一种脐带血间充质干细胞培养液的制作方法

本发明涉及细胞培养技术领域，更具体的说，涉及一种用于脐带血间充质干细胞的培养液。

背景技术：

脐带血间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带血间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。

脐带血间充质干细胞的培养体系主要应用含动物血清(如胎牛血清)的培养基，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，含动物血清培养液会导致培养过程中病毒等病原体污染的风险大大增加，异种血清亦会导致过敏反应，因此，不含有动物血清的培养液成为了培养液的主流选择。通过无血清培养体系和相应的添加物，能够模拟出血清的效用，能促使细胞生长。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题之一在于：含有动物血清的培养液，容易引发过敏免疫反应，病原体污染的风险高。

本发明所要解决的技术问题之二在于：现有的无血清培养体系细胞在体外的增值慢、连续传代次数少。

本发明为了解决上述技术问题，使用如下技术方案：提供一种脐带血间充质干细胞培养液，包括基础培养基α-DMEM和添加物，所述添加物包括血清替代成分、其他营养成分、细胞因子，其中，所述血清替代成分包括：

牛血清白蛋白 50～200mg/L

胰岛素 5～20mg/ml

转铁蛋白 0.05～0.25μg/ml；

所述其他营养成分包括：

所述细胞因子包括：

bFGF 5～50ng/ml。

在本发明提供的脐带血间充质干细胞培养液中，所述血清替代成分还包括：

B-27 10～20ml/L。

在本发明提供的脐带血间充质干细胞培养液中，所述其他营养成分还包括：

丙酮酸钠 50～80mg/L

谷氨酰胺 200～500mg/L。

在本发明提供的脐带血间充质干细胞培养液中，所述其他营养成分还包括：

肌醇 10～25mg/L

青霉素 100U/ml

链霉素 100μg/ml。

在本发明提供的脐带血间充质干细胞培养液中，所述细胞因子还包括：

黄体酮 5～100ng/ml

白介素3 2～10ng/ml

hEGF 5～10ng/ml。

实施本发明的技术方案，具有如下有益效果：本发明的脐带血间充质干细胞无血清培养基，避免临床中可能产生的过敏免疫反应，并降低病毒等病原体污染的几率，可有效提高脐带血间充质干细胞在体外的增值分化。

附图说明

图1使用α-DMEM培养基培养15d后的脐带血间充质干细胞；

图2使用本发明实施例6中培养液培养15d后的脐带血间充质干细胞。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术之缺陷，提供一种新型的用于脐带血间充质干细胞的培养液。包括基础培养基α-DMEM和添加物，所述添加物包括血清替代成分、其他营养成分、细胞因子，其中，所述血清替代成分包括：

牛血清白蛋白 50～200mg/L

胰岛素 5～20mg/ml

转铁蛋白 0.05～0.25μg/ml；

所述其他营养成分包括：

所述细胞因子包括：

bFGF 5～50ng/ml。

本发明所述的基础培养基是α-DMEM，含有细胞生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多数细胞生长。将α-DMEM的基本营养成分溶解于无热源超纯水中(电阻率为18.2Ω)，并将酸碱度调至6.8～7.4，经过滤灭菌处理后，即为基础培养基。

一种脐带血间充值干细胞的无血清培养基的使用方法，培养脐带血间充质干细胞过程如下：a)在制备好α-DMEM培养液中按浓度加入上述添加物制混匀得无血清培养液。

本发明中所述牛血清白蛋白，是牛血清中的一种球蛋白，常见于代替血清。牛血清白蛋白为负极，可与水分，盐分，脂肪酸，维他命，荷尔蒙结合并把这些成分带入细胞。

本发明中所述胰岛素可作用与细胞表面的胰岛素受体，增强细胞对葡萄糖的摄入，运输和利用，又可促进氨基酸的吸收，可维持细胞分化，从而增强细胞的活力与功能，促进细胞的生长。

本发明中所述转铁蛋白可作用与细胞表面的转铁蛋白受体，将铁元素运输到细胞体内从而调节铁元素的代谢。转铁蛋白还可与其他微量元素一起调节细胞的生长及功能表达。

本发明中所述β-巯基乙醇是一种还原剂，可防治二硫键被氧化，从而保护蛋白不被破环。其在细胞培养中的主要作用是降低氧气其对细胞产生的氧化损伤。

本发明中所述叶酸(维生素B9)，维生素B12,维生素C，盐酸吡多醇(维生素B6)及核黄素(维生素B2)为维持细胞生长的细胞活性物质。在细胞代谢中起调节和控制作用。维生素C具有稳定的抗氧化作用，它在培养液中可以长时间保持活性，大大延缓干细胞衰老的速度，且有助于为细胞提供一个稳定的微环境。

本发明所述bFGF为人碱性成纤维细胞生长因子，是一种肝素结合的生长因子，可促进细胞增殖。在胚胎干细胞培养中，使细胞在无血清培养基中保持未分化形态。

优选的，所述血清替代成分还包括：

B-27 10～20ml/L。

本发明中所述B-27是一种无血清添加剂，购于Invitrogen公司，用于维持细胞的生长及长期活性。

优选的，所述其他营养成分还包括：

丙酮酸钠 50～80mg/L

谷氨酰胺 200～500mg/L。

本发明中所述丙酮酸钠是一种细胞代谢碳源。在葡萄糖缺少的情况下，可以部分替代葡萄糖作为碳源，促进细胞的生长。

本发明中所述谷氨酰胺，可为干细胞提供持续能量，干细胞在分化过程中对能量的需求较高，谷氨酰胺不仅可以持续为干细胞提供能量，而且可以避免因自然代谢而造成的有毒代谢物的积累。

优选的，所述其他营养成分还包括：

肌醇 10～25mg/L

青霉素 100U/ml

链霉素 100μg/ml。

本发明中所述肌醇参与碳水化合物，磷脂代谢，及离子平衡等生理活动且可促进其他活性物质发回效应，可促进细胞壁的构建。

本发明中无血清培养基中还含有抗生素。所述抗生素优选为青霉素和链霉素。抗生素的作用是防治细胞培养的过程中受到污染。

优选的，所述细胞因子还包括：

黄体酮 5～100ng/ml

白介素3 2～10ng/ml

hEGF 5～10ng/ml

本发明中无血清培养液中添加的黄体酮可刺激间充值干细胞分泌纤连蛋白，促进干细胞的黏附。加入黄体酮可代替加入纤连蛋白，降低培养液成本。

本发明中所示白介素3(Interleukin3)有利于干细胞的生长和活性维持，同时可抑制脐带血间充质干细胞的早期增值分化。

本发明中所描述的hEGF为人表皮生长因子，可促进细胞增殖。

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

实施例5

实施例6

实验结果与讨论

将上述实施例1-6中的细胞培养液和基础培养基α-DMEM(对比例)用于脐带血间充质干细胞的培养，具体如下：

无菌收集人体脐带(约10cm)，并浸泡于还有双抗的细胞培养液中密封运输到实验室。在生物安全柜中将人脐带用PBS反复洗涤，并用解剖刀除去羊膜及静脉动脉。将剩余组织剪碎未肉糜，并用PBS反复冲洗组织至离心后未见红细胞。将组织块，接种于0.2％明胶包被过的75cm²培养瓶中(10cm脐带培养在两个培养瓶中)，并加入培养液约10ml，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。5～7天后，用培养液冲洗掉组织块，并换液添加细胞生长因子。接种15天后，取细胞进行检测，测得细胞纯度为99.9％，细胞存活率为99.7％。原代细胞培养至细胞密度达到80～90％后进行第一次传代，培养2～3天后进行传代，每次传代时补半量的新鲜细胞因子。脐带血间充质干细胞在不同的培养液中扩增倍数有显著区别。实施例1与实施例4略优于对比例；实施例2与实施例3略优于实施例1与实施例4。实施例6明显优于对照组及其他实施例。脐带血间充质干细胞在不同实施例的培养液中细胞凋亡的情况与对照组无明显差异。实施例1-5中的细胞培养液可使脐带血间充质干细胞连续传代10次以上。实施例6中的细胞培养液可使脐带血间充质干细胞连续传代20次以上。

将使用α-DMEM培养基培养15d后的脐带血间充质干细胞和使用本发明实施例6中培养液培养15d后的脐带血间充质干细胞使用显微镜检测，结果如图1和图2所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。