鱿鱼胶原多肽及其铁络合物的制备方法和应用与流程

本发明属于涉及医药技术领域，更具体地讲，涉及鱿鱼胶原多肽及其铁络合物的制备方法和应用。

背景技术：

鱿鱼(Loligo chinensis)为软体动物门枪乌贼属海洋生物。广泛分布于我国的南海和东南亚海域。其营养丰富，蛋白质含量高，可加工为多种美味食品。鱿鱼加工过程中，除去外皮，鱿鱼皮往往作为废弃物。国内外研究发现，鱼类加工过程中废弃物占总量的30％左右，其中含有丰富的蛋白质资源，以胶原蛋白为主，其水解产物含有多种活性肽。活性肽有抗肿瘤、抗溃疡、降血压、促进骨形成、促进皮肤代谢和增强免疫等生理和药理活性。在医药、保健及美容化妆方面具有良好的应用前景。对鱼类下脚料胶原蛋白的研究在国内开展不多，往往作为废弃物处理，造成生物资源浪费和环境污染。我国胶原产品通常从屠宰动物的废料中制取，水产动物中的胶原蛋白肽的利用一直是空白。利用现代生物技术提取胶原蛋白多肽，提高生物活性，进一步开发医药、保健及美容化妆品的原料，国内外目前未见有过报道。将海产鱼类下脚料提取胶原蛋白并制备新的活性胶原多肽，进行结构修饰，既能满足各行业对胶原蛋白多肽的需求，又能提升水产品的附加值并使废弃物再利用，保护环境，对水产业发展提供广阔的前景。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供鱿鱼胶原多肽的制备方法。

本发明的第二个目的在于提供鱿鱼胶原多肽铁络合物的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供鱿鱼胶原多肽好和鱿鱼胶原多肽铁络合物。

本发明的第四个目的在于提供鱿鱼胶原多肽及其铁络合物的应用。

为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：鱿鱼胶原多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)取新鲜鱿鱼皮绞碎置高压反应锅内，加入质量百分比为2-10％的醋酸水溶液，边加边搅拌，搅拌均匀后蒸汽加热，温度控制在110-130℃，水解1-3小时后立即停止加热，让其自然降温至105℃以下；

(2)缓慢开启放气阀，打开加料口加入活性炭，90～100℃保温20-60分钟，然后离心，离心液浓缩至1/3—1/5重量得到浓缩液1；

(3)步骤(2)获得的浓缩液1冷却到室温后，加入3-5倍重量的乙醇，边加边搅拌，让其沉淀过夜，沉淀液离心，滤液再压滤，滤液回收乙醇并浓缩至1/9—1/11重量得到浓缩液2，将浓缩液2喷雾干燥，得橙黄色疏松固体即为鱿鱼胶原多肽(SP-1)。经质谱分析，含有20余种肽类成分。

作为一个优选方案，步骤(1)水解1小时。

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：鱿鱼胶原多肽铁络合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将上述鱿鱼胶原多肽溶于蒸馏水中，磁力搅拌下缓慢地加入重量百分比2.8％硫酸亚铁水溶液，室温反应3h-4h；

(2)反应液过滤后，向滤液中加入3-5倍重量的乙醇进行沉淀，2h后抽滤，无水乙醇洗涤，滤渣于室温真空干燥除乙醇，干燥物复用蒸馏水溶解，冷冻干燥，得棕黄色鳞片疏松物即为鱿鱼胶原多肽铁络合物(SP-F)。得率为47.2％。

为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述鱿鱼胶原多肽的制备方法制备获得的鱿鱼胶原多肽，以及，利用上述鱿鱼胶原多肽铁络合物的制备方法制备获得的鱿鱼胶原多肽铁络合物。

为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案：的鱿鱼胶原多肽在制备耐缺氧药物或耐缺氧食品中的应用，以及，鱿鱼胶原多肽铁络合物在制备耐缺氧药物或耐缺氧食品中的应用。

本发明的优点在于：本方法较之传统的硫酸和盐酸水解法，具有反应条件稳定，易于控制，无污染物排放，符合清洁化生产。本发明从鱿鱼下脚料鱼皮等海产鱼类下脚料中提取胶原蛋白并制备新的活性胶原多肽，进行结构修饰，既能满足各行业对胶原蛋白多肽的需求，又能提升水产品的附加值并使废弃物再利用，保护环境，对水产业发展提供广阔的前景。动物实验表明，鱿鱼胶原多肽(SP-1)及其铁络合物(SP-F)可显著提高耐缺氧存活时间；增加体内乳酸脱氢酶活性；减少体内血乳酸和血尿素氮的含量。本发明制备的SP-1和SP-F可显著提高耐缺氧活性，可用于制备耐缺氧药物及功能食品，对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。

附图说明

图1为耐缺氧存活时间。

图2为乳酸脱氢酶活性。

图3为血乳酸含量。

图4为血尿素氮检测。

图5质谱测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.鱿鱼皮胶原多肽的制备

新鲜鱿鱼皮200Kg，用绞肉机绞碎。绞碎的鱿鱼皮置高压反应锅内。加入1200L的3％醋酸水(即水1160L，冰醋酸36Kg或72瓶500ml的冰醋酸混合而成)，边加边搅拌，直到加完为止。醋酸水加完并搅拌均匀后，开始加热，温度控制在121℃，水解1小时后，立即停止加热，让其自然降温至～105℃，然后缓慢开启放气阀，打开加料口，加入2.5Kg活性炭，90～100℃保温20分钟。然后离心，离心液浓缩至300L左右。浓缩液冷却到室温后，加入3倍量(V/V)95％乙醇，边加边搅，让其沉淀过夜。沉淀液离心，滤液再压滤。滤液回收乙醇并浓缩至200L左右，浓缩液再喷雾干燥，得橙黄色疏松固体(鱿鱼胶原多肽)4.5公斤。

质谱测定结果：采用直接进样法，胶原总多肽经质谱负离子谱和正离子谱测定，胶原总多肽在分子量170-1334.5的范围内，含有20余种寡肽类成分。质谱分析见图5。

实施例2.鱿鱼皮胶原多肽的制备

新鲜鱿鱼皮100Kg，用绞肉机绞碎。绞碎的鱿鱼皮置高压反应锅内。加入600L的8％醋酸水(即水580L，冰醋酸18Kg混合而成)，边加边搅拌，直到加完为止。醋酸水加完并搅拌均匀后，开始加热，温度控制在110℃，水解1小时后，立即停止加热，让其自然降温至～105℃，然后缓慢开启放气阀，打开加料口，加入1Kg活性炭，90～100℃保温20分钟。然后离心，离心液浓缩至150L左右。浓缩液冷却到室温后，加入3倍量(V/V)95％乙醇，边加边搅，让其沉淀过夜。沉淀液离心，滤液再压滤。滤液回收乙醇并浓缩至200L左右，浓缩液再喷雾干燥，得橙黄色疏松固体(鱿鱼胶原多肽)2.3公斤。

实施例3.鱿鱼胶原多肽铁络合物的制备

将鱿鱼皮水解肽30.00g溶于120mL的蒸馏水中，加入2.8％硫酸亚铁溶于30mL。在磁力搅拌下，将硫酸亚铁溶液缓慢地加入鱿鱼皮水解肽溶液中，室温反应3h。反应液用脱脂棉过滤后，向滤液中加入3倍量的95％乙醇，进行沉淀。抽滤，无水乙醇洗涤两次，滤渣于室温真空干燥(除乙醇)。复用420mL蒸馏水溶解，冷冻干燥，得鱿鱼皮水解肽亚铁盐(棕黄色鳞片疏松物)。得率为47.8％。

实施例4.鱿鱼胶原多肽铁络合物的制备

将鱿鱼皮水解肽100.00g溶于400mL的蒸馏水中，加入2.8％硫酸亚铁100mL。在磁力搅拌下，将硫酸亚铁溶液缓慢地加入鱿鱼皮水解肽溶液中，室温反应3h。反应液用脱脂棉过滤后，向滤液中加入3倍量的95％乙醇，进行沉淀。抽滤，无水乙醇洗涤两次，滤渣于室温真空干燥(除乙醇)。复用1400mL蒸馏水溶解，冷冻干燥，得鱿鱼皮水解肽亚铁盐(棕黄色鳞片疏松物)。得率为48.1％。

实施例5.鱿鱼多肽耐缺氧动物试验

1.研究材料

1.1实验动物：昆明小鼠，雄性，6-8周龄，18-22g，每组8只，高浓度组9只。

1.2试剂和药物：血乳酸试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒和血尿素氮试剂盒(由南京建成公司提供)；维拉帕米(由天津市中央药业有限公司提供)，受试样品SP-1(鱿鱼胶原多肽)和SP-F(鱿鱼胶原多肽铁络合物)由第二军医大学易杨华教授课题组制备。

1.3实验仪器：酶标仪，离心机。

2.实验方法

小鼠随机分为8组，对照组：两个受试样品SP-F和SP-1，分设：50mg/kg,100mg/kg，200mg/kg3个剂量组，耐缺氧实验阳性药物(维拉帕米)和生理盐水对照组。每天灌胃给药，维拉帕米注射给药，共21天。末次给药1h后，小鼠逐只放入盛有20g钠石灰的125ml广口瓶中，石蜡密闭瓶口，记录小鼠存活时间。

小鼠死亡后立即心脏取血，按照试剂盒说明，进行血尿素氮、血乳酸含量和乳酸脱氢酶活性检测。

实验数据采用SPSS 13.0软件处理

3.实验结果

表3.1各组动物存活情况

表3.2耐缺氧存活时间(s)

表3.3乳酸脱氢酶活性

表3.4血乳酸含量

表3.5血尿素氮检测

表3.6脏器指数(mg/g)

表3.7体重监测

以上实验结果表明，实验过程中，小鼠的存活率、体重和各脏器指数均未见明显改变；耐缺氧存活时间：SP-1的50mg/kg和100mg/kg剂量组以及SP-F的100mg/kg剂量组比生理盐水组显著延长；乳酸脱氢酶活性：SP-1的100mg/kg剂量组显著增加；血乳酸含量：SP-1的50mg/kg和100mg/kg剂量组以及SP-F的50mg/kg和100mg/kg剂量组比生理盐水组显著减少；血尿素氮含量:SP-1的50mg/kg剂量和SP-F的200mg/kg剂量组比生理盐水组显著减少。实验结果显示SP-1和SP-F均有明显的耐缺氧活性，可用于制备耐缺氧药物及功能食品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。