一种姜黄素衍生物的制备方法与流程

(一)
技术领域：
本发明涉及一种姜黄素衍生物的制备方法。(二)
背景技术：
：姜黄素为一种橙黄色粉末，难溶于水和乙醚，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜等，熔点为183℃，分子式为c21h20o6，相对分子质量为368.37。姜黄素的β二酮结构存在酮式互变异构，在酸性或中性条件下主要以酮式结构存在，相反，在碱性条件下主要以烯醇式结构存在，在ph2.5-7时，姜黄素呈亮黄色，而在ph>7时呈红色，造成这种现象的原因是由于姜黄素的酚羟基在碱性条件下易电离成酚氧负离子，增强其供电性，同时供吸电子协调作用增强，这一系列作用导致颜色往深色转换。姜黄素在酸性条件下相对稳定，而在碱性或中性条件下容易被降解，研究发现在ph7.2的无血清磷酸缓冲液中，37℃条件下30min后有超过90％姜黄素被降解，其降解产物为阿魏酸、香兰素等。姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗hiv、抗凝血、抗高血压、抗肝脏纤维化等多种生物活性，在临床应用上潜力很大，但由于姜黄素存在水溶性差、在中性或碱性环境中易被降解、在机体内药效不持久、生物利用度低以及选择性低等缺点，限制了其在临床上的广泛应用。目前许多学者在保留姜黄素原有药效的基础上，对其进行结构修饰，通过化学或生物方法制备得到性能更加好、更加稳定的姜黄素衍生物。zhangxing等采用在华根霉(rhizopuschinensis)iffi03043培养液中直接加入底物姜黄素的生长培养转化法制得两种姜黄素衍生物--4'-o-β-d-葡萄糖苷姜黄素(产率为57％)和六氢姜黄素(产率为6.2％)(biocatalysisandbiotransformation,2010,28(5-6):380-386)。申请人在先专利申请201510289729.x提供了一株新菌种少孢根霉须状变种zjph1308以及利用该菌种催化不对称水解制备西他列汀中间体的方法。本发明提出了采用少孢根霉须状变种zjph1308菌株生物转化制备姜黄素得到两种姜黄素衍生物的新方法。利用少孢根霉须状变种zjph1308静息细胞对姜黄素进行微生物转化，不仅可消除培养基中的复杂成分对姜黄素生物转化的影响，还为后期姜黄素转化产物的分离纯化提供了便利。本发明的菌种易培养，含酶源细胞的制备成本低，并且其中的一个姜黄素衍生物--4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol系首次通过微生物转化方法获得。采用微生物转化法对天然产物进行结构修饰具有区域选择性和立体选择性高，反应条件温和、操作简单、成本低廉，环境友好等优点，且生物体系可产生多种性质与功能各异的酶，从而可催化姜黄素底物转化生成具有不同取代方式的系列衍生物，有望从中找到活性更好或具有新结构的姜黄素衍生物，对姜黄素“构效关系”研究具有重要的意义。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种姜黄素衍生物的制备方法，特别是利用少孢根霉须状变种zjph1308细胞生物转化制备4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol和六氢姜黄素。利用少孢根霉须状变种zjph1308静息细胞转化姜黄素制备其衍生物，不仅可以消除培养基成分对姜黄素生物转化过程的影响，而且利于后续姜黄素转化产物的分离纯化。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种姜黄素衍生物的制备方法，所述的方法为：以少孢根霉须状变种(rhizopusmicrosporusvar.rhizopodiformis)zjph1308发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以姜黄素为底物，以ph值5.4～8.0磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～50℃、150～250rpm条件下进行转化反应(优选40℃、200rpm条件下转化48h)，反应结束后将转化液分离纯化，获得4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol和六氢姜黄素。本发明所述少孢根霉须状变种(rhizopusmicrosporusvar.rhizopodiformis)zjph1308保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctccno.m2014645，保藏日期2014年12月14日，该菌株已在先前的专利申请(申请号为201510289729.x，申请日2015年6月1日)中公开。进一步，所述湿菌体的用量以菌体干重计为2～25g/l转化体系(优选9.8g/l)，所述姜黄素底物的初始浓度为20～300mg/l转化体系(优选50mg/l)。进一步，所述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去乙酸乙酯，取浓缩液进样半制备液相进行分离，分别收集保留时间为25.9min和38.5min的流出液，蒸除溶剂后，再进行薄层层析分离，在254nm紫外灯下观察色谱带并标记，将标记的色谱带连同硅胶粉用刮刀从薄层板上刮下，分别收集rf值为0.275和0.475的显色条带，用无水甲醇浸洗三次，蒸除溶剂后，分别获得六氢姜黄素和4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol。进一步，所述半制备液相分离条件为：仪器为岛津lc-60ad，色谱柱为lunac18(2)，5μm；检测波长：280nm，流速：3ml/min，进样量：500μl，流动相：乙腈-水溶液梯度洗脱，所述乙腈与水梯度洗脱体积分别为：20:80(0-10min)、35:65(10-20min)、40:60(20-42min)、从40:60改变为100:0(42-50min)、从100:0改变为20:80(50-65min)。进一步，所述薄层层析分离以体积比为25:25:1的二氯甲烷、正己烷和无水甲醇溶液为展开剂。进一步，所述湿菌体按如下方法制备：(1)斜面培养：将少孢根霉须状变种zjph1308接种至斜面培养基，30℃培养4～5天，获得斜面菌体；所述斜面培养基的终浓度为土豆200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂20g/l，溶剂为水，ph自然；(2)种子培养：从斜面菌体挑选一环菌体接种至种子培养基中，30℃、200rpm培养22h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖20～30g/l、蛋白胨25～35g/l、(nh4)2so41～3g/l、kh2po40.5～1.5g/l、mgso4·7h2o0.5～1.5g/l，ph5～8，溶剂为水；优选所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖25g/l、蛋白胨27.5g/l、(nh4)2so43g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l，ph6.0，溶剂为水；(3)发酵培养：以体积浓度2～10％(优选6％)接种量将种子液接种到发酵培养基中，30℃、200rpm发酵培养24h，将菌体取出，蒸馏水洗涤三次，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成：碳源20～30g/l、氮源25～35g/l、kh2po40.5～1.5g/l、mgso4·7h2o0.5～1.5g/l，ph5～8，溶剂为水；所述碳源为下列之一：麦芽糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、糊精或乳糖，优选糊精；所述氮源为下列之一：酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉、玉米浆、氯化铵或硫酸铵，优选蛋白胨。进一步，所述发酵培养基终浓度组成为：糊精20g/l、蛋白胨30g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l，ph6.0，溶剂为水。进一步，所述少孢根霉须状变种zjph1308在生物转化制备姜黄素衍生物中应用，具体为转化制备4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol的应用按如下步骤进行：将少孢根霉须状变种zjph1308发酵培养获得的湿菌体和姜黄素加入ph值为5.4～8.0磷酸缓冲液中构成转化体系，在30℃、200rpm条件下进行转化反应48h，转化结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩至干除去乙酸乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解，将溶解样品进样半制备液相进行分离，收集保留时间为38.5min的流出液，蒸除溶剂，再将样品重溶于甲醇，再进行薄层层析分离，以体积比为25:25:1的二氯甲烷、正己烷和无水甲醇溶液为展开剂，经多次展开后，在254nm紫外灯下观察色谱带并标记，将标记的色谱带连同硅胶粉用刮刀从薄层板上刮下(收集rf值为0.475的显色条带)，用无水甲醇浸洗三次，蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物即为4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol，所述少孢根霉须状变种zjph1308发酵培养获得的湿菌体的用量以菌体干重计为2～20g/l转化体系，优选9.8g/l，所述姜黄素底物的初始浓度为20～300mg/l转化体系，优选50mg/l。进一步，所述少孢根霉须状变种zjph1308在生物转化制备姜黄素衍生物中应用，具体为转化制备六氢姜黄素的应用按如下步骤进行：将少孢根霉须状变种zjph1308发酵培养获得的湿菌体和姜黄素加入ph值为5.4～8.0磷酸缓冲液中构成转化体系，在30℃、200rpm条件下进行转化反应48h，转化结束后，将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩至干除去乙酸乙酯，取浓缩物用色谱甲醇溶解，将溶解样品进样半制备液相进行分离，收集保留时间为25.9min的流出液，蒸除溶剂，将样品重溶于甲醇，再进行薄层层析分离，以体积比为25:25:1的二氯甲烷、正己烷和无水甲醇溶液为展开剂，经多次展开后，在254nm紫外灯下观察色谱带并标记，将标记的色谱带连同硅胶粉用刮刀从薄层板上刮下(收集rf值为0.275的显色条带)，用无水甲醇浸洗三次，蒸除溶剂，获得所述姜黄素衍生物即为六氢姜黄素，所述少孢根霉须状变种zjph1308发酵培养获得的湿菌体的用量以菌体干重计为2～20g/l转化体系，优选9.8g/l，所述姜黄素底物的初始浓度为20～300mg/l转化体系，优选50mg/l。本发明所述经少孢根霉须状变种zjph1308湿菌体生物转化后获得的转化反应液(实验组)，首先进行tlc法分析，与姜黄素标准品、对照组1(转化反应体系中只加入底物姜黄素，不加入酶源细胞)和对照组2(转化反应体系中不加入底物姜黄素，只加入酶源细胞)进行对照，确定实验组的转化液中是否产生新的显色斑点，如果产生新的显色斑点，则将转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩至干，取旋蒸后所得浓缩物用色谱甲醇重新溶解、微滤(0.45μm)处理后进行hplc分析，确定是否出现新的特征峰(与姜黄素标准品、对照组1和对照组2相比)。如果出现新的特征峰，将生物转化后获得的转化液离心，取上清液用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压浓缩后进样半制备液相分离，收集保留时间为25.9min的流出液，蒸除溶剂，再进行薄层层析分离，在254nm紫外灯下观察色谱带并标记，将标记的色谱带连同硅胶粉用刮刀从薄层板上刮下(收集rf值为0.275的显色条带)，经无水甲醇浸洗三次，除去溶剂，获得所述姜黄素衍生物之一(六氢姜黄素)；收集保留时间为38.5min的流出液，蒸除溶剂，再将样品重溶于甲醇后进行薄层层析分离，在254nm紫外灯下观察色谱带并标记，将标记的色谱带连同硅胶粉用刮刀从薄层板上刮下(收集rf值为0.475的显色条带)，用无水甲醇浸洗三次后，除去溶剂，即获得所述姜黄素衍生物之二(4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol)。分别采用高效液相色谱法分析其纯度。取纯度在95％以上的组分进行高分辨率质谱ms，1h-nmr和13c-nmr检测，鉴定其结构。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用少孢根霉须状变种zjph1308静息细胞为催化剂的生物转化方法对姜黄素进行结构修饰，由此获得相应的衍生物，其中六氢姜黄素产率为35.8％，4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol产率为33.9％，并且化合物4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol是首次通过微生物转化姜黄素方法获得。姜黄素结构修饰物的药理或生物活性较修饰前的姜黄素底物有不同程度的改善；本发明生物转化得到的化合物4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol与已报道的化学合成相比，工艺过程简单，环境友好，生物催化剂为微生物菌体，成本低廉。(四)附图说明图1本发明利用少孢根霉须状变种zjph1308微生物转化制备姜黄素衍生物的流程图。图2实施例1姜黄素转化产物的tlc图谱示意图：a为tlc图谱照片，b为a的示意图，1为实验组样品，2为对照组1样品，3为对照组2样品；a，b为少孢根霉须状变种zjph1308的姜黄素转化产物的显色斑点；c为对照组1样品产生的斑点。图3实施例1姜黄素转化产物的hplc图谱：a为实验组样品；b为对照组1样品；c为姜黄素标准品；d为对照组2样品；峰1-峰4对应的时间分别为t1＝23.785min，t2＝29.403min，t3＝35.896min，t4＝45.346min。图4实施例1姜黄素转化产物2(t＝29.4min)的核磁氢谱图(1h-nmr)。图5实施例1姜黄素转化产物2(t＝29.4min)的核磁碳谱图(1c-nmr)。图6实施例1姜黄素转化产物4(t＝45.3min)的高分辨率质谱图(ms)。图7实施例1姜黄素转化产物4(t＝45.3min)的核磁氢谱图(1h-nmr)。图8实施例1姜黄素转化产物4(t＝45.3min)的核磁碳谱图(1c-nmr)。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：姜黄素转化产物的制备(1)斜面培养：将少孢根霉须状变种zjph1308接种至斜面培养基，30℃培养4～5天，即得到斜面菌种；所述斜面培养基终浓度组成为：土豆200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂粉20g/l，ph自然，溶剂为水，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面；(2)种子培养：从步骤(1)斜面菌体挑取一环菌体接种至装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，30℃、200rpm培养22h，制备得到种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖25g/l、蛋白胨27.5g/l、(nh4)2so43g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l，ph6.0，溶剂为水，121℃灭菌20分钟；(3)用于制备姜黄素衍生物酶源细胞的初始发酵培养：以体积浓度6％接种量将种子液(步骤(2)制备)接种到装有100ml初始发酵培养基的250ml摇瓶中，30℃、200rpm培养24h，得到发酵液，离心，收集湿菌体；所述初始发酵培养基终浓度同步骤(2)种子培养基终浓度组成；(4)生物转化方法：实验组：将步骤(3)获得的湿菌体用蒸馏水洗涤后，将湿菌体移入含有20ml蒸馏水中，同时加入姜黄素底物构成转化体系20ml，姜黄素初始浓度为50mg/l，湿菌体加量以菌体干重计为9.8g/l。设置对照组1：将姜黄素加入到蒸馏水20ml中，使其终浓度为50mg/l。设置对照组2：将步骤(3)获得的湿菌体加入到蒸馏水20ml中，湿菌体加入量以菌体干重计为9.8g/l。将各组实验样品在30℃、200rpm条件下转化48h，转化结束后，将转化液离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50℃减压浓缩至干除去乙酸乙酯，各组浓缩物用色谱甲醇溶解后待hplc检测。(5)分析检测①薄层层析检测(tlc)：用毛细点样管分别吸取一定量的实验组样品、对照组1样品、对照组2样品和姜黄素标准品，分别点样于预先活化的硅胶薄层板上，展层剂为二氯甲烷：正己烷：甲醇＝25：25：1(v/v/v)，于254nm紫外灯下将实验组样品与对照组样品和标准品相比较，采用碘熏蒸法观察是否产生新的显色斑点。②高效液相色谱检测(hplc)：所有样品进样检测前先用0.45μm微孔滤膜过滤，将实验组样品谱图与对照组1样品、对照组2样品和姜黄素标准品进行比对，确定是否出现新的物质峰。仪器型号为安捷伦lc-1200，色谱柱为shim-packvp-ods(shimadzu)，检测波长：280nm，流速：0.5ml/min，进样量：10μl，流动相：乙腈-水溶液，梯度洗脱条件如下表1：表1.hplc梯度洗脱条件实验组样品经tlc检测出现两个新的显色斑点(见图2中的a(rf值为0.275)和b(rf值为0.475)所示)，hplc法检测得到四个微生物转化产物(图3中的峰1-峰4所示)，其中hplc图谱显示产物2(t＝29.4min，即tlc检测时rf值为0.275时出现的显色斑点)和产物4(t＝45.3min，即tlc检测时rf值为0.475时出现的显色斑点)的峰面积较高，含量较多，为少孢根霉须状变种zjph1308的两个主要的姜黄素转化产物。(6)转化产物的分离纯化：利用半制备液相对上述两个姜黄素转化主要产物(即转化液经离心、萃取、减压浓缩后的浓缩物)进行分离。仪器型号为岛津lc-60ad，色谱柱为lunac18(2)色谱柱(5μm)，检测波长：280nm，流速：3ml/min，进样量：500μl，流动相：乙腈-水溶液，梯度洗脱条件如下表2：表2.半制备hplc梯度洗脱条件根据分析型液相色谱的出峰时间与峰型情况分析，推断半制备液相分离时保留时间为25.9min的产物与分析型液相保留时间为29.4min的产物可能为同一个产物，为进一步验证推断结果，收集半制备液相保留时间为25.9min的流出液，蒸除溶剂，再将样品重溶于色谱甲醇，之后，对该样品进行分析液相检测，确认其保留时间为29.4min，表明该物质确实为制备的目标产物2。为进一步提高产物纯度，对收集的保留时间为25.9min的流出液进行浓缩，并进行薄层层析分离，以体积比为25:25:1的二氯甲烷、正己烷和无水甲醇溶液为展开剂，经多次展开后，在254nm紫外灯下观察色谱带并标记，将标记的色谱带连同硅胶粉用刮刀从薄层板上刮下(收集rf值为0.275的显色条带)，用无水甲醇浸洗三次，蒸除溶剂，利用hplc法检测纯度(检测条件同步骤(5))，经过分离纯化，得到产物2(t＝29.4min)。步骤同上，收集半制备液相保留时间为38.5min的流出液，将其浓缩后进行薄层层析分离，在254nm紫外灯下观察色谱带并标记，将标记的色谱带连同硅胶粉用刮刀从薄层板上刮下(收集rf值为0.475时的显色条带)，用无水甲醇浸洗三次，蒸除溶剂，采用hplc法检测纯度(检测条件同步骤(5))，经过分离纯化，得到产物4(t＝45.3min)。对制备得到的2个姜黄素衍生物分别进行ms、1h-nmr和13c-nmr检测，并对其进行结构鉴定。经鉴定，推断转化产物2(t＝29.4min)为六氢姜黄素，其结构式为：该化合物具有以下理化性质：白色结晶，推断其分子式为c21h26o6。1h-nmr结果为：1h-nmr(meod):δ＝1.71(2h,m,h-2)；δ＝2.60(4h,m,h-1,7)；δ＝2.78(4h,m,h-4,6)；δ＝3.83(3h,s,h-och3)；δ＝3.84(3h,s,h-och3)；δ＝4.02(h,m,h-3)；δ＝6.62(2h,d,h-6')；δ＝6.70(2h,dd,h-5')；δ＝6.77(2h,s,h-2')，如图4所示。13c-nmr结果为：δ29.3(c-1),31.4(c-7),38.3(c-6),45.4(c-2),55.9(3',3″ome),66.9(c-5),111.1(c-2',2″),111.3(c-2',2″),114.4(c-5'/5″),120.7(c-6',6″),120.9(c-6',6″),132.5(c-1',1″),133.7(c-1',1″),143.7(c-4',4″),144.0(c-4',4″),146.4(c-3',3″),146.5(c-3',3″),211.3(c-3),如图5所示。经鉴定，推断转化产物4(t＝45.3min)为4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol，其结构式为：该化合物具有以下理化性质：淡黄色粉末，推断其分子式为c21h28o5。通过高分辨率ms得到m/z为359.1855，因此，可推断出其分子量为360，如图6所示。1h-nmr结果为：1h-nmr(meod):δ＝6.75(2×d,2h),δ＝6.70(2×d,2h),δ＝6.61(2×dd,2h),δ＝3.83(2×s,6h),δ＝3.45-3.57(m,1h),δ＝2.63-2.72(m,1h),δ＝2.50-2.60(m,4h),δ＝1.21-1.85(m,8h),如图7所示。13c-nmr结果为：δ＝147.40(c),δ＝144.03,δ＝143.99,δ＝134.19,δ＝133.97,δ＝120.39(2c),δ＝114.70,δ＝114.62,δ＝111.83,δ＝111.80,δ＝70.28,δ＝54.99(2c),δ＝39.14,δ＝36.79,δ＝35.03,δ＝31.52,δ＝31.19,δ＝24.86,如图8所示。据报道，六氢姜黄素的生物活性和药理活性较底物姜黄素都得到了较大的改善，稳定性也有所提高。例如：pfeiffer等人将六氢姜黄素和姜黄素同时置于37℃，0.1mph7.4的磷酸盐缓冲液中，放置24h后，用hplc检测两者的降解率，研究发现，姜黄素在1h内降解率已达90％，而六氢姜黄素在24h内没有明显的降解(pfeiffere,hoehlesi,walchsg,etal.curcuminoidsfromreactiveglucuronidesinvitro.journalofagriculturalandfoodchemistry,2007,55:538-544.)。针对4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol化合物的研究目前还报道很少，effienurtjahja-tjendraputra等人研究发现该化合物对于抑制cox-1酶有一定的活性，但是活性并不十分理想，还需要对该化合物进行结构的修饰改造。有关该化合物其他活性的研究尚未见报道，故关于该化合物以及该化合物衍生物的后续研究需要进一步开展(nurtjahja-tjendraputrae,ammitaj,roufogalisbd,etal.effectiveanti-plateletandcox-1enzymeinhibitorsfrompungentconstituentsofginger.thrombosisresearch,2003,111(4):259-265.)。实施例2-8碳源种类对转化产物4得率的影响利用少孢根霉须状变种zjph1308菌株，以初始发酵培养基为基础，将葡萄糖分别替换为25g/l浓度的麦芽糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、糊精、乳糖作为唯一碳源，改变初始发酵培养基，按实施例1步骤(4)的方法进行转化，转化结束后，将转化液离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50℃减压浓缩至干，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行检测，检测方法同实施例1步骤(5)，根据面积归一法计算产物4(t＝45.3min)的得率。结果见表3。表3不同碳源对转化产物4(t＝45.3min)得率的影响实施例碳源种类产物4得率/％2葡萄糖20.43麦芽糖17.14甘油9.75可溶性淀粉11.76蔗糖12.87糊精22.28乳糖16.2结论：由表3可知，最佳的碳源为糊精。实施例9-13糊精浓度对转化产物4得率的影响在实施例7的基础上，配制糊精浓度分别为10g/l、20g/l、25g/l、30g/l、40g/l的初始发酵培养基，改变初始发酵培养基，按实施例1步骤(4)的方法进行转化，转化结束后，将转化液离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50℃减压浓缩至干，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行检测，检测方法同实施例1步骤(5)，根据面积归一法计算产物4(t＝45.3min)的得率。结果见表4。表4不同糊精浓度对转化产物4(t＝45.3min)得率的影响结论：由表4可知，最佳的糊精浓度为20g/l。实施例14-20氮源种类对转化产物4得率的影响在实施例10的基础上，利用少孢根霉须状变种zjph1308菌株，以初始发酵培养基为基础，将蛋白胨和(nh4)2so4分别替换为30g/l浓度的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、黄豆粉、玉米浆、氯化铵、硫酸铵作为唯一氮源，改变初始发酵培养基，按实施例1步骤(4)的方法进行转化，转化结束后，将转化液离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50℃减压浓缩至干，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行检测，检测方法同实施例1步骤(5)，根据面积归一法计算产物4(t＝45.3min)的得率。结果见表5。表5不同氮源对转化产物4(t＝45.3min)得率的影响实施例氮源种类产物4得率/％14蛋白胨28.715酵母膏13.316牛肉膏23.117黄豆粉5.218玉米浆11.819氯化铵1.220硫酸铵2.7结论：由表5可知，最佳的氮源为蛋白胨。实施例21-25蛋白胨浓度对转化产物4得率的影响在实施例14的基础上，配制蛋白胨浓度分别为10g/l、20g/l、25g/l、30g/l、40g/l的发酵培养基，改变初始发酵培养基，按实施例1步骤(4)的方法进行转化，转化结束后，将转化液离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50℃减压浓缩至干，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行检测，检测方法同实施例1步骤(5)，根据面积归一法计算产物4(t＝45.3min)的得率。结果见表6。表6不同蛋白胨浓度对转化产物4(t＝45.3min)得率的影响结论：由表6可知，最佳的蛋白胨浓度为30g/l。实施例26-31菌体浓度对转化产物4得率的影响利用少孢根霉须状变种zjph1308菌株，在实施例24的基础上(发酵培养基终浓度组成为：糊精20g/l、蛋白胨30g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l，ph6.0，溶剂为水)，经发酵培养后，将湿菌体加入装有20ml蒸馏水的250ml锥形瓶中(湿菌体以菌体干重计分别为6.5g/l、9.8g/l、13.0g/l、16.3g/l、19.5g/l、22.8g/l)构成20ml转化体系，底物姜黄素终浓度为50mg/l，于30℃，200rpm转化48h。转化结束后，将转化液离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50℃减压浓缩至干，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行检测，检测方法同实施例1步骤(5)，根据面积归一法计算产物4(t＝45.3min)的得率。结果见表7。表7不同菌体浓度对转化产物4(t＝45.3min)得率的影响实施例菌体浓度(g/l)产物4得率/％266.526.8279.830.22813.027.92916.322.73019.520.83122.818.9结论：由表7可知，最佳的菌体浓度为9.8g/l。实施例32-36底物浓度对转化产物4得率的影响利用少孢根霉须状变种zjph1308菌株，在实施例24的基础上，经发酵培养后，将湿菌体加入装有20ml蒸馏水的250ml锥形瓶中(湿菌体以菌体干重计为9.8g/l)构成20ml转化体系，底物姜黄素终浓度分别为25mg/l、50mg/l、75mg/l、100mg/l、150mg/l，于30℃，200rpm转化48h。转化结束后，将转化液离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50℃减压浓缩至干，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行检测，检测方法同实施例1步骤(5)，根据面积归一法计算产物4(t＝45.3min)的得率。结果见表8。表8不同底物浓度对转化产物4(t＝45.3min)得率的影响实施例底物浓度(mg/l)产物4得率/％322532.8335029.8347522.53510018.73615010.6结论：由表8结果可知，底物浓度采用50mg/l更合适。实施例37-42转化温度对转化产物4得率的影响利用少孢根霉须状变种zjph1308菌株，在实施例24的基础上，经发酵培养后，将湿菌体加入装有20ml蒸馏水的250ml锥形瓶中(湿菌体以菌体干重计为9.8g/l)，底物姜黄素终浓度为50mg/l，分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，200rpm转化48h。转化结束后，将转化液离心除去菌体，得上清液，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50℃减压浓缩至干，取浓缩物用色谱甲醇溶解后进行检测，检测方法同实施例1步骤(5)，根据面积归一法计算产物4(t＝45.3min)的得率。结果见表9。表9不同转化温度对转化产物4(t＝45.3min)得率的影响实施例转化温度(℃)产物4得率/％372520.7383031.1393532.8404033.9414527.6425011.4结论：由表9可知，最佳的转化温度为40℃。实施例43：棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810对姜黄素生物转化活性的考察(1)棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctccno:m209307,保藏日期2009年12月16日,该菌株已在先前的专利申请(申请号为200910155775.5，申请日2009年12月25日)中公开。(2)斜面培养：将棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810接种至斜面培养基，30℃培养4～5天，即得到斜面菌种；所述斜面培养基终浓度组成为：土豆200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂粉20g/l，ph自然，溶剂为水，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却、制成斜面；(3)种子培养：从步骤(2)斜面菌体挑取一环菌体接种至装有100ml种子培养基的250ml摇瓶中，30℃、200rpm培养24h，制备得到种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖25g/l、蛋白胨27.5g/l、(nh4)2so43g/l、kh2po41g/l、mgso4·7h2o1.3g/l，ph6.0，溶剂为水，121℃灭菌20分钟；(4)发酵培养：取种子液以体积浓度6％的接种量接种至装有100ml发酵培养基的250ml摇瓶中，30℃培养24h，获得湿菌体；发酵培养基同种子培养基配方。(5)姜黄素的生物转化：实验组：将棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810湿菌体移入装有20ml0.1m的ph6.6磷酸盐缓冲液的250ml锥形瓶中，同时加入姜黄素底物构成转化体系，姜黄素初始浓度为50mg/l转化体系，湿菌体加量以菌体干重计为9.8g/l转化体系。设置对照组1(不添加湿菌体)：将姜黄素加入到装有20ml0.1m的ph6.6磷酸盐缓冲液的250ml锥形瓶中构成反应体系，使其终浓度为50mg/l反应体系。设置对照组2(不添加底物)：将棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810湿菌体加入到装有20ml0.1m的ph6.6磷酸盐缓冲液的250ml锥形瓶中构成反应体系，湿菌体加入量以菌体湿重计为9.8g/l反应体系。将各组实验反应体系在30℃、200rpm条件下转化反应48h，转化结束后，将转化液离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，于50℃减压浓缩至干除去乙酸乙酯，各组旋蒸后所得浓缩物用色谱甲醇重新溶解后，制成样品，用实施例1步骤(5)中的hplc法进行检测，未检测到六氢姜黄素和4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol。结论：棘孢木霉(trichodermaasperellum)zjph0810不能转化姜黄素制备得到六氢姜黄素和4,4’-(3-hydroxyheptane-1,7-diyl)-bis-2-methoxyphenol。当前第1页12