一种Candidaamazonensis的FLP/FRT基因敲除方法与流程

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系统。

背景技术：

Candida amazonensis是近年来从亚马逊森林中新分离出的一株能够高效利用木糖的酵母，该酵母能够代谢多种糖类，同时具有发酵纤维二糖、海藻糖等的能力(Cadete RM,Melo MA,Lopes MR,Pereira GM,Zilli JE,Vital MJ,Gomes FC,Lachance MA,Rosa CA.Candida amazonensis sp.nov.,an ascomycetous yeast isolated from rotting wood in the Amazonian forest.International journal of

systematic and evolutionary microbiology,2012,62(Pt 6):1438-1440.)。Cadete等(Cadete RM,Melo MA,Dussan KJ,Rodrigues RC,Silva SS,Zilli JE,Vital MJ,

Gomes FC,Lachance MA,Rosa CA.Diversity and physiological characterization of D-xylose-fermenting yeasts isolated from the Brazilian Amazonian Forest.PLoS

ONE,2012,7(8):e43135.)在研究中发现Candida amazonensis具有快速代谢木糖的能力，并在木糖醇生产方面表现出一定优势。实验室前期研究注意到该酵母能够分别在高木糖浓度(350g/l)、高温42℃、pH 2.5等胁迫条件下仍能有效发酵木糖并积累较高的生物量，表现出良好的耐高糖、耐高温以及耐酸性能。有望成为新型木糖发酵模式菌株(范贺超,张梁,李赢,等.五株木糖利用酵母的生理代谢特性.微生物学报,2015,55(8):1026-1035.)

然而，良好的模式菌株，除自身具有的优良特性外，还需要基因表达与敲除等基本的分子生物学手段的有效支持，用以充分挖掘相关菌株优良信息。目前，Candida amazonensis基因水平上的研究尚处于起步阶段，至今还未有全基因组测序的工作展开。此外，由于该酵母属于利用木糖类酵母，使用特殊的基因编码系统，即密码子CTG编码的是丝氨酸而非常见的亮氨酸(Wohlbach DJ,Kuo A,Sato TK,Potts KM,Salamov AA,Labutti KM,Sun H,Clum A,Pangilinan JL,Lindquist EA,Lucas S,Lapidus A,Jin M,Gunawan C,Balan V,Dale BE,Jeffries TW,Zinkel R,Barry KW,Grigoriev IV,Gasch AP.Comparative genomics of xylose-fermenting fungi for enhanced biofuel production.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(32):13212-13217.)，这使得常规表达系统所对应的一些载体元件包括筛选标记、报告基因等难以有效用于该CTG类酵母中。

本实验室前期利用定点突变后(CDS区9个CTG突变为亮氨酸密码子TTG)的潮霉素抗性基因hphm和绿色荧光蛋白基因gfpm(1个CTG突变为TTG)以及来自Spathaspora passalidarum酵母的启动子、终止子等元件成功构建了一个适用于Candida amazonensis的整合型表达载体PRACTH-gfpm，然而，有限的筛选标记很难满足人们对于代谢工程育种的要求。因此，对于新型木糖利用酵母Candida amazonensis，目前急需一个筛选标记可重复使用的基因敲除系统来在菌种改造方面对其进行更深入的研究。

位点特异性重组系统，如FLP/FRT或Cre-loxp等，就是一种能够实现筛选标记基因回收的有效工具。近年来，在CTG类酵母中发展起来的FLP/FRT位点特异性重组系统，因重组效率和靶向性高、可快速准确地实现抗性消除而受到众多研究者的青睐。

FLP/FRT系统由FLP重组酶和FRT识别位点两部分组成。FLP是1个48kDa的多肽单体蛋白，其可以介导34bp的FRT重复序列位点特异性重组，切除同向重复的2个FRT位点间的DNA片段和1个FRT位点，保留另一个FRT位点。早在1999年Staib等(Staib P,KretSchmar M,Nichterlein T,et al.Host‐induced,stage‐specific virulence gene activation in Candida albicans during infection[J].Molecular microbiology,1999,32(3):533-546.)就选择在Candida albicans中将密码子修饰过后(3个CTG突变为TTG)的FLP重组酶基因置于SAP2(与分泌天门冬氨酰蛋白酶有关)的启动子下进行调控，并在FLP表达盒和霉酚酸抗性标记基因(IMH3^R)两端添加同向重复的FRT位点，由此构建的敲除系统在SAP2启动子对FLP酶的调控下，实现两个FRT位点之间片段的切除。

同年，MorSchhauser等(J,Michel S,Staib P.Sequential gene disruption in Candida albicans by FLP‐mediated site‐specific recombination[J].Molecular microbiology,1999,32(3):547-556)在抗性标记被URA3营养缺陷型标记替代的基础上，使用同样的技术在C.albicans中进行了连续分别两轮敲除CDR4基因和MDR1基因，获得突变纯合株，成功实现了FLP/FRT系统在Candida albicans中抗性重复使用和多基因连续敲除方面的应用。

此外，Sanchez-Martinez等(Sanchez-Martinez C,Perez-Martin J.Site-specific targeting of exogenous DNA into the genome of Candida albicans using the FLP recombinase[J].Molecular Genetics and Genomics,2002,268(3):418-424)和Reuss等(ReuβO,VikKolter R,et al.The SAT1flipper,an optimized tool for gene disruption in Candida albicans[J].Gene,2004,341:119-127.)选择用一个Candida albicans自身来源的麦芽糖诱导型启动子MAL2(替换前面的SAP2)构建的FLP/FRT系统也成功实现了Candida albicans中同向FRT位点之间序列的删除，其中FLP重组酶的表达受麦芽糖的诱导，因此通过培养基中麦芽糖的有无就可以实现对FLP表达的调控，从而可实现对FRT位点间片段切除在时空顺序上的控制。

在这基础上，当Ding&Butler等人(Ding C,Butler G.Development of a gene knockout system in Candida parapsilosis reveals a conserved role for BCR1in biofilm formation[J].Eukaryotic cell,2007,6(8):1310-1319.)将该敲除系统应用于Candida parapsilosis中时，发现只有将CaMAL2启动子替换成宿主自身来源的CpMAL2时，才能有效行使其功能。而让人意外的是，Gacser等人(Gácser A,Trofa D,W,et al.Targeted gene deletion in Candida parapsilosis demonstrates the role of secreted lipase in virulence[J].The Journal of clinical investigation,2007,117(10):3049-3058)和Nguyen等人(Nguyen L N,Trofa D,Nosanchuk J D.Fatty acid synthase impacts the pathobiology of Candida parapsilosis in vitro and during mammalian infection[J].PloS one,2009,4(12):e8421)在后来被相继报道称不需改变MAL2启动子序列，便可在Candida parapsilosis中成功实现由FLP重组酶介导的敲除。

基于以上FLP/FRT系统在CTG类酵母中的研究应用，对于能够在Candida amazonensis中适用的FLP/FRT敲除系统的获得，其关键在于拥有一个能严格调控FLP酶表达的启动子，目前，已有不少调控型启动子被克隆及功能鉴定，其中研究频率比较高的诱导型启动子包括酿酒酵母来源的受葡萄糖抑制、半乳糖诱导的GAL1和GAL10启动子(Guarente L,Yocum R R,Gifford P.A GAL10-CYC1hybrid yeast promoter identifies the GAL4regulatory region as an upstream site[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1982,79(23):7410-7414.)；酿酒酵母来源的受葡萄糖抑制、麦芽糖诱导的MAL62(Finley R L,Zhang H,Zhong J,et al.Regulated expression of proteins in yeast using the MAL61–62promoter and a mating scheme to increase dynamic range[J].Gene,2002,285(1):49-57.)和白色假丝酵母来源的MAL2(ReuβO,VikKolter R,et al.The SAT1flipper,an optimized tool for gene disruption in Candida albicans[J].Gene,2004,341:119-127.)；以及受木糖诱导的XYL启动子(Kopke K,Hoff B,Kück U.Application of the Saccharomyces cerevisiae FLP/FRT recombination system in filamentous fungi for marker recycling and construction of knockout strains devoid of heterologous genes[J].Applied and environmental microbiology,2010,76(14):4664-4674.)等等，这些启动子的诱导或抑制效果都比较明显，但大多数启动子在非诱导条件下甚至是抑制的条件下仍然有一定量的基础表达，难以达到严格诱导的标准，具有一定的局限性。此外，不同来源的启动子或者不同的表达宿主因为其遗传背景不同，可能导致启动子的行使功能有差异。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了适用于Candida amazonensis的严格诱导型启动子SpGAL1p(受半乳糖诱导)或SpMAL1p(受麦芽糖诱导)，诱导调控FLP基因，构建抗性标记可重复利用的FLP/FRT基因敲除系统，能够用于高效地连续敲除Candida.amazonensis内目的基因，为菌株的代谢工程改造提供了强有力的技术手段。

本发明的技术方案如下：

一种Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法，包括构建基因敲除盒以及消除潮霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因的消除是指通过添加诱导剂诱导FLP酶表达，以切除FRT位点之间的FLP表达盒和潮霉素抗性基因表达盒。

所述方法具体包括以下步骤：

(1)构建基因敲除盒，敲除盒从5’-3’依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、FRT位点、严格诱导型启动子SpGAL1p或SpMAL1p、caFLP重组酶基因、SpCyC1t终止子、潮霉素抗性基因hphm表达盒、FRT位点、靶基因下游同源臂；

(2)用基因敲除盒转化Candida amazonensis，得到靶基因敲除的阳性克隆；

(3)将阳性克隆接种于诱导培养基，诱导FLP重组酶基因表达，切除同向FRT位点之间的DNA片段。

其中，所述靶基因为PDC基因，编码丙酮酸脱羧酶，该基因编码序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的FRT位点的序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的严格诱导型启动子SpGAL1p为Spathaspora passalidarum来源的β-半乳糖苷酶基因GAL1启动子，受半乳糖诱导，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的严格诱导型启动子SpMAL1p为Spathaspora passalidarum来源的α-麦芽糖苷酶基因MAL1启动子，受麦芽糖诱导，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的caFLP为适用于Candida amazonensis的重组酶基因，该基因的编码序列如SEQ ID NO:5所示；

所述的SpCyC1t终止子为Spathaspora passalidarum来源的细胞色素C基因CYC1终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的潮霉素抗性基因hphm表达盒，其DNA序列如SEQ ID NO:7所示。

特别的，所述caFLP可以指将酿酒酵母来源的FLP重组酶基因内含有的3个CTG密码子突变为TTG，使得在Candida amazonensis内编码的是亮氨酸，而非丝氨酸。

优选的，步骤(1)中所述构建基因敲除盒由以下具体步骤得到：

(1)以Candida amazonensis基因组为模板，用序列为SEQ ID NO:8的引物PDC-1和序列为SEQ ID NO:9的引物PDC-2扩增PDC基因5’端360bp的上游序列PDC-L，在片段上游引入酶切位点Stu I，片段下游引入酶切位点Kpn I；利用序列为SEQ ID NO:10的引物PDC-3和序列为SEQ ID NO:11的引物PDC-4扩增PDC 3’端400bp的下游序列PDC-R，片段上游引入酶切位点Kpn I，片段下游引入酶切位点Stu I；用重叠延伸PCR法将PDC-L和PDC-R序列拼接获得PDC基因同源重组片段PDCL-R；

(2)将PDCL-R连接至PMD19-T simple载体，转化感受态E.coli JM109，获得阳性克隆，命名为Ts-PDCLR；提取质粒Ts-PDCLR，用Kpn I酶切，去磷酸化后备用；

(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，用序列为SEQ ID NO:12的引物SpGAL1p-F和序列为SEQ ID NO:13的引物SpGAL1p-R PCR扩增启动子SpGAL1p，片段上游引入酶切位点Kpn I，下游引入Sal I；以序列为SEQ ID NO:14的引物SpMAL1p-F和序列为SEQ ID NO:15的引物SpMAL1p-R PCR扩增启动子SpMAL1p，片段上游引入酶切位点BamH I，下游引入Sal I；

(4)将纯化的片段SpGAL1p和重组质粒PRACTH-gfpm分别用Bgl II和Sal I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpGAL1p-gfpm；将纯化的片段SpMAL1p用BamH I和Sal I双酶切，质粒PRACTH-gfpm用Bgl II和Sal I双酶切，二者的酶切产物分别纯化后过夜连接，其中BamH I和Bgl II是同尾酶，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpMAL1p-gfpm；

(5)对重组质粒SpGAL1p/SpMAL1p-gfpm和Ts-caFLP分别用Sal I和Not I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落，获得重组质粒SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP；

(6)以质粒SpGAL1p-caFLP为模板，用序列为SEQ ID NO:16的引物FRT-1和序列为SEQ ID NO:17的引物FRT-2扩增带有FRT位点的片段FRT-SpGAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点Kpn I；以质粒SpMAL1p-caFLP为模板，用序列为SEQ ID NO:18的FRT-3和序列为SEQ ID NO:17的FRT-2扩增带有FRT的片段FRT-SpMAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点Kpn I；

(7)上述带有FRT的片段经Kpn I酶切并纯化后，分别与步骤(2)中备用的Ts-PDCLR经T4DNA连接酶连接，转化感受态E.coli JM109，获得阳性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR，简称为Ts-PRFg HRP或Ts-PRFmHRP，该同源重组载体通过Stu I酶切后割胶回收同源重组片段PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR即PRFgHRP/PRFmHR P备用。

优选的，步骤(2)的具体操作方法为：将基因敲除盒经醋酸锂介导法转入Candida amazonensis中，涂布含900μg/mL潮霉素即Hygromycin B的平板筛选得到转化子；在通过更高浓度的潮霉素抗性平板进行转化子筛选后，进一步获取阳性转化子。

优选的，所述诱导培养基分为两种：

当选择用SpGAL1p启动子来诱导FLP的表达时，所对应的诱导培养基为半乳糖诱导培养基YEPG；

当选择用SpMAL1p来诱导FLP的表达时，所对应的诱导培养基则为麦芽糖诱导培养基YEPM。

优选的，所述诱导培养基的组成为：

半乳糖诱导培养基YEPG：蛋白胨20，酵母提取物10，半乳糖20，单位为g/L；用于固体培养基时添加1.6％的琼脂粉；

麦芽糖诱导培养基YEPM：蛋白胨20，酵母提取物10，麦芽糖20，单位为g/L；用于固体培养基时添加1.6％的琼脂粉。

优选的，所述的宿主酵母Candida amazonensiss保藏于荷兰真菌菌种保藏中心，保藏编号为CBS 12363。

本发明有益的技术效果在于：

本发明提供的适用于Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除系统，利用严格诱导型启动子SpGAL1p或SpMAL1p控制重组酶caFLP的表达，在FLP表达盒和hphm抗性基因表达盒两端添加同向重复的FRT位点，以PDC为靶基因构建敲除盒整合到Candida amazonensis基因组中，后续通过添加诱导剂诱导FLP表达，切除FRT位点间FLP和hphm表达盒。

本发明提供的敲除系统可以用于连续敲除多个基因。应用本发明，我们成功敲除了Candida amazonensis的PDC基因，并实现了潮霉素抗性的消除，抗性消除后的转化子遗传稳定，形态正常。

本发明只需要一次同源重组和后续的培养基诱导便可获得重组酶基因和抗性基因一同被切除的靶基因敲除株，而不需要另外转入一个携带重组酶的游离质粒，如Cre-Loxp系统中携带Cre酶的PSH47质粒。并且只需要一个可用的抗性标记便可完成多个基因的连续敲除。

本发明基因敲除株与其出发菌株相比，除了目的基因的部分或完全缺失及多了一个34bp的FRT位点外，无其他基因上的差异。该敲除系统可以直接以野生型菌株为改造对象，不需要利用URA3或HIS1、ARG4等营养缺陷型菌株，一方面省去了营养缺陷型菌株的筛选过程，也避免了回复突变等问题；另一方面由于URA3等基因的缺失会改变菌株的表型，这可能会导致其对突变株有其他未知的影响。

基因敲除以后的菌株性状稳定，发酵、生长不受影响。

附图说明

图1为实施例1的定点突变后FLP基因CDS序列(表示定点突变位点)；

图2为实施例2的重组载体Ts-PRFg/mHRP的质粒图谱；

图3为PDC基因敲除流程图；

图4为Candida amazonensis PDC基因敲除株的PCR验证图；

图5为原始菌株Candida amazonensis及PDC敲除株在含900μg/mL潮霉素(Hyg)的YEPD平板上的生长状况图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1重组酶基因FLP的定点突变

以Saccharomyces cerevisiae为模板，用引物FLP-F(SEQ ID NO:19)和FLP-R(SEQ ID NO:20)PCR扩增获得FLP基因序列(序列上游引入酶切位点Sal I，序列下游引入酶切位点Not I)，连接PMD 19-T simple载体，转化感受态E.coli JM109，获得重组子Ts-FLP。以质粒Ts-FLP为模板，采用Stratagene定点突变试剂盒(购自安捷伦科技有限公司)，分别使用引物FLP-1(SEQ ID NO:21)和FLP-2(SEQ ID NO:22)；FLP-3(SEQ ID NO:23)和FLP-4(SEQ ID NO:24)；FLP-5(SEQ ID NO:25)和FLP-6(SEQ ID NO:26)经过3轮PCR定点突变，，获得环状PCR产物。扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火2min，68℃延伸4min，30个循环，68℃充分延伸5min。将上述PCR产物纯化后用内切酶Dpn I于37℃消化30min，于65℃反应15min以失活内切酶Dpn I。将酶切产物纯化后，转化E.coli JM109感受态细胞(购自北京全式金公司)，涂布于LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，提取质粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，挑选突变位点正确的质粒。经过上述突变操作后，突变质粒命名为Ts-caFLP，其中突变后FLP的CDS序列如图1所示。

实施例2PDC基因敲除盒的构建

(1)以Candida amazonensis基因组为模板，用引物PDC-1(SEQ ID NO:8)和PDC-2(SEQ ID NO:9)扩增PDC基因5’端360bp的上游序列PDC-L，在片段上游引入酶切位点Stu I，在片段下游引入酶切位点Kpn I；利用引物PDC-3(SEQ ID NO:10)和PDC-4(SEQ ID NO:11)扩增PDC 3’端400bp的下游序列PDC-R，片段上游引入酶切位点Kpn I，片段下游引入酶切位点Stu I；用重叠延伸PCR法将PDC-L和PDC-R序列拼接获得PDC基因同源重组片段PDCL-R。

(2)将PDCL-R连接PMD19-T simple载体，转化感受态E.coli JM109，获得阳性克隆，命名为Ts-PDCL-R。提取质粒Ts-PDCLR，用Kpn I酶切，去磷酸化后备用。

(3)以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，用引物SpGAL1p-F(SEQ ID NO:12)和SpGAL1p-R(SEQ ID NO:13)PCR扩增启动子SpGAL1p，片段上游引入酶切位点Kpn I，下游引入Sal I；以引物SpMAL1p-F(SEQ ID NO:14)和SpMAL1p-R(SEQ ID NO:15)PCR扩增启动子SpMAL1p，片段上游引入酶切位点BamH I，下游引入Sal I。

(4)将纯化的片段SpGAL1p和重组质粒PRACTH-gfpm分别用Bgl II和Sal I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpGAL1p-gfpm；将纯化的片段SpMAL1p用BamH I和Sal I双酶切，质粒PRACTH-gfpm用Bgl II和Sal I双酶切，二者的酶切产物分别纯化后过夜连接(BamH I和Bgl II是同尾酶)，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，获得重组质粒命名为SpMAL1p-gfpm。

(5)对重组质粒SpGAL1p/SpMAL1p-gfpm和Ts-caFLP分别用Sal I和Not I双酶切，将酶切产物分别纯化后过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，挑选单菌落，获得重组质粒SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP。

(6)以质粒SpGAL1p-caFLP为模板，用引物FRT-1(SEQ ID NO:16)和FRT-2(SEQ ID NO:17)扩增带有FRT位点的片段FRT-SpGAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点Kpn I；以质粒SpMAL1p-caFLP为模板，用FRT-3(SEQ ID NO:18)和FRT-4(SEQ ID NO:17)扩增带有FRT的片段FRT-SpMAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位点Kpn I。

(7)上述带有FRT的片段经Kpn I酶切并纯化后，分别与步骤(2)中备用的Ts-PDCLR经T4DNA连接酶连接，转化感受态E.coli JM109，获得阳性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR(简称为Ts-PRFg/mHRP)，其质粒图谱如图2所示。该同源重组载体通过Stu I酶切后割胶回收同源重组片段PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR(PRFgHRP/PRFmHRP)备用。

实施例3PEG/LiAc法转化Candida amazonensis CBS 12363

(1)于YPD平板中挑取Candida amazonensis CBS 12363单菌落，接种于20mL YPD培养基中，于100mL摇瓶中30℃过夜培养；

(2)将过夜培养的新鲜菌液接种于50mLYPD培养基中，于250mL摇瓶中30℃，200rpm培养，至菌液OD₆₀₀到1.2左右；

(3)5000rpm室温离心5min，收集菌体细胞；

(4)将细胞重新悬浮于500μL 0.1mol/L的LiAc中，离心，弃上清，获得感受态细胞；

(5)在感受态细胞中按顺序加入下列转化混合液：240μL 50％PEG3350，36μL 1.0mol/L LiAc，25μL鲑鱼精DNA，50μL待转化线性DNA，其中鲑鱼精DNA沸水浴10min后立即冰浴；

(6)剧烈振荡每个反应管直至细胞完全混匀；

(7)置于30℃温育1h；

(8)置于42℃金属浴热击22min；

(9)待降至室温后，5000rpm离心5min，弃上清；

(10)加入1mL YPD培养基，于30℃后培养2h；

(11)5000rpm离心5min，弃掉800μL上清，混匀菌体并涂布潮霉素(900μg/mL)抗性平板，30℃培养2-3d，获得转化子。

实施例4Candida amazonensis PDC基因敲除株的鉴定

利用引物PDC-1(SEQ ID NO:8)和PDC-4(SEQ ID NO:11)鉴定PDC基因的敲除：敲除盒成功整合上PDC位点的敲除株，其PCR产物为敲除盒片段，大小为5.4kb，而原始菌株的PCR结果为1.7kb的PDC基因条带；

利用引物FLP-F(SEQ ID NO:19)和FLP-R(SEQ ID NO:20)鉴定PDC基因的敲除：敲除株的PCR产物为1.3kb左右的DNA条带，而原始菌株则显示无条带。

PDC敲除株的PCR验证如图4所示。图中泳道M为DL 15 000DNA marker，泳道1-3为以引物PDC-1和PDC-4进行的PCR扩增；泳道4-5为以引物FLP-F和FLP-R进行的PCR扩增。(其中泳道1为野生菌株Candida amazonensis CBS12363；泳道2和4为抗性未消除的PDC敲除株；泳道3和5则为抗性已成功消除的PDC敲除株)。

实施例5Candida amazonensis抗性基因的消除与验证

阳性克隆在固体诱导培养基上分离纯化2-3次后(其中PRFgHRP敲除株对应的诱导培养基为YEPG；PRFmHRP敲除株对应的诱导培养基为YEPM)；挑取单菌落同时点板于含潮霉素和不含潮霉素的YEPD平板，筛选普通YEPD平板上生长而含潮霉素抗性板上不生长的单菌落，如图5所示。图中W为野生菌株Candida amazonensis CBS 12363；01为抗性未消除的PDC敲除株；02则为抗性已成功消除的PDC敲除株。

提取其染色体，用引物PDC-1(SEQ ID NO:8)和PDC-4(SEQ ID NO:11)进行PCR扩增，抗性消除株，其PCR产物大小为0.8kb左右；用引物FLP-F(SEQ ID NO:19)和FLP-R(SEQ ID NO:20)进行PCR扩增，无产物扩增出。

抗性基因消除的PCR验证如图4所示。图中泳道M为DL 15 000DNA marker，泳道1-3为以引物PDC-1和PDC-4进行的PCR扩增；泳道4-5为以引物FLP-F和FLP-R进行的PCR扩增。(其中泳道1为野生菌株Candida amazonensis CBS12363；泳道2和4为抗性未消除的PDC敲除株；泳道3和5则为抗性已成功消除的PDC敲除株)。

对PCR验证正确的抗性消除株，将其0.8kb大小的PCR产物送上海生工生物工程进行测序，对测序结果(SEQ ID NO:27)分析，表明其为PDCL-FRT-PDCR片段序列，进一步表明FRT位点之间的片段已成功被切除。

上述结果表明成功敲除了Candida amazonensis的PDC基因，并实现了潮霉素抗性的消除，抗性消除后的转化子遗传稳定，形态正常，可作为出发菌株进行后续基因改造。

本发明提供了适用于Candida amazonensis的严格诱导型启动子SpGAL1p(受半乳糖诱导)或SpMAL1p(受麦芽糖诱导)，诱导调控FLP基因，构建了抗性标记可重复利用的FLP/FRT基因敲除系统，并通过敲除PDC基因成功验证了该系统在Candida amazonensis中的应用，为菌株的代谢工程改造提供了强有力的技术手段。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法

<130> 1

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1733

<212> DNA

<213> candida amazonensis

<400> 1

atgtcggaaa tttctttagg tagatatctt tttgaaagat tacatcaatt agaagttaac 60

acaattttcg gtgttccagg tgattttaat ttatcacttt tggataagat ctatgaagtt 120

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gcttatgctg cagatggtta ttccagagtt aaaggtttag gttgtatagt tacaactttt 240

ggtgttggtg aattatcagc tcttaatggt attgctggtt cttatgctga acatgttggt 300

gttttacatg ttgttggtgt tccatcaatt agttctcaag ctaaacaatt attattacat 360

catactttag gtaatggtga ttttactgtt ttccatagaa tgtcaaataa tatcagtcaa 420

actactgctt ttatttctga tattaattct gctcctgctg aaattgatag atgtattaga 480

actgcttata tcagacaaag accagtttat ttaggtttac cagctaattt agttgattta 540

cttgttccag cctcattatt aaatactcca attgatttat ctttacaacc aaatgatcca 600

gatgctcaag aagaagttat tgaaactgtt ttggaattaa ttcataaagc tgaaaatcca 660

gttattttgg ttgatgcttg tgcttcaaga catggatgta aagaagaagt tcgtaaatta 720

gtagaaacaa ctcaattccc agttttcact actccaatgg gtaaaggtgt tgttgatgaa 780

ggcggagttg atggtgaatt attagaaaat gatccaaatt tgatttcaaa agttgcagct 840

agattagttt ctggtaagag tgtttcttca agattcggtg gtgtttatgt tggtacttta 900

tctaaaccag aagttaaaga atttgttgaa aatgctgatt taattttatc ggttggtgct 960

atattgtccg atttcaatac tggttctttc tcttattcat acaaaaccaa aaaatattgt 1020

tgaattccat tctgatcata ctaagattag acaagctact ttcccaggtg ttcaaatgaa 1080

agaagcttta caaaatttga attcaagagt tgcaccagct gctgctcatt ataaagttaa 1140

accagttcca aagattaaat tagctaatac tccagctact ggaaatgtta aattaactca 1200

agaatggtta tggactaaag tttcttcatg gtttagagaa ggtgatatca ttattactga 1260

aactggtaca tcagcttttg gtattgttca atctagattc ccaaataaca ctattggtat 1320

ttctcaagtt ttatggggtt ccattggttt ctctgttggt gccactttag gtgcagtaat 1380

ggcagctcaa gaaattgatc caaataagag agttatttta tttgttggtg atggttcttt 1440

acaattaaca gttcaagaaa tttctacaat gattagatgg aatactactc catatctttt 1500

cgttttaaat aatgatggtt atactattga aagattgatt catggtgaaa ctgccacata 1560

taatgatatt caaccatggg aaaacttagc tttattacca acttttaaag ctactcatta 1620

tgatgccatt agagttgcaa ctgttggtga agctgaagat ttatttaaga ataaagaatt 1680

tggtaagaac tccaagatta gattaattga agttatgttg ccaagaatgg atg 1733

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34

<210> 3

<211> 1198

<212> DNA

<213> Spathaspora passalidarum

<400> 3

aggggttgga agaagaaaaa atcggcacga tctgtggtga aaatatatcg tggtgagacc 60

gatgaaaaag tggagagtct ttcaaacaaa aggtctaacc ggtggattga caatgtgtgg 120

aaaaaaaata tttgatgatc tggggggtgg aaggtagttc caaaattatg cgctggaaaa 180

aaaaacagtg ccagggaaaa tgcaacgttg tacttttcag gaaaaatcta tgggagattg 240

gcgagaatta tcctgattat ttttacttga tctatctcta aacaatccaa gggtatagtt 300

cgcgggataa tttacacccc ctgttgatcg ccctatgact gataaacaaa attcagacta 360

cttttttttt tttatttaac acaataataa cagtgaatgc attaacggca aaataaaatt 420

tgtttgccac aaattgcctt gacacatacc aaaagtacga gtggataaaa gaaattggat 480

caaggtaatg atagcagaca atgaatttgt ttcagccacc actgaattgc cgcaatactt 540

caattaaact tttgtctatc tttgatgttg ggttgtatat gtaatagtgg ttattactga 600

gcggagttat ttattatttg gtctcctgaa ccatgagccg ttacttgagt tcgtgatcat 660

gtgttgttct tgttagcttt tctttttaag taagatcaac tgaaatccaa agtagcatga 720

cgtacaaact gcagatacca taccaaccac tccacagcaa aaacacccaa aagcagtaac 780

caatgtttac atgggccaat tccctataca gatccatgca catactgttt acataaacag 840

gtgattttgc cgtatgcatg ttttccgtgg agaggagatt atccggatat aatctgatcc 900

ccccgatctt cggcgcatgg gcctgcaaaa attatttcag acacagattt ttttcccgcg 960

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atgtaacgtt gcaatttcag cctcgatggg gtcaaggaat ttattttttc aattggtgca 1080

cttcaacctg ggtcattttc tgggaaaact atataaacaa gacacacccc cccctcccac 1140

tcaaaacaaa ccaagattac cttcaagcca agatcgcaaa gtttatcaaa ttcttact 1198

<210> 4

<211> 1125

<212> DNA

<213> Spathaspora passalidarum

<400> 4

aattttgtgg gtatttttac agcaggatga tttgaggcga gcattgtagc gttcctttgc 60

gatagacttt gcagcttccc cattcaggtt cataacggat ggggtaattg acaaaggaat 120

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gatctctgga aaaacgttca aagtttaaaa ttactaaatc ggaaaatttc aatttcaagg 300

tggggtttta aacaagaaaa aattgtaaaa agaaaaaaaa aactttaaat ctattagtga 360

acgccgcatc tccgcgggca ttgaccccag aaactggaat aaattcctcg atccacttct 420

tctctaacat gaatgactat cctgatatac tctattgtag ttgaaagggg gctaaaagtg 480

atacgacatt gttcccaggg ttagatttgt ggagaaaaaa caatccaaat accgagtggt 540

tggttacaac tcagcgagaa agattgcggc attcccccca tctaaaattt ttttttcttt 600

ttaagcattt tcacagatct ggaaatgtgt tgtctacatg gagaaattcg atatccagct 660

ttaagaaata agacataacg gttcataaac cgttttacca catttcctta cattaatttt 720

tgtttaccat agaatatacc gctgttgtgg tgcgaaagcg aaccaacaat cttgccacta 780

acattaacct cgggaagcaa taataacatt aatgagcaaa gaaaatgaac taaaaaaaaa 840

cacactagaa tatttaaaaa taatattatt tttgcaaaat tttttatgtc aaaaaaaaaa 900

aaagaaaatt aaaattaata ttttcgacaa acctccacat tacacttcgt gtttgcatgg 960

ggccattgtt ccgggggaat actttctctt tgtctttatg atttatcttc acaattcttt 1020

ctcagcttct cctgaagaat ataaaatcaa gtagaaatct tctgtcttga atgatatttt 1080

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<210> 5

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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ttatgttgga tgattacaca taacggaaca gcaatcaaga gagccacatt catgagctat 180

aatactatca taagcaattc gttgagtttc gatattgtca ataaatcact ccagtttaaa 240

tacaagacgc aaaaagcaac aattttggaa gcctcattaa agaaattgat tcctgcttgg 300

gaatttacaa ttattcctta ctatggacaa aaacatcaat ctgatatcac tgatattgta 360

agtagtttgc aattacagtt cgaatcatcg gaagaagcag ataagggaaa tagccacagt 420

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atactaaatt cgtttgagta tacttcgaga tttacaaaaa caaaaacttt ataccaattc 540

ctcttcctag ctactttcat caattgtgga agattcagcg atattaagaa cgttgatccg 600

aaatcattta aattagtcca aaataagtat ttgggagtaa taatccagtg tttagtgaca 660

gagacaaaga caagcgttag taggcacata tacttcttta gcgcaagggg taggatcgat 720

ccacttgtat atttggatga atttttgagg aattctgaac cagtcctaaa acgagtaaat 780

aggaccggca attcttcaag caataaacag gaataccaat tattaaaaga taacttagtc 840

agatcgtaca ataaagcttt gaagaaaaat gcgccttatt caatctttgc tataaaaaat 900

ggcccaaaat ctcacattgg aagacatttg atgacctcat ttctttcaat gaagggccta 960

acggagttga ctaatgttgt gggaaattgg agcgataagc gtgcttctgc cgtggccagg 1020

acaacgtata ctcatcagat aacagcaata cctgatcact acttcgcact agtttctcgg 1080

tactatgcat atgatccaat atcaaaggaa atgatagcat tgaaggatga gactaatcca 1140

attgaggagt ggcagcatat agaacagcta aagggtagtg ctgaaggaag catacgatac 1200

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agacgcatat aa 1272

<210> 6

<211> 251

<212> DNA

<213> Spathaspora passalidarum

<400> 6

gctaacttca attagaatgt tcccaaggtt agacgagaag gggggtgtta taaccctttt 60

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<210> 7

<211> 1839

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

accacttaca taatagaaag acaattgctg caaaatcaac agctgaccca tttattagcc 60

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actgcaatta ttggggggta aataatgaag taaattacac tggacaaacc tattataaat 420

aagatccatt gatattagct cctaattgac tattgagaaa attacactca caattgacaa 480

cacatttccc acacatattc cagatttagc aaattaagct tgaaacaaaa cgatccatga 540

agggtgaata aaaaaatttt ttattgttca ttattttttt tgccttgcaa aaattttttt 600

tttcagtggt gatctgtttc ctataaatta ctgagcccat cccccttttt ttcacaaaga 660

aaatttttct acttttctct ttctttcttc ctttttgtta taaactcaat caatcaatca 720

aaactgcaga tgggtaaaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa gtttttgatc 780

gaaaagttcg acagcgtctc cgacttgatg cagctctcgg agggcgaaga atctcgtgct 840

ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcttgcggg taaatagctg cgccgatggt 900

ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc gattccggaa 960

gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ttgacctatt gcatctcccg ccgtgcacag 1020

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gctctcgatg agttgatgct ttgggccgag gactgccccg aagtccggca cctcgtgcac 1320

gcggatttcg gctccaacaa tgtcttgacg gacaatggcc gcataacagc ggtcattgac 1380

tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt cttctggagg 1440

ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca tccggagctt 1500

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agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg cgacgcaatc 1620

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tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc cagcactcgt 1740

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cctcccccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtt 1839

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<212> DNA

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<400> 9

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<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

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caattattat tacatcatac cggggtaccc cgattggttt ctctgttggt gc 52

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cggggtaccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttctgtgggt atttttacag 60

caggatg 67

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<212> DNA

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<400> 19

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 25

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 27

gtcggaaatt tctttaggta gatatctttt tgaaagatta catcaattag aagttaacac 60

aattttcggt gttccaggtg attttaattt atcacttttg gataagatct atgaagttga 120

agatgctcat ggaaaaaact ctcttaaatg ggctggtaat gctaatgaat taaatgctgc 180

ttatgctgca gatggttatt ccagagttaa aggtttaggt tgtatagtta caacttttgg 240

tgttggtgaa ttatcagctc ttaatggtat tgctggttct tatgctgaac atgttggtgt 300

tttacatgtt gttggtgttc catcaattag ttctcaagct aaacaattat tattacatca 360

taccggggta ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcggta ccccgattgg 420

tttctctgtt ggtgccactt taggtgcagt aatggcagct caagaaattg atccaaataa 480

gagagttatt ttatttgttg gtgatggttc tttacaatta acagttcaag aaatttctac 540

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tgaagctgaa gatttattta agaataaaga atttggtaag aactccaaga ttagattaat 780

tgaagttatg ttgccaagaa tggatg 806