一种喉癌细胞的核酸适配体及试剂盒的制作方法

本发明属于核酸适配体领域，尤其涉及一种可用于检测人喉癌细胞的核酸适配体及其筛选方法和应用。

背景技术：

喉癌是常见的头颈肿瘤之一，在呼吸道肿瘤中发病率居第二位。有国内外调查表明，喉癌的发病率不断升高，每年大约增加25％。2008年世界上男性喉癌的发病率估计为5.1/100000，男性病人死亡率约为2.2/100000。近30年来新的外科手术方法、化疗药物及更先进的放射治疗手段已应用于喉癌的治疗中，与其他头颈癌一样，喉癌患者的总生存率并未得到提高，甚至有所下降。因此早期诊断是提高喉癌生存率的关键，而寻找早期诊断的肿瘤标志物对于胃癌的诊断和治疗则具有十分重要的意义。

核酸适配体(aptamer，也译为核酸识体、适配子)是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。目前，已知核酸适配体(aptamer)是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段。核酸适配体的体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX)技术；所述的SELEX技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段(如图1所示)；相比抗体等多肽类的适配体(peptide aptamer)，核酸适配体的优势相当明显，如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰。

为了能够得到能识别天然构象下膜蛋白的核酸适配体，发展了以细胞为靶标的SELEX技术，即cell-SELEX。与传统SELEX针对单一分子进行筛选不同，cell-SELEX的靶标为一个完整的活细胞。通过cell-SELEX技术已经获得了多类细胞系的核酸适配体，其中癌细胞系包括淋巴细胞性白血病细胞，骨髓性白血病细胞，肝癌细胞，小细胞肺癌细胞以及非小细胞肺癌细胞。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测人喉癌细胞株Hep-2的核酸适配体及其衍生物，还相应提供前述核酸适配体的筛选方法和应用。

本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以喉癌细胞株为正筛靶标，以鼻咽癌细胞株为反向筛选靶标，筛选与Hep-2特异结合的核酸适配体。

本发明提供一种特异性结合人喉癌细胞的核酸适配体的方法，包括如下步骤：

(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机文库：5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(40N)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’；上游引物：5’-FAM-ACAATGATCGAGTCGAGCAC-3’；

下游引物：5’-Biotin-TGGACGGATGAGGCAAGCAG-3’；

(2)SELEX筛选特异核酸适体文库：

(3)PCR扩增文库；

(4)DNA单链文库的制备；

(5)反向筛选：以鼻咽癌细胞5-8F为对照，进行反向筛选；

(6)正向筛选；

(7)多轮筛选：将步骤6得到的DNA单链文库替代步骤4中的DNA单链文库，重复上述步骤5-6的操作；最终可得到富集度高的序列，即为可用于检测人喉癌细胞株Hep-2的核酸适配体。

本发明提供一种喉癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO：1-2所示。

序列1：(SEQ ID NO：1)

5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(TAGCACCGCTCGTAGGGGAATGCGTGTTGGACCACGGTGG)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’

序列2：(SEQ ID NO：2)5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(ATCGTGACTGCGGGATCTGTGAACGTCGACTGATCGTACG)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’

本发明中，所述的喉癌细胞选自候癌细胞株Hep-2。

上述核酸适配体中，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置可被修饰。

本发明提供一种喉癌的诊断试剂盒，其包含上述的核酸适配体。

进一步地，本发明提供所述的核酸适配体在制备用于检测喉癌细胞的试剂中的应用。

优选的，其中检测喉癌细胞的试剂为用于喉癌组织切片中喉癌细胞成像的试剂。其中所述喉癌细胞为Hep-2细胞。

进一步地，本发明提供所述核酸适配体在制备治疗靶向喉癌的药物中的应用，所述适配体作为抗肿瘤药物的载体使用。

本发明还提供所述的核酸适配体在制备喉癌的肿瘤标志物中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所涉及的核酸适配体具有特异性强，亲和性高，分子量小、稳定性好、制备简单、成本低、易修饰、无免疫原性的优点，并可实现快速的分子诊断。本发明中的各条适配体均能与靶细胞Hep-2稳定结合，而不与其他对照细胞结合。通过适当的修饰或者标记，可用于人喉癌的快速检测和诊断。此外，该核酸适配体其本身还可以作为药物或者药物载体，通过包封相应的药物或者治疗制剂可以实现人喉癌的靶向治疗。本发明对人喉癌的临床检测、诊断和治疗都具有非常重要的意义。

附图说明

图1为序列1、2所示的适配体与喉正常组织(A)、喉癌组织(B)切片的荧光强度差异比较。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：特异性结合喉癌细胞的核酸适配体的筛选

1.合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物。

随机文库：5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(40N)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’；文库左端的固定序列即是上游引物，文库右端的固定序列与下游引物的序列反向互补。

上游引物：5’-FAM-ACAATGATCGAGTCGAGCAC-3’

下游引物：5’-Biotin-TGGACGGATGAGGCAAGCAG-3’。

2.SELEX筛选特异核酸适体文库

1)细胞培养：RPMI 1640培养基加10％胎牛血清培养人喉癌细胞株Hep-2细胞至铺满瓶底95％，去除培养基后用10mL washing buffer洗涤，与1mL含1nM随机序列的binding buffer在冰上孵育15min，弃溶液；

2)细胞结合：用500μL binding buffer溶解20nmol上述的随机文库，95℃加热5min后迅速放入冰中；在随机文库中补充binding buffer至终体积为1mL，与步骤2.1处理后的Hep-2细胞在冰上孵育30min。

3)解离：孵育完后倒出孵育培养瓶内的液体，用10mL 4℃的washing buffer洗涤孵育培养瓶中的细胞，最后加入500μL的灭菌水，用细胞刮子将细胞轻轻刮下来，并收集至1.5mL的EP管中，然后再加入250μL的灭菌水将残留的细胞刮下并收集到EP管中，最后加入250μL的灭菌水将瓶壁和细胞刮子洗一遍，并收集洗涤液至EP管中，总体积1000μL。置于沸水中水浴10分钟后立即置于冰上冷却5分钟，12000rpm，4℃离心5分钟，取上清标记为“第一轮筛选文库”。

3.PCR扩增文库：取100μL筛选所得的Hep-2特异核酸适配体文库进行常规PCR扩增，扩增条件为：94℃3min，94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，经合适循环轮数，最后72℃延伸3min。注意，第一轮筛选后需将全部所得的Hep-2特异核酸适体文库预扩增10个循环，再进行本步骤的扩增，得到扩增产物。

4.DNA单链文库的制备：将100μL链霉亲和素修饰的琼脂糖微球5000rmp离心去上清，再用500μL PBS洗涤，离心去上清；重复洗涤一次。将步骤3所得的双链DNA与琼脂糖微球在常温下孵育半小时，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的相互作用将双链DNA结合到琼脂糖微球表面；5000rmp离心去上清，用PBS离心洗涤两次；然后加入150mM NaOH溶液500μL至琼脂糖微球中用于双链DNA的变性处理，37℃反应10min，5000rmp离心5min，收集上清；除盐柱用10mL无菌水洗涤后，加入碱变性后收集得到的上清液，自然滴完。加入1mL无菌水，收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库。

5、反向筛选：以鼻咽癌细胞5-8F为对照，进行反向筛选。首先培养鼻咽癌细胞5-8F至铺满瓶底90％左右，且保证生长状态良好，然后用WB清洗三次，每次3mL。将预处理好的文库加入培养瓶并置于冰上孵育。30min后收集细胞上清液，其中含有未结合在对照细胞表面的ssDNA，用于后续正筛。

6.正向筛选：用步骤5获得的上清液代替步骤2.2中的随机文库，重复上述步骤2～4的步骤，得到Hep-2特异的核酸适配体单链文库。

7.多轮筛选：将步骤6得到的DNA单链文库替代步骤4中的DNA单链文库，重复上述步骤5-6的操作。重复筛选过程中用流式细胞术监测所得DNA单链文库对Hep-2细胞的识别能力，直至10轮筛选后DNA单链文库对Hep-2细胞的识别能力符合要求。将所得产物经克隆测序分析，对测序结果整理分析后，最终可得到富集度高的4条序列，即为可用于检测人喉癌细胞株Hep-2的核酸适配体。

序列1：(SEQ ID NO：1)

5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(TAGCACCGCTCGTAGGGGAATGCGTGTTGGACCACGGTGG)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’

序列2：(SEQ ID NO：2)5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(ATCGTGACTGCGGGATCTGTGAACGTCGACTGATCGTACG)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’

序列3：(SEQ ID NO：3)5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(GACGTTGCTGACGATTGTGTTATTGGCGTGTGATCCTAAG)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’

序列4：(SEQ ID NO：4)5’-ACAATGATCGAGTCGAGCAC(GTCTTGACTACGAAGTGAGCTAATGTCGTATGATCGATCG)CTGCTTGCCTCATCCGTCCA-3’

实施例2：核酸适配体对喉癌细胞的结合特异性分析

运用流式细胞术对筛选到的核酸适配体的结合特异性进行评价。由于筛选中靶细胞为喉癌细胞Hep-2，因此选用的对照细胞除用于反向筛选的鼻咽癌细胞5-8F以外，还包括：正常喉上皮细胞、HGC-27细胞系(胃癌细胞)，A549细胞系(NSCLC，肺癌)，Hela(宫颈癌)，TCA(舌癌)，CNE-2(鼻咽癌)，SMMC-7721、HepG2(肝癌)，EC9706(食管癌)。

设定阈值使得阴性样品的95％细胞平均荧光值都低于该阈值，然后设定不同的信号等级，如小于10％的细胞平均荧光值高于阈值则记为-，10％-35％的细胞平均荧光值高于阈值则记为+，35％-60％的细胞平均荧光值高于阈值则记为++，大于60％而小于85％记为+++，大于85％记为++++。检测结果如下表1所示，可以看出，序列1-2能够特异性结合喉癌细胞Hep-2，而序列3-4除了与喉癌细胞结合外，还非特异性的结合了其他肿瘤细胞。

表1：核酸适配体序列1-4对不同细胞的结合

实施例3：流式细胞仪检测核酸适配体与喉癌细胞Hep-2的解离常数的测定

流式细胞仪检测核酸适配体与喉癌细胞Hep-2的解离常数的测定，具体操作与流式细胞仪检测核酸适配体与靶细胞结合特异性的操作相同。将合成上述4条核酸适配体分别平行配置成不同浓度，分别与等量的靶细胞进行孵育，测定不同核酸适配体浓度下靶细胞的荧光强度。以核酸适配体的浓度为横坐标，相应的荧光强度值为纵坐标，按照公式Y＝Bmax*X/(Kd+X)拟合曲线，得到4条核酸适配体的解离曲线。由解离曲线得到各条核酸适配体的解离常数Kd大小如表2所示。结果表明：4条核酸适配体对喉癌细胞Hep-2均具有很强的结合能力。

表2：核酸适配体序列1-4的解离常数

实施例4：核酸适配体与喉癌组织切片的结合

将石蜡包埋的喉癌组织切片于60℃烤箱中烘烤20min，切片浸于二甲苯中脱蜡两次，每次10min；浸入无水乙醇两次，每次5min；切片依次经过梯度乙醇(90％、85％、70％乙醇各一次，每次2min)，最后浸入PBS；微波修复法对切片进行抗原修复，待冷却至室温，使用PBS洗两次；随后使用含有20％胎牛血清和1mg/ml鲑鱼精DNA的结合缓冲液室温封闭1h；去除封闭液，分别加入生物素标记的适配体核酸序列1、序列2于4℃孵育1h；洗涤缓冲液洗3次，每次5min；随后加入链霉亲和素修饰的量子点，室温孵育0.5h；经洗涤后，封片，荧光显微镜下观察。结果如图1所示，序列1、序列2均能够特异性识别切片中的喉癌细胞，但与正常的喉组织呈现较弱或无结合，从而在临床上可用于喉癌的检测和诊断。

由以上实施例及考察结果可知，通过上述筛选获得的本发明的两条核酸适配体均能特异性识别人喉癌细胞，且两条核酸适配体识别特异性强，对靶标亲和力高，对于喉癌的诊断和检测具有重要意义。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。