一种水稻根系伸长和斑点叶性状控制基因OsPelota1及编码的蛋白质的制作方法

本发明涉及水稻生长发育，具体涉及一种水稻根系伸长和斑点叶性状控制基因ospelota1及编码的蛋白质。

背景技术：

根系作为水稻生长发育必不可少的器官,间接地决定着水稻地上部产量、品质、抗逆及广适性等诸多农艺性状的表现。水稻根系构型为须根系，能不断地从茎节最靠近中柱维管的分生区细胞发生不定根，最后由数量众多的不定根及其侧根构成了它的根系结构。根型由长度、数量和空间范围等几个参数决定，研究发现根长决定了其他根系性状的遗传表现，是所有根系性状中最重要性状。但水稻根系因不能被人们直接收获食用故根系性状不被重视,人们对水稻根系性状的认识深度与广度远不及对于地上部产量与品质性状,其基础理论与应用研究严重滞后。因此，重点挖掘控制水稻根长的基因，分离、克隆一系列控制根长的基因便于定向改良水稻根系性状，如授权公告号为cn102161985的发明专利，就公开了与水稻根系生长有关的基因ksr1,该基因ksri及编码的蛋白质有些碱基和氨基酸发生突变，水稻根系表现为短根系。

植物斑点叶突变体是指植物在没有遭受病原物浸染或明显逆境条件下在叶片或叶鞘上自发形成斑点的一类突变体。除少部分突变体斑点的形成可能由色素积累外，大部分是由植物本身细胞死亡引起。这类斑点叶突变体的表型多与病原菌侵染后的过敏反应症状类似，而且许多斑点叶突变体对某些植物病原物表现出了一定的抗性，能激发病程相关蛋白的表达,可以提高植株的持久、广谱抗病性。因此斑点叶突变体是植物育种中一类重要的抗病种质资源，不断挖掘和鉴定新的水稻斑点叶突变体，对水稻抗病机制研究和抗病育种实践都有重要意义。如授权公告号为cn103937812的发明专利，就公开了水稻斑点叶性状控制基因spl29,该基因spl29及编码的蛋白质有些碱基和氨基酸发生突变，水稻表现为斑点叶和增强的植株抗病能力。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻根系伸长和斑点叶性状控制基因ospelota1及编码的蛋白质，该蛋白是一个pelota蛋白，在氨基酸取代或缺失等情况下，能抑制水稻根系的伸长和导致斑点叶的发生，使水稻出现短根系，生长20天后叶片上出现棕褐色的斑点并逐渐扩散至全株。可以为水稻的根系改良和调控植株的抗病性或转基因植物的开发创造条件。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种水稻根系伸长和斑点叶性状控制基因ospelota1，该控制基因ospelota1的核苷酸序列如seqidno：1所示，所示的dna序列中一个或几个碱基对错义突变。seqidno：1序列由7945个碱基组成，自5端第172-174位为起始密码子，包含15个外显子和14个内含子，编码具有序列表中seqidno：2所示的氨基酸残基序列的蛋白质，该蛋白由378个氨基酸残基组成，为pelota蛋白，氨基酸序列中一个或几个氨基酸错义突变。如所示的dna序列中1802位插入一个胸腺嘧啶(t)，产生移码突变，编码的氨基酸序列的提前终止，只合成89个氨基酸，水稻表现出短根系和斑点叶。

该ospelota1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

与现有技术相比，本发明的优点在于一种水稻根系伸长和斑点叶性状控制基因ospelota1及编码的蛋白质，该蛋白的编码基因如序列表seqidno：1所示的碱基序列，该蛋白的氨基酸序列如序列表seqidno：2所示，是一个pelota蛋白，与根系伸长和斑点叶相关；该碱基序列若发生突变，如1802位插入一个胸腺嘧啶(t)，产生移码突变，编码的氨基酸序列提前终止，只合成89个氨基酸，这样该蛋白就抑制根系的伸长和导致斑点叶的发生，具体在植株表现为主根和不定根都变短，生长20天后叶片上出现棕褐色的斑点并逐渐扩散至全株。该蛋白及其编码基因的应用，可以为水稻的根系改良和调控植株的抗病性或转基因植物的开发创造条件。

附图说明

图1为野生型wt和突变体ospelota1的表型；（a）植株苗期约28天时的表型，bar=2cm。(b)60天叶龄的叶片表型，bar=1cm；

图2为ospelota1基因的图位克隆和基因结构。（a）ospelota1基因的分子定位，采用30个f2突变株，将ospelota1粗定位在第4号染色体的ssr分子标记rm3217和rm567之间，新发展sts多态标记sts1、sts2和sts3，将ospelota1定位在sts2和sts3之间411kb的候选区域内，该区间覆盖4个bac克隆：osjnba0071i13、osjnba0011f23、osjnba0015k02和osjnba0084k01，ospelota1基因在bac克隆osjnba0015k02上。（b）ospelota1基因结构和突变位点，外显子用黑色方框表示，内含子用实线表示，非翻译区用白色框表示，箭头指示突变位点；

图3为60天苗龄的野生型wt、突变体ospelota1和两株t2代转基因回复株系（ov1和ov2）的表型。（a）根系表型，bar=4cm。（a）叶片表型，bar=1cm；

图4为超表达转化载体pcambia1300改的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图、实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1突变体的表型及遗传分析

从甲基磺酸乙酯诱变的籼稻（oryzasatival.sspindica）品种kasalath突变体库中筛选到一个水稻短根系突变体ospelota1。8天苗龄的ospelota1突变体的根系伸长受到抑制，主根和不定根都变短(图1a)，生长20天后叶片上出现棕褐色的斑点，一开始斑点出现在主叶脉或叶尖上，渐渐地斑点扩散至全株叶片及秸秆上(图1b)。以突变体ospelota1为父本，与野生型kasalath杂交，获得子一代f1植株与野生型kasalath完全一致，说明ospelota1为隐性突变。f1代自花授粉所得的f2中，正常植株与短根植株的分离比为147/53=2.77，卡方检测结果为0.24<χ²0.05,1=3.84，正常植株与短根植株的比例符合一对基因控制的3：1分离比，表明该突变体是隐性单基因突变体。

实施例2ospelota1基因的定位

从突变体ospelota1和nipponbare的杂交后代f2中分离出短根突变个体，利用基因图位克隆法（map-basedcloning）对突变基因进行定位。初定位（30个f2突变个体）将突变基因定位在第4号染色体ssr标记为rm3648和rm567之间。之后在该区间内发展了3对有多态的新的sts分子标记，分别命名为sts1，sts2和sts3，序列如下：

sts1u-5’ttgagatcaaccggctggag3’

sts1l-5’aggagcgagcgcacgtagtt3’

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sts3u-5’tcacgtccatcgtactatgt3’

sts3l-5’agccatgattgggtagaaag3’

最终将基因锁定在sts2和sts3之间，重组子分别为2/30和3/30，且重组的号码不同。该区间有411kb大小（图2a）。

实施例3基因预测和序列分析

定位区间覆盖了4个bac克隆：osjnba0071i13、osjnba0011f23、osjnba0015k02和osjnba0084k01。从该区间内挑选出了bac克隆osjnba0015k02，根据tigr（http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/）的水稻基因注释信息，osjnba0015k02共有22个预测的基因，将预测的基因用基因芯片分析，筛选出了4个在根系中表达水平较高的候选基因，用kasalath野生型和ospelota1突变体dna模板对候选的4个基因进行扩增，扩增产物分别测序，测序结果进行比对分析，发现基因号为loc_os04g56480（pelota）基因的dna序列的1802位插入一个胸腺嘧啶(t)（图2b），产生移码突变，编码的氨基酸序列提前终止，只合成89个氨基酸。命名该基因为ospelota1。

实施例4ospelota1功能互补实验

根据ospelota1基因的cds序列信息，设计扩增完整cds的引物，引物序列如下（加下划线的为酶切位点）：

ospelota1-ovu：5’aaaggtaccatgaagctcgtctaccgca3’

ospelota1-ovl：5’aaactgcaggcatattgccaattctgaa3’；

采用trizol法提取水稻kasalash叶片总rna，以oligo（dt）-18为引物，以所提取的总rna为模板进行反转录合成第一链cdna。以此cdna为模板，利用primestarhsdnapolymerase扩增全长orf，pcr条件：98℃预变性10s，然后进入循环反应（98℃10s，58℃10s，72℃，1min），循环数为30，最后再延伸10min结束。琼脂糖电泳割胶回收pcr产物，连a尾纯化并连接到pmd19-t载体。连接产物热击转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，37℃培养16h后挑阳性单克隆测序，测序鉴定序列无误后用kpni和psti在37℃双酶切过夜，连入经同样双酶切的pcambia1300改（35s）载体中（图4），连接产物以相同的方法热击转化大肠杆菌dh5α感受态，涂布在含有kan抗性的lb平板培养16h后挑取单克隆，摇菌抽提质粒双酶切并通过琼脂糖胶检测正确后电击转化农杆菌eha105。

酶切检测正确的质粒通过农杆菌株系eha105介导的水稻遗传转化体系导入到突变体ospelota1中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌（eha105）介导的水稻遗传转化体系主要应用hiei等人(1994）报道的方法基础上进行优化。该转基因植株中分离的ospelota1突变体的根系和叶片都恢复成正常表型（图3），说明ospelota1的表型确实是有ospelota1突变引起的。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>宁波大学

<120>一种水稻根系伸长和斑点叶性状控制基因ospelota1及编码的蛋白质

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>7945

<212>dna

<213>水稻根系伸长和斑点叶性状控制基因ospelota1

<400>1

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<213>水稻根系伸长和斑点叶性状控制基因ospelota1编码的蛋白质

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