本发明属于蛋白肽的制备领域，具体涉及一种利用霉菌制备棉籽肽的方法。
背景技术：
棉籽粕是棉籽榨油浸提后的副产物，在我国饼粕类饲料原料中，其产量仅次于豆粕。其内含粗蛋白35-50％，与豆粕相当，其蛋白质功效比值、纯消化率、生物学效价及蛋白质净利用率等指标均接近动物蛋白，必需氨基酸组成与联合国粮农组织(WHO)推荐的氨基酸组成较为接近，营养价值远高于谷类蛋白，是重要的蛋白质来源。
但是，棉籽蛋白结构紧密、相对分子质量大，不易被机体消化吸收，现代科学研究已经表明，小分子肽比等量的氨基酸具有更高的生物活性和营养价值，肽类和氨基酸几乎可以通过小肠绒毛上皮细胞完全吸收利用，进入到血液中，然后输送到生物体的各个部位，肽类被生物体吸收的速度快于等量的游离氨基酸，更快于等量的蛋白质。因此，蛋白质尤其大分子蛋白质须经过消化，降解成小分子肽后才能被吸收利用，
同时，棉酚是棉籽粕中主要的抗营养成分，含量为0.11-0.18％，其中，具有活性醛基和活性羟基的游离棉酚毒性较大，含量超过安全界限，因此，用含有棉酚的棉籽粕作为蛋白质来源，直接饲喂动物，易导致畜禽生长迟缓、繁殖率下降，中毒甚至死亡。并且，这种毒性游离棉酚可以和饲料中蛋白氨基酸残基结合，生成不溶性复合物，与消化道中的蛋白水解酶结合，抑制其活性，由此降低蛋白质的利用率。
因此，只有通过脱酚处理的棉籽产品才是相对安全的。根据国家标准GB-13078-91，原料棉籽饼粕中游离棉酚允许量≤1200mg/kg，世界卫生组织建议的棉酚相对安全的含量为≤400mg/kg。
目前，棉籽粕中棉酚的降解方法常见的有物理法和化学法，但是，物理法工作量大，工艺条件苛刻，成本高，化学法存在易产生物质残留，对机体产生毒副作用，且蛋白质降解率低，棉酚脱毒效率不明显等问题。目前，微生物发酵处理法被认为是安全、脱毒效果好、生产成本低、最有发展前途的脱毒方法。
中国专利CN 104342471 A公开了“一种脱酚棉籽蛋白肽的制备方法”中通过枯草芽苞杆菌发酵的方法对棉籽粕进行脱毒处理，该方法处理后，原料棉籽粕中棉酚含量从0.15％降至0.03％-0.035％，脱毒效果不够彻底，并且发酵时间长。
中国专利CN 104273328 A通过霉菌和芽孢杆菌菌种混合发酵的方法获得一种棉籽粕饲料，利用半固体发酵的方法，使棉酚含量低于0.01％，但小分子肽含量较低，并且该方法中，黑曲霉菌种接种量为5-15％，芽孢杆菌菌种接种量为20-40％，接种量太大，成本过高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用霉菌制备棉籽肽的方法，将棉籽粕中的蛋白质转化为小分子肽，提高蛋白质的吸收利用率，同时，脱去了棉籽粕中的棉酚等抗营养物质，达到脱酚去毒的功效，提高了棉籽肽的使用安全性。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种利用霉菌制备棉籽肽的方法，包括以下步骤：
1)制备发酵底物
将棉籽粕粉碎，过筛，与硫酸铵、氯化钠混合，加水搅拌均匀；
2)制备发酵液
斜面培养：将霉菌菌株接种到固体斜面培养基上，28～30℃下恒温培养24-48h；
种子液培养：无菌条件下，用生理盐水冲洗固体斜面培养基，获得活化的霉菌种子液，并接入到种子液培养基中，接种量为3-6％，得到发酵液，于28～30℃、转速150-250rpm条件下培养48-72h；
3)液体发酵
将步骤2)所得的发酵液与步骤1)所得的发酵底物充分混合，发酵液的接种量为3-6％，进行好氧发酵，得到发酵棉粕；
4)喷雾干燥
将步骤3)中所得发酵棉粕进行喷雾干燥，制得棉籽肽。
进一步，步骤1)中，各组分质量百分数为：棉籽粕5-10％，硫酸铵2-8％，氯化钠0.5-1％，水分85-90％，自然pH值。
优选地，步骤2)中所述霉菌菌种为黑曲霉、米曲霉、长柄木霉、孤独腐质霉、绳状青霉和棘孢曲霉中的一种或几种。
进一步，当所述霉菌菌种为两种以上时，制备每种霉菌菌株对应的种子液、发酵液，在步骤3)中，发酵液与发酵底物混合前，先混合不同霉菌菌种的发酵液。
进一步，步骤2)中所述的霉菌固体斜面培养基为：按重量份，马铃薯100-200份，葡萄糖10-20份，琼脂10-20份，MgSO4 0.2-1.0份，NaCl0.5-1份，FeSO4 0.002-0.05份，K2HPO40.3-1.2份，水1000-1500份，自然pH值，110-130℃灭菌20-30min。
又，步骤2)中，所述的种子液培养基为：按重量份，蛋白胨10-20份，酵母提取物3-8份，NaCl 2-6份，水1000-1500份，自然pH值，110-130℃灭菌20-30min。
优选地，步骤3)中，发酵条件为：温度28-40℃、自然pH值，通风量0.02-0.35vvm，转速150-250rpm，发酵时间48-60h。
优选地，步骤4)中喷雾干燥温度为80-120℃。
优选地，步骤1)中，棉籽粕粉碎后，过10-60目筛。
本发明中接种量指接入的种子液体积占接种后培养液总体积的比例。
本发明以棉籽粕为原料，选择霉菌菌种，通过液体发酵，可将棉籽粕中的大分子蛋白质转化为分子量较小的蛋白肽，有利于机体吸收，本发明所得棉籽肽产品中小肽含量相比发酵前提高300％以上。
利用本发明制备方法，将原料棉籽粕中棉酚含量从0.177％降至0.007％以下，棉酚降解率高，脱毒较彻底，产品质量达到并优于世界卫生组织建议的棉酚相对安全含量(≤0.04％)的要求。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明选择霉菌菌种，将棉籽粕中的大分子蛋白质降解为小分子肽，对棉籽粕中的棉酚进行了大量的降解，获得的棉籽肽产品中，粗蛋白含量比发酵前提高了10％以上，小分子肽含量比发酵前提高了300％以上，利于机体吸收，游离棉酚的降解率达96％以上，棉酚含量降至0.007％以下，降低了毒性，提高了棉籽肽的总体质量，缩短生产周期，大大降低生产成本。
2)本发明霉菌菌株接种量小，发酵时间缩短，提高了生产效率。
3)本发明采用喷雾干燥的方法，其干燥速度非常迅速，相比普通低温干燥，干燥时间减少80％以上，生产效率高，生产能力大，产品质量稳定。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1利用霉菌制备棉籽肽的方法，包括以下步骤：
1)制备发酵底物
将棉籽粕粉碎，过20目筛后与硫酸铵、氯化钠混合，加水搅拌均匀，按重量比例，原料组分为：棉籽粕7％，硫酸铵2.5％，氯化钠0.5％，水分90％，自然pH值。
2)制备发酵液
斜面培养：将黑曲霉菌株接种到固体斜面培养基上，30℃下恒温培养48h；其中，所述固体斜面培养基为：马铃薯(去皮)150g，葡萄糖15g，琼脂15g，MgSO4 0.25g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.02g，K2HPO4 0.5g，将各组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min。
种子液培养：无菌条件下，用生理盐水将活化的斜面菌种洗下，并按照接种量4％的比例接入到种子液培养基中，获得发酵液，于30℃、转速200rpm条件下培养48h。
所述种子液培养条件为：蛋白胨12g，酵母提取物6g，NaCl 5g，将上述组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min。
3)液体发酵
将步骤2)所得的发酵液按接种量4％，体积比例，与步骤1)所得的发酵底物充分混合，于发酵罐中进行好氧发酵，发酵条件为：温度35℃、自然pH值，通风量0.33vvm，转速200rpm，发酵时间48h。
4)喷雾干燥
将步骤3)中所得发酵棉粕于90℃进行喷雾干燥制得棉籽肽。
实施例2利用霉菌制备棉籽肽的方法，包括以下步骤：
1)制备发酵底物
将棉籽粕粉碎，过20目筛，与硫酸铵、氯化钠混合，加水搅拌均匀，按重量比例，原料组分为：棉籽粕10％，硫酸铵3％，氯化钠1％，水分86％，自然pH值。
2)制备发酵液
斜面培养：将黑曲霉、米曲霉菌株分别接种到固体斜面培养基上，30℃下恒温培养48h；所述固体斜面培养条件为：马铃薯(去皮)180g，葡萄糖13g，琼脂12g，MgSO4 0.29g，NaCl 0.6g，FeSO4 0.03g，K2HPO4 0.8g，将上述各组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min。
种子液培养：无菌条件下，用生理盐水将活化的黑曲霉、米曲霉菌种洗下，并按照各自接种量6％的比例接入到种子液培养基中，分别获得黑曲霉发酵液和米曲霉发酵液，于30℃、转速200rpm条件下培养48h；
所述种子液培养条件为：蛋白胨14g，酵母提取物7g，NaCl 6g，将上述组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min。
3)液体发酵
将步骤2)所得的发酵液按等体积混合，与步骤1)所得的发酵底物充分混合，其中，混合发酵液的接种量为6％，于发酵罐中进行好氧发酵，发酵条件为：温度35℃、自然pH值，通风量0.33vvm，转速200rpm，发酵时间60h。
4)喷雾干燥
将步骤3)中所得发酵棉粕于80℃进行喷雾干燥制得棉籽肽。
实施例3利用霉菌制备棉籽肽的方法，包括以下步骤：
1)制备发酵底物
将棉籽粕粉碎，过20目筛，与硫酸铵、氯化钠混合，加水搅拌均匀，按重量比例，原料组分为：棉籽粕8％，硫酸铵2％，氯化钠1％，水分89％，自然pH值。
2)制备发酵液
斜面培养：将黑曲霉、米曲霉、长柄木霉菌株分别接种到固体斜面培养基上，30℃下恒温培养48h；所述固体斜面培养条件为：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖15g，琼脂12g，MgSO40.29g，NaCl 0.6g，FeSO4 0.06g，K2HPO4 0.8g，将上述各组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min；
种子液培养：无菌条件下，用生理盐水将活化的黑曲霉、米曲霉、长柄木霉菌种洗下，并按照各自接种量5％的比例分别接入到种子液培养基中，获得黑曲霉发酵液、米曲霉发酵液和长柄木霉发酵液，于30℃、转速200rpm条件下培养48h。
所述种子液培养条件为：蛋白胨15g，酵母提取物7g，NaCl 7g，将上述组分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃灭菌30min；
3)液体发酵
将步骤2)所得的发酵液按等体积混合接种量按体积的5％与步骤1)所得的发酵底物充分混合，于发酵罐中进行好氧发酵，发酵条件为：温度35℃、自然pH值，通风量0.33vvm，转速200rpm，发酵时间60h。
4)喷雾干燥
将步骤3)中所得发酵棉粕于100℃进行喷雾干燥制得棉籽肽。
实施例4检测棉籽肽中粗蛋白、小肽、游离棉酚含量
对本发明实施例1-3制备的棉籽肽进行检测，以未发酵的棉籽粕作为对比例。
其中，粗蛋白的含量检测参考国家标准GB/T6432-94。
小肽的含量检测方法参考轻工业行业标准QB/T 2653-2004。
游离棉酚检测方法参考国家标准GB13086-91。
检测结果如表1所示。
表1
由表1可知，与未发酵的棉籽粕相比，实施例1棉籽粕在发酵后其粗蛋白含量提高12.83％，小肽提高率为300％，游离棉酚降解率达96.0％，实施例2棉籽粕在发酵后其粗蛋白含量提高22.07％，小肽提高率为414％，游离棉酚降解率达96.6％，实施例3棉籽粕在发酵后其粗蛋白含量提高15.99％，小肽提高率为357％，游离棉酚降解率达97.2％。
利用本发明，可将棉籽粕小肽含量提高300％以上，游离棉酚的降解率达96％以上。