。(5)将吸附柱放置到干净离心管中，向吸附膜中间位置滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。(6)将步骤(5)所得DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳检测浓度与纯度。6、测序并构建系统发育树将最终获得的目的DNA送上海生工生物有限公司进行16SrDNA测序，对所获得的核苷酸序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库中的核酸序列进行BLAST比对分析。应用MEGA软件(version5)构建菌株和亲缘关系较近菌属的系统发育树；结果如附图5所示。：以临近连接法(Neighbor-joiningmethod，NJ法)聚类：Bootstraping法进行检验，重复1000次。序列在线BLAST地址：http://blast.ncbi.nih.gov/blast.cgi.利用PCR技术对新筛选出的原油降解菌C-5的基因序列进行分析。菌株C-5的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析和纯化后，结果如图4所示。本发明的含油污泥降解菌C-5的16SrDNA基因全长为1051bp，PCR扩增得到的序列如序列表SEQIDNO.1所示。将该序列提交GenBank数据库进行BLAST对比并将序列提交保存。实施例2含油污泥降解菌C-5的性能测定。(1)不同温度下菌株对原油的降解将C-5菌株的菌悬液按10％(v/v)接种量接入无机盐培养基，并添加原油含量至1000mg/L。以等量磷酸盐缓冲液(pH)代替菌悬液，作为对照。设置5组不同反应温度分别为：15℃，25℃，30℃，35℃，40℃，考虑不同温度下C-5菌株对原油的降解能力。将样品置于恒温培养箱中以190rpm，35℃培养7d后，测定样品中的原油含量，计算降解率。本实验及下文中涉及的所有实验组均设有3个平行以及空白对照组。实验结果见说明书附图1温度是影响微生物生长、繁殖和新陈代谢的一个重要因素，改变温度必然会影响微生物体内所进行的多种生物化学反应，主要是影响酶的活性。因此，微生物生长繁殖必须有其适宜的温度范围，最适生长温度可能是由温度对生物体内无数个酶反应的综合作用决定的。图1显示，温度对C-5菌株含油污泥降解能力影响非常显著。本次试验中设置范围内(15℃～40℃)，在温度35℃的时候对含油污泥的降解效果最好。在温度15℃和40℃时对含油污泥的降解效果下降明显。(2)不同pH条件下菌株对原油的降解无机盐培养基的pH分别为3.0，5.0，7.0，9.0和11.0，其余设置同(1)中所述进行降解实验。反应在(1)中得到的最适温度下进行，190rpm，35℃培养7d后，测定样品中的原油含量，计算降解率。在35℃的反应温度下，水体环境的不同初始pH值(3.0，5.0，7.0，9.0和11.0)对菌株C-5降解含油污泥效能的影响如图2所示。C-5在pH为7.0时，降解率最高，而pH为11.0的降解率高于pH为3.0时的降解率，可能是因为菌株对烃类化合物的降解有-COOH类化合物的中间产物生成，中和部分-OH，酶的活性未受到影响。(3)不同N-P比下菌株对原油的降解将菌株C-5的菌悬液按10％(v/v)的接种量接入原油培养基中，初始原油浓度为1000mg/L，反应在35℃、pH7.0的条件下进行，并以等量磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)代替菌悬液，作为对照。设置6组不同N元素含量，分别为75mg/L、350mg/L、700mg/L、1400mg/L、2800mg/L、5600mg/L，磷元素浓度为58mg/L(折合PO43-的浓度约为177mg/L)，考察不同N-P比下降解功能菌对原油的降解能力。将样品置于恒温培养箱中以190rpm/min，35℃培养7d后，测定样品中的原油含量，计算降解率。结果如图6所示，功能菌C-5在P含量不变的情况下，N元素的不同添加量，表现出的降解率不同。N元素含量350～1400mg/L时，降解率相对较大，N元素700mg/L时降解率最高，按质量的计算N、P比在(6～24):1之间，最大降解率在12：1。继续增大N元素的添加量提高N:P，降解率呈现下降的趋势，是因为营养物质过剩，抑制了降解功能菌的生长繁殖，进而导致降解率下降。(4)不同Nacl浓度下菌株对原油的降解将菌株C-5菌株的菌悬液10％(v/v)的接种量接入原油培养基中，初始原油浓度为1000mg/L，反应在35℃、pH7.0、N-P比为12:1的条件下进行，并以等量磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)代替菌悬液，作为对照。设置6组不同NaCl含量分别为0.1％、0.5％、1％、3％、6％、10％，考察不同盐浓度下降解功能菌对原油的降解能力。将样品置于恒温培养箱中以190rpm/min，35℃培养7d后，测定样品中的原油含量，计算降解率。结果如图7所示，随着NaCl含量的增加，功能菌C-5降解率呈现先增加后降低的一个趋势，在NaCl含量为0.5％时生长最佳，其降解率都达到最高；随着盐浓度的增加其降解率呈现下降的趋势，在NaCl含量为10％时，菌种已基本不能生存。(5)菌株对含油污泥的降解实验反应体系为：5g含油污泥、30ml水、接种量10％，190rpm/min，35℃反应18d。在上述实验得到的最适温度(35℃)、pH(PH值为7)、N-P比(12:1)和盐浓度(0.5％,即5g/L)条件下进行降解实验，190rpm摇床震荡培养，定期取样测定样品中的原油残留浓度，绘制菌株对原油的降解率曲线。根据温度和初始pH值的实验结果，在降解菌C-5的最适温度(35℃)、pH(PH值为7)、N-P比(12:1)和盐浓度(0.5％，即5g/L)条件下测定对含油污泥的降解率曲线，实验结果如图3所示。降解反应18d后，C-5对含油污泥的去除率达到48.93％。实施例3C-5功能菌对油基泥浆钻井岩屑有机成分的降解对比实验实验方法C-5功能菌降解实验组：准备5个500ml锥形瓶，分别称取50g油基泥浆钻井岩屑，每组锥形瓶加入一定量的无机盐培养基，保持含水率在86％左右，各菌株在其最适pH(7.0)，最适温度(35℃)、最适N-P比(12:1)及最适NaCl浓度(0.5％，即5g/L)下，按接种量10％分别接入功能菌C-5，在190rpm/min，35℃摇床中培养15d后，将油基泥浆钻井岩屑5000rpm/min离心10分钟，倒去上清液，油泥自然风干。将风干后的油泥置于250ml锥形瓶中，加入100ml石油醚(30-60℃)在摇床中20℃萃取2h，静止后取出上清液，密封好，置于4℃冰箱中，重复5次。将5次萃取液混合5000rpm离心5min，采用旋转蒸发仪回收石油醚并得到降解后的油品。将得到的石油类有机质混合物送至四川大学测试分析中心进行GC-MS组分分析。空白对照组：取相同油基泥浆钻井岩屑，以相同实验步骤，仅是不接种C-5功能菌，重复上述实验方法，得到含油污泥空白对照组处理后的油品。将得到的石油类有机质混合物送至四川大学测试分析中心进行GC-MS组分分析。GC-MS分析实验条件色谱条件:色谱柱为30m×0.32mm的OV-101石英毛细管柱，柱温40℃，停5min再以10℃/min升至150℃，停2min再以5℃/min升至290℃，汽化温度290℃，检测温度270℃，载气N2，柱前压0.4kg,检测器FID。质谱条件:离子源为电子轰击源(EI)、电子能量70eV、加速电压3kV、分辨率1000、真空度1.33×10-4Pa，进样系统温度190℃、电离室温度250℃、扫描范围m/z22—600。实验结果表2-1含油污泥空白对照有机物中各组分分子式和名称分子式名称分子式名称C14H10蒽C20H422,6,10,14-四甲基十六烷C15H32十五烷C20H422,6,10,14-四甲基十六烷C15H322,6,11-三甲基十二烷C21H44二十一烷C16H34十六烷C24H50二十四烷C16H34O2-己基-1-癸醇C26H54二十六烷C18H38十八烷C43H88四十三烷C19H40十九烷C44H90四十四烷表2-2含油污泥经C-5处理后有机组分化学式及名称经C-5处理后的含油污泥有机成分GC-MS谱图表明：C-5处理后的含油污泥中油的组分的保留时间在18～46min内均有峰出现，说明有机质组分复杂，共检测出20种有机质组分。在保留时间18～39min之间主要有机质组分为C11～C24的烷烃类，环烷烃类，酯类等17种有机物；在保留时间39min～46min之间的有机物组分主要为C31，C43，C44高分子直链烷烃类3种有机物。经C-5处理后的含油污泥有机成分GC-MS谱图与空白对照组有机成分GC-MS谱图相比，，经C-5处理后的含油污泥有机成分GC-MS谱图出现峰时的保留时间向后推移了2min，且在16.9～39min保留时间内出现的峰高及峰面积，均降低，但在39～46min保留时间内出现的峰高及峰面积基本没有变化；表2-2相对于表2-1中增加了C11～C19的支链烷烃类、酯类、醇类及环己烷类等有机物，缺失了十五烷、十八烷和十九烷，对应图谱分析十六烷、十七烷、二十一烷、二十四烷减少了，说明功能菌C-5对C15～C19直链烷烃及C21和C24直链烷烃有较好的降解效果，产生支链烷烃类、酯类、醇类及环己烷类等中间产物。序列表<110>成都理工大学<120>一株含油污泥降解功能菌及其应用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1080<212>DNA<213>克雷伯菌属（Klebsiellasp.）<400>1gaaatggcggcagctaccatgcagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgac60gagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactgg120aaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcat180gccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggctcacctaggcga240cgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagac300tcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatg360ccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcgaggaggaaggcatta420aggttaataaccttagtgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgcc480agcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgca540cgcaggcggtctgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttg600aaactggcaggcttgagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgc660gtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctca720ggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacga780tgtcgacttggaggttgttccctttgaggagtggcttccggagctaacgcgttaagtcga840ccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaatgaattgacgggggcccgcacaag900cggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatcc960agagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggactctgagacaggtgctgcatggct1020gtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcc1080当前第1页1 2 3