一种促蓝莓富硒的菌根真菌的筛选方法及其鉴定方法及其应用与流程

本发明属于菌种鉴定及应用领域，涉及一种促蓝莓果实富硒的菌根真菌的筛选方法及其鉴定方法及其应用。

背景技术：

蓝莓即越橘(Vaccinium uliginosum)又名笃斯，野生蓝莓被称为都柿(大小兴安岭、伊春)属于杜鹃花科(Ericaceae)越桔属，原产于北美，约有450种。蓝莓可分为矮丛、半高丛、高丛和兔眼蓝莓四大类。蓝莓果实中富含有丰富的熊庶果甙、花青素、黄酮等多种具有抗氧化性能的多酚类生理活性成分，被誉为“浆果之王”。蓝莓的栽培土壤是酸性土壤(PH 4.0～5.0)，根细缺少根毛，接触面积小，分布浅，吸收能力较弱。自然条件下，菌根真菌能与植物形成互利共生的关系，因而筛选出有益的菌根真菌能够促进兔眼蓝莓对营养元素的吸收，有助于蓝莓生长和提高果实营养价值，改良蓝莓根系微生物环境以及增强蓝莓的生长势和对病虫害的抵抗能力。

硒是人体必需的微量元素之一,其生理功能主要表现为硒蛋白和硒酶的抗氧化作用。中国是一个缺硒大国，占中国国土面积的72％地区存在一条低硒地带，其中30％为严重缺硒地区，粮食等天然食物硒含量较低。华北、东北、西北等大中城市都属于缺硒地区。我国通过人群补硒成功防治了多种疾病,如克山病、大骨节病、心血管病、肝病及肿瘤等。利用生物转化途径生产具有较高生物活性的有机硒可降低无机硒的毒性。而蓝莓果实本身就是高营养价值的浆果，作为硒生物有机化的载体前景将十分广阔。

Read等1978年从蓝莓植株上分离得到一株菌根真菌，通过对其侵染特性及回接试验，结果表明菌根真菌对蓝莓的生长有明显的促进作用。Kosola等2007年研究表明接种菌根真菌后，蓝莓对硝态氮的吸收能力会增强。2010年刘燕从红豆越橘中分离得到两株菌根真菌，将其混合接种到蓝莓幼苗上，80天后进行测定，发现接种菌根真菌的幼苗总干重和叶片数分别比未接种对照增加76.1％和60.7％；同时接种后蓝莓幼苗地上部分和低下部分对氮磷的吸收有所增加，接种处理明显改善蓝莓幼苗的生长状况。袁继鑫等2013年分离得到15个菌株接种到蓝丰实生苗上，表明对蓝莓幼苗生长有促进作用，增加了对氮磷钾元素的吸收。

目前市场上富硒水果的硒含量为10-50μg/kg.蓝莓果实本身营养价值很高，但因根系弱、酸性土壤而影响了对硒的吸收。因此，利用菌根真菌促进蓝莓根部无机硒的转化吸收，是蓝莓富硒的有效途径。

鉴于以上分析，本发明从蓝莓根际中分离出了促蓝莓富硒的菌根真菌并进行了分子鉴定，同时，对分离纯化的菌根真菌进行了蓝莓苗期及植株生长期的侵染实验。

技术实现要素：

本发明的目的是为了获得有利于酸性土壤蓝莓富硒的菌根真菌，以便培育出高营养价值的富硒蓝莓，用于蓝莓的商业生产，提供一种促蓝莓果实富硒的菌根真菌的筛选方法及其鉴定方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种促蓝莓富硒的菌根真菌的筛选方法，其特征包括以下步骤：

(1)将采集到的蓝莓菌根进行消毒处理后，置于pH6-8含抗生素的PDA固体培养基上，在温度25～30℃恒温培养箱中培养，将分离得到的菌根真菌接种到含有抗生素的PDA培养基上进行纯化培养，纯化后的菌株接种于PDA斜面，3-4℃保藏备用；

(2)将步骤(1)所得的菌根真菌回接到蓝莓幼苗和植株上，通过量子共振和ICP-MS检测蓝莓的叶片和果实营养元素的含量，选择促进蓝莓富硒的菌根真菌，即可。

所述的促蓝莓富硒的菌根真菌的鉴定方法，其特征在于，

将筛选后的菌根真菌通过分子生物学和形态学方法进行鉴定,确定菌根真菌种类。

所述的促蓝莓富硒的菌根真菌的鉴定方法，其特征在于，

分子生物学鉴定方法为：将筛选后的菌根真菌进行基因组抽提，以真菌rDNA的ITS序列作为通用引物进行PCR扩增.将测序获得的序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，对搜索结果中同源性大于97％的序列运用CLUSTAL-W软件进行序列匹配分析，对结果运用MEGA6软件中的Neighbor-joining法构建系统发育树，确定菌根真菌的系统发育地位，即可。

所述的促蓝莓富硒的菌根真菌的鉴定方法，其特征在于，

确定有利于蓝莓富硒的菌根真菌为毛霉科毛霉属卷枝毛霉种M ucor circinelloides(编号：CANV)。

所述的促蓝莓富硒的菌根真菌的应用，其特征在于，

其可用于制备菌根真菌制剂，应用到蓝莓的生产上。

接种该菌株蓝莓植株果实的Se含量可达0.09-0.16μg/g，其他营养元素Ca、Fe、Zn、Mg、Mn等营养元素含量有一定比例的提高；接种该菌株的蓝莓幼苗成活率、苗高、叶片N、P、K含量也相应提高。

所述的该菌根真菌的分离方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：将采集到的蓝莓菌根真菌剪成3～4cm根段后用双蒸水清洗，再放在规格为90mm的培养皿中用75％酒精、75％酒精和0.1％升汞结合进行表面灭菌，灭菌后的根样用灭过菌的剪刀剪成0.5cm放在含有链霉素的PDA培养基中培养，培养皿规格为90mm，在温度25～30℃恒温培养箱中培养，培养3～5d，用接种针挑选单菌落放入含链霉素的PDA培养基上进行纯化培养，纯化后的菌株接种于PDA斜面，4℃保藏。

所述的营养元素含量测定，其特征在于包括以下步骤：步骤(2)采用，电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测量果实总硒和营养元素含量；采用量子共振法检测蓝莓叶片Se、N、P、K相对含量。

所述的蓝莓硒和营养元素含量的测定方法为：

取0.3g富硒蓝莓果实干粉，加9～11ml消化液摇匀后，所述的消化液为浓硝酸：高次氯酸＝4:1配置得到，放置过夜，置于电热板上加热至有机物分解或色泽加深，补加1～3ml消化液继续消化，控制温度低于200℃，如此反复至消化液澄清，有HClO₄白烟冒出，继续加热至溶液1～3ml，用60％浓HCl定容在25ml容量瓶中，然后加0.5％NaBH₄至反应终点，用ICP-MS，电感耦合等离子体质谱法测量硒和营养元素含量。

所述的蓝莓硒相对含量检测方法为：

将0.2g蓝莓植株叶片放在共振盘上，通过手握传感器测定样品的微磁场的频率和能量，经仪器放大，计算机处理后和设备仪器内部的营养指标的标准“量子共振谱”比较，输出相应的由负到正的相对量价值。

菌根真菌的形态学鉴定方法，包括以下步骤：根据量子共振和ICP-MS检测结果筛选出促蓝莓富硒优势菌株，通过菌落外观形态、菌丝光学显微观察来进行菌株的初步鉴定，并利用台盼蓝染色蓝莓根部的侵染试验进行形态差异性比较。见图2。根据真菌鉴定手册，进行形态学分类。

菌根真菌的分子生物学鉴定方法，包括以下步骤：将筛选后的菌根真菌进行基因组抽提，以真菌rDNA的ITS序列作为通用引物进行PCR扩增.将测序获得的序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，对搜索结果中同源性大于97％的序列运用CLUSTAL-W软件进行序列匹配分析，对结果运用MEGA6软件中的Neighbor-joining法构建系统发育树，确定菌根真菌的系统发育地位，完成分子鉴定。

促蓝莓富硒菌根真菌的分离与鉴定方法技术线路见附图1。

通过以上方法，我们从蓝莓根际微生物中筛选出了一种促蓝莓酸性土壤富硒的菌根真菌，利用形态学观察及分子生物学方法鉴定为毛霉属卷枝毛霉种Mucor circinelloides。见附图2，图3。

所述的一株促蓝莓富硒的菌根真菌的应用，可用于制备菌根真菌制剂，接种于蓝莓幼苗，促进其生长；接种于蓝莓植株，提高其果实硒的含量，其他营养元素Ca、Fe、Zn、M n、Cr等营养元素含量也有一定比例的提高。

富硒蓝莓幼苗的盆栽培养方法，包括以下步骤：将培养土放入121℃高压蒸汽灭菌20min，分成80g等量的小份，倒入无菌10cm×8cm×7cm培养盆中，用草酸调土壤PH为4.0～5.5，挖一个深5cm的3cm×3cm的坑，加入2cm×2cm菌饼2个，将蓝莓苗移入。将蓝莓幼苗置于通风恒温(25℃)光照环境培养，浇无菌水。蓝莓苗移栽成活后，根施浓度为40mg/ml的亚硒酸钠溶液至土壤硒含量达0.04mg/kg，接种培养的菌根真菌，每间隔15d施硒肥一次，共施三次。

富硒蓝莓植株培养方法，包括以下步骤：将经过121℃高压灭菌后的草木灰和土壤按照1：3比例，混合均匀，用草酸调土壤PH为4.0～5.5，加入硒肥使土壤硒含量达到0.04mg/kg后，移栽蓝莓植株。接种培养的菌根真菌，间隔15d补施硒肥至土壤硒含量为0.04mg/kg。定期进行浇水(草酸调PH为4.5～5.5)管理。

本发明的有益效果：

(1)本发明筛选鉴定得到毛霉属卷枝毛霉种Mucor circinelloides的菌株可以促进蓝莓果实的富硒，提高蓝莓果实营养价值，降低蓝莓种植栽培管理成本。

(2)接菌根真菌的富硒蓝莓比未接菌蓝莓硒含量显著提高，富硒蓝莓硒的含量可达0.09-0.163μg/g

(3)接菌后蓝莓其他营养元素含量也明显提高：Ca含量可达200-500μg/g，Zn含量可达1-5μg/g，Fe的含量可达5-30μg/g，K的含量可达7-15mg/g，Mn的含量可达1.5-3.0μg/g，Cr的含量可达0.5-1.5μg/g。

(4)蓝莓移植苗成活率提高20-40％，苗高提高5-10％。

附图说明

图1为菌根真菌促蓝莓富硒的技术线路示意图；

图2为促蓝莓富硒的毛霉属卷枝毛霉种Mucor circinelloides真菌图片；

图3为菌根真菌系统发育树图。

具体实施方式

实施例1：兔眼蓝莓幼苗的培养及菌根真菌的接种：将培养土放入121℃高压蒸汽灭菌20min，分成80g等量的小份，倒入无菌10cm×8cm×7cm培养盆中，用草酸调土壤PH为4.0～5.5，挖一个深5cm的3cm×3cm的坑，加入2cm×2cm菌饼2个，将蓝莓苗移入。将蓝莓幼苗置于通风恒温(25℃)光照环境培养，浇无菌水。蓝莓苗移栽成活后，根施浓度为40mg/ml的亚硒酸钠溶液至土壤硒含量达到0.04mg/kg，接种培养的菌根真菌CANV，然后每间隔15d施硒肥一次，共施三次。第三次硒肥施完15d后，采摘富硒蓝莓幼苗叶片进行量子共振检测。

幼苗移栽后的成活率提高38.9％，苗高提高9.1％，量子共振检测，硒、氮、磷、钾的含量也相应提高。见表1。

表1接种菌根真菌的富硒蓝莓幼苗叶片N、P、K相对含量的检测

实施例2：兔眼蓝莓植株的富硒培养：将经过121℃高压灭菌后的草木灰和土壤按照1：3比例，混合均匀，用草酸调土壤PH为4.0～5.5，加入硒肥使土壤硒含量达到0.04mg/kg后，移栽蓝莓植株。间隔15d补施硒肥至土壤硒含量为0.04mg/kg。定期进行浇水(草酸调PH为4.5～5.5)管理。蓝莓植株移栽成活后，根施浓度为40mg/ml的亚硒酸钠溶液至土壤硒含量达到0.04mg/kg，接种培养的菌根真菌CANV，然后每间隔15d施硒肥一次，共施三次。第三次硒肥施完15d后，采摘成熟的富硒蓝莓果实进行ICP-MS检测。检测结果见表2。

表2.接种菌根真菌的富硒蓝莓中硒及营养元素含量的测定结果