一种诱导人羊膜间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导液及方法与流程

本发明涉及医学领域，具体的说是涉及一种诱导人羊膜间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导液及方法。
背景技术：
：心肌梗死是由于冠状动脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损坏，是临床上一种严重的缺血性心脏病。坏死后的心肌细胞逐渐被瘫痕组织所取代，由于瘫痕组织缺乏弹性,难以满足心脏收舒功能的要求,为代偿损失心肌细胞的功能,心脏逐渐发生退行性左心室重塑，心功能下降，最终导致充血性心力衰竭,甚至猝死。临床药物和介入治疗虽可以改善症状，但却不能挽回受损的心肌细胞。心脏移植虽可以从根本上解决心室重构问题，但因为其供体受限，医疗费用太高而难以广泛应用。近年来的研究表明，心肌细胞也具有再生能力，在心肌梗死后，心肌细胞也可以发生分裂和增殖。但是，由于其增殖能力较弱，不能满足弥补丧失心肌细胞数量的要求而逆转心室重构过程。近年来随着干细胞技术和组织工程学研究的不断深入，干细胞移植治疗心肌梗死成为临床研究的热点。干细胞的多向分化潜能及可塑性使心肌梗死心肌细胞再生成为可能，在人体的微环境作用下，干细胞定向归巢至损伤处，可以多项分化成各种组织细胞及血管。目前用于心肌梗死治疗研究的干细胞主要有骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞等。如专利CN105176920A、CN1536076A分别公开了脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞的方法。目前研究表明，在体外常用5-氮杂胞苷，骨形态发生蛋白-2等作为诱导剂诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化，如上述所提到的两个专利均是采用5-氮杂胞苷作为诱导剂。人胎盘来源的羊膜组织作为孕妇分娩后的废弃物，来源广、增殖快且不受伦理道德限制，是近几年的研究热点。羊膜是胎盘包裹胎儿面的一层半透明膜，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织，可分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞。早在50多年前，科学家和临床医生们就已经认识到羊膜拥有一定的生物学作用。早期羊膜曾被用作覆盖皮肤伤口的敷料，可以抗感染、减轻炎症的发生，并且抑制细胞的免疫反应，还可以刺激血管的生成。这些特点使它在多种疾病的辅助治疗中得到了较为广泛的应用，例如治疗烧伤，覆盖手术伤口，更重要的是用于眼表重建术。其中人胎盘羊膜来源的间充质干细胞(humanamnionmesenchymalcells,hAMSCs)来自于原条期的胚外中胚层，具有在一定条件下向多个细胞系分化潜能，向内胚层分化，如肝细胞、胰岛样细胞；向中胚层分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞；向外胚层分化，如神经细胞等。hAMSCs不仅具有干细胞的特征，且不排斥性及免疫效果，是细胞移植和组织工程的理想种子细胞。hAMSCs在体外使用合适的诱导剂同样具有分化为心肌样细胞的能力。hAMSCs这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，hAMSCs所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。然而，目前对于hAMSCs向心肌样细胞分化诱导的研究报道尚少。由于生物体是一个复杂的存在多诱导因素的有机体，不同的干细胞有不同的微环境，采用现有常规的诱导方法并不能使hAMSCs具有较高的诱导分化率。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导人羊膜间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导液，使得所述诱导液能够使人胎盘羊膜来源的间充质干细胞在向心肌样细胞分化时具备较高的诱导分化率。同时，基于该诱导液本发明还提供了一种诱导分化方法。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种诱导羊膜间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导液，该诱导液为包括胎牛血清、5-氮杂胞苷、血管紧张素II和转录生长因子β1的DMEM/F12培养液。针对现有技术中人胎盘羊膜来源的间充质干细胞(hAMSCs)向心肌样细胞分化的诱导分化率较低的问题，本发明在常用的5-氮杂胞苷(5-aza)基础上，选择血管紧张素II(Ang-II)和转录生长因子β1(TGFβ1)作为新的组分，三者相互作用提高了hAMSCs的诱导分化率。作为优选，本发明所述诱导液为包括10％胎牛血清、5-10μmol/L5-氮杂胞苷、5-10μmol/L血管紧张素II和5-10μg/L转录生长因子β1的DMEM/F12培养液。在本发明具体实施方式中，所述诱导液以DMEM/F12培养液为基础组分，同时包含如下之一组分：(1)10％胎牛血清、5μmol/L5-氮杂胞苷、5μmol/L血管紧张素II和5μg/L转录生长因子β1；(2)10％胎牛血清、10μmol/L5-氮杂胞苷、5μmol/L血管紧张素II和10μg/L转录生长因子β1；(3)10％胎牛血清、10μmol/L5-氮杂胞苷、10μmol/L血管紧张素II和5μg/L转录生长因子β1；(4)10％胎牛血清、5μmol/L5-氮杂胞苷、5μmol/L血管紧张素II和10μg/L转录生长因子β1。在hAMSCs诱导分化的试验中，采用本发明诱导液的诱导分化率均在30％以上，最高可达到43％；而作为对照的诱导液，其诱导分化率均未超过25％。基于此技术效果，本发明提出了所述诱导液在诱导羊膜间充质干细胞向心肌样细胞分化和/或制备诱导羊膜间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导试剂中的应用。同时，本发明提供了一种诱导羊膜间充质干细胞向心肌样细胞分化的方法，将羊膜间充质干细胞先进行贴壁培养，然后接种于权利要求3任意一项所述诱导液中诱导培养，期间定期更换诱导液。作为优选，所述方法为将羊膜间充质干细胞按1×104cells/mL密度接种于含10％胎牛血清DMEM/F12培养液中贴壁培养24h，然后更换本发明所述诱导液，在37℃、5％CO2、饱和湿度环境下静置诱导培养4周，期间2-3天换液一次。作为优选，本发明所述羊膜间充质干细胞为人羊膜间充质干细胞。本发明所述羊膜间充质干细胞可参照本领域常规方法制备获得，在本发明中给出了较佳的制备方法：用剪刀将羊膜从胎盘上剪下并清洗，然后剪成小块加入胰蛋白酶消化，消化后再次剪碎，加入Ⅰ型胶原酶消化，消化后过筛，加入含10％FBS的DMEM/F12完全培养基重悬细胞并进行培养，至细胞长满80-90％传代，定期更换新鲜的含10％FBS的DMEM/F12完全培养基。更为具体地，制备过程按照如下方法进行：取材：无菌条件下取38-40周正常剖宫产胎盘，无肝炎、梅毒、HIV等传染性疾病，产妇及其家属对胎盘可能用于科学研究均签署了知情同意书。漂洗：用手术剪把整个羊膜从胎盘上剪下来放入15cm玻璃培养皿中，去除血块和损伤较严重的部位，PBS缓冲液漂洗3-4次。剪碎：用手术剪将羊膜剪成(30-50)cm2大小的组织，分装到50mL离心管中(体积10-15ml)。胰酶消化：加入三倍体积的0.25％胰蛋白酶，置37℃、200R恒温振荡器中消化30min，每10min取出用手剧烈摇晃。二次漂洗：消化结束后，用镊子将消化好的组织块转移至装有PBS缓冲液的250mL储液瓶中，盖紧盖子用手剧烈摇晃，PBS缓冲液漂洗2-3次。二次剪碎：用手术剪将羊膜剪成(10-30)cm2大小的组织。Ⅰ型胶原酶消化：加入20mL的0.5％Ⅰ型胶原酶，补加DMEM/F12培养基至终体积为100mL。置37℃、200R恒温振荡器中消化，每10min取出用手剧烈摇晃，直到组织块完全消化。过筛：消化完成后，消化好的组织液分装至50mL离心管，每管20-25mL，加入等体积的PBS缓冲液，2000rpm离心5min。弃上清后加入10mLPBS缓冲液重悬细胞沉淀，200μm细胞筛网过滤。2000rpm离心5min。弃上清，加入5-10mL含10％FBS的DMEM/F12完全培养基重悬细胞。细胞计数与接种：对细胞悬液进行细胞计数，根据计数结果调整细胞悬液密度到1.0-1.5×105cell/mL接种于培养皿中，5％CO2培养箱37℃培养。原代培养：细胞接种48h后，对原代细胞进行换液，更换新鲜的含10％FBS的DMEM/F12完全培养基，放置5％CO2培养箱37℃培养至细胞长满80-90％传代。作为优选，所述传代为待原代细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入胰蛋白酶消化，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，离心收集细胞，加入适量含10％FBS的DMEM/F12完全培养基传代培养，每隔3-4天传代一次。更为具体地，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1500rpm离心5min，弃上清。加入适量含10％FBS的DMEM/F12完全培养基，进行细胞计数，按1×105cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔3-4天传代一次。由以上技术方案可知，本发明在传统的诱导剂5-氮杂胞苷基础上，额外添加了血管紧张素II和转录生长因子β1两种适宜组分，利用三者的联合作用共同诱导羊膜间充质干细胞分化为心肌样细胞，能够显著提高羊膜间充质干细胞的诱导分化率。附图说明图1所示为hAMSCs各表面抗原流式细胞术检测结果；图2所示为hAMSCs各组诱导分化率结果比较。具体实施方式本发明实施例公开了一种诱导人羊膜间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导液及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明产品和方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下就本发明所提供的一种诱导人羊膜间充质干细胞向心肌样细胞分化的诱导液及方法做进一步说明。实施例1：hAMSCs原代分离培养、鉴定及传代取材：无菌条件下取38-40周正常剖宫产胎盘，无肝炎、梅毒、HIV等传染性疾病，产妇及其家属对胎盘可能用于科学研究均签署了知情同意书。漂洗：用手术剪把整个羊膜从胎盘上剪下来放入15cm玻璃培养皿中，去除血块和损伤较严重的部位，PBS缓冲液漂洗3-4次。剪碎：用手术剪将羊膜剪成(30-50)cm2大小的组织，分装到50mL离心管中(体积10-15ml)。胰酶消化：加入三倍体积的0.25％胰蛋白酶，置37℃、200R恒温振荡器中消化30min，每10min取出用手剧烈摇晃。二次漂洗：消化结束后，用镊子将消化好的组织块转移至装有PBS缓冲液的250mL储液瓶中，盖紧盖子用手剧烈摇晃，PBS缓冲液漂洗2-3次。二次剪碎：用手术剪将羊膜剪成(10-30)cm2大小的组织。Ⅰ型胶原酶消化：加入20mL的0.5％Ⅰ型胶原酶，补加DMEM/F12培养基至终体积为100mL。置37℃、200R恒温振荡器中消化，每10min取出用手剧烈摇晃，直到组织块完全消化。过筛：消化完成后，消化好的组织液分装至50mL离心管，每管20-25mL，加入等体积的PBS缓冲液，2000rpm离心5min。弃上清后加入10mLPBS缓冲液重悬细胞沉淀，200μm细胞筛网过滤。2000rpm离心5min。弃上清，加入5-10mL含10％FBS的DMEM/F12完全培养基重悬细胞。细胞计数与接种：对细胞悬液进行细胞计数，根据计数结果调整细胞悬液密度到1.0-1.5×105cell/mL接种于培养皿中，5％CO2培养箱37℃培养。原代培养：细胞接种48h后，对原代细胞进行换液，更换新鲜的含10％FBS的DMEM/F12完全培养基，放置5％CO2培养箱37℃培养。传代：待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1500rpm离心5min，弃上清。加入适量含10％FBS的DMEM/F12完全培养基，进行细胞计数，按1×105cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔3-4天传代一次。hAMSCs鉴定：取第2代对数生长期细胞，流式细胞术检测表面抗原CD105、CD90、CD73、CD45、CD34、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样本分析8000～10000个细胞。流式细胞术检测结果显示，细胞表面抗原CD105、CD90、CD73表达阳性，而CD45、CD34、HLA-DR表达阴性，说明本发明中得到的hAMSCs属来源于中胚层的间充质干细胞(表1，图1)。表1hAMSCs表面抗原阳性表达率细胞表型CD105CD90CD73HLA-DRCD34CD45阳性表达率(％)99.6099.50100.000.000.000.20实施例2：本发明诱导液诱导hAMSCs分化为心肌样细胞1、诱导液组成(1)含10％FBS、5μmol/L5-aza、5μg/LTGFβ1、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培养液。(2)含10％FBS、10μmol/L5-aza、10μg/LTGFβ1、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培养液。(3)含10％FBS、10μmol/L5-aza、5μg/LTGFβ1、10μmol/LAng-II的DMEM/F12培养液。(4)含10％FBS、5μmol/L5-aza、10μg/LTGFβ1、5μmol/LAng-II的DMEM/F12培养液。2、诱导分化方法选取实施例1中第3代hAMSCs，按1×104cells/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2mL含10％FBS的DMEM/F12培养基，贴壁培养24h后更换诱导液，在37℃、5％CO2、饱和湿度静置培养，每隔2-3天更换新的诱导液。实施例3：不同诱导液诱导分化对比试验为了对比不同诱导液对诱导分化的影响，本实施例设置了如表2中的各个诱导液处理组，其中实验组为本发明诱导液。表2各组分化诱导液配方组别基础培养基FBS5-azaTGFβ1Ang-II实验组1DMEM/F1210％5μmol/L5μg/L5μmol/L实验组2DMEM/F1210％10μmol/L10μg/L5μmol/L实验组3DMEM/F1210％10μmol/L5μg/L10μmol/L实验组4DMEM/F1210％5μmol/L10μg/L5μmol/L对照组1DMEM/F1210％——————对照组2DMEM/F1210％10μmol/L————对照组3DMEM/F1210％——10μg/L——对照组4DMEM/F1210％————5μmol/L对照组5DMEM/F1210％5μmol/L5μg/L1μmol/L对照组6DMEM/F1210％15μmol/L15μg/L10μmol/L根据表2设置的各诱导液，按照实施例2中的诱导分化方法对相同来源、代数的hAMSCs进行诱导分化4周，然后通过取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponinI)和心肌肌钙蛋白T(troponinT)的免疫组化染色，DAB显色。将各组放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加适量一抗(desmin、troponinI、troponinT)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。对各组所得细胞经免疫组化检测后，对desmin、troponinI、troponinT染色的细胞按公式：诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％进行计数，计算出各组的分化率进行比较。每组取样3次，分别检测后统计数据。统计结果如表3和图2。表3各组细胞分化率(*表示p<0.05，**表示p<0.01)表3、图2结果显示，对照组1为阴性对照组，细胞无着色；其余各组中，三种蛋白均有细胞着色，表明desmin、troponinI、troponinT均表达阳性。其中实验组1、实验组2、实验组3和实验组4与对照组1-6之间分化率有极显著性差异(**，p<0.01)；实验组2与实验组1、实验组3、实验组4均有显著性差异(*，p<0.05)，实验组2中细胞着色最多，诱导分化率为43.36±1.01％，显著高于其他各组，说明本发明所用分化培养基能有效的诱导hAMSCs向心肌样细胞分化，并具有较高的诱导分化率。以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。当前第1页1 2 3