一种藻类混合培养方法与流程

本专利涉及一种藻类混合培养方法，具体涉及一种丝状绿藻和底栖硅藻混合培养方法，属于藻类生物技术领域。

背景技术：

硅藻种类繁多、分布广泛，富含的多种营养物质，包括高不饱和脂肪酸（EPA、DHA）、多糖、蛋白质等，作为水域生态系统的初级生产者，被广泛应用于水产经济动物幼体的培育饵料。

尤其是底栖型硅藻，在匍匐生长的鲍、海胆、海参等名贵海洋经济动物培育过程中，是其浮游幼体附着、变态过程必须的诱导物和重要饵料。

底栖硅藻的质量和生物量是海产经济动物育苗成功的关键因素之一，影响苗种的生长速率和存活率。而且作为一种鲜活的饵料，硅藻在养殖水体中还具有调节水质、控制水体富营养、减少养殖动物疾病的作用，应用的潜力较大。

底栖硅藻油脂含量高，均能分泌胞外多聚物，如图1所示，其主要成分是多糖。底栖硅藻在水体净化、生物质能源以及活性物质开发等方面存在巨大的潜在价值。

丝状绿藻，因藻体呈丝状而得名，以绿藻种类居多，常见有硬毛藻和刚毛藻。藻细胞含有纤维束、木质素、多糖、蛋白质等成分，色素中以叶绿素A和B最多，还有叶黄素和胡萝卜素，故呈绿色，并且细胞壁的成分主要是纤维素。

丝状绿藻具有很高的经济社会和环保价值，可作食品、饲料或提取蛋白质、脂肪、叶绿素和核黄素等多种产品，或可作为药用，或用来处理生活污水和工业污水等用途。

现有技术中藻的培养主要是单一藻种类培养模式为主，通过寻找适合藻生长繁殖的最佳条件如温度、光照、营养盐和培养方式等因素进行藻类培养以最大限度提高其生物量，从而获得预想的培养效果。

现有技术关于底栖硅藻的培养一般置于培养容器中，如图2所示，使底栖硅藻附着于培养容器内壁进行培养，但该方法对于底栖硅藻的培养具有生长空间有限、生物量采收困难的缺陷，从而大大限制了其生物量的扩增及其应用。

同时，项目组也检索发现采用载体培养底栖硅藻的方法，使用的载体为多聚物或者藻粉，这些载体能够增加底栖硅藻的附着面积，但附着底栖硅藻的载体仍然沉于培养容器底部，光照、培养空间和营养物质仍难以充分利用，而且随着培养时间的延长，载体存在分解或变质的问题，从而影响培养水质环境。

目前，项目组通过检索未发现关于不同种类藻混合培养模式的报道。

技术实现要素：

为解决上述现有技术中存在的不足，本发明提出了一种藻类混合培养方法，尤其是一种丝状绿藻和底栖硅藻混合培养方法，该方法根据两种藻类自身的生物特性，充分利用了培养空间，培养方法更加生态环保，避免了上述载体培养底栖硅藻中存在的问题，并且进一步极大的提高了底栖硅藻的生物量，实现两种藻类的高密度培养，两种藻的混合培养使其生物量更便于在环境、饵料、饲料等方面实现综合利用。同时，该方法也解决了现有技术中底栖硅藻不易采收的问题。

一种丝状绿藻和底栖硅藻混合培养方法，具体技术方案如下，

步骤1，分别培养制备接种用底栖硅藻泥和丝状绿藻；

步骤2，将步骤1制备的丝状绿藻按照湿重质量占整个培养体积的10%-50%置入培养环境培养2~5天，然后按照接种的丝状绿藻湿重的0.5%-5%的质量接种步骤1制备的培养用底栖硅藻藻泥；

本发明中所用述语“湿重”是指接种微藻培养时，采用质量占体积方法；

步骤3，将接种后的底栖硅藻和丝状绿藻混合培养，混合培养过程中可根据藻类的不同调控利于底栖硅藻和丝状绿藻生长的培养条件，促进藻类的生长，直至丝状绿藻藻体表面呈现底栖硅藻的颜色时停止培养；

步骤4，将丝状绿藻捞取并包裹于纱布中进行搓洗，将搓洗后的溶液自然沉降，然后过滤沉降物或离心处理可得底栖硅藻，纱布中得底栖硅藻和丝状绿藻的混合物。

图3为丝状绿藻和底栖硅藻混合培养照片。如图4所示，混合培养时丝状绿藻的藻丝表面长满底栖硅藻，圆圈部分所示为附着的较多底栖硅藻。

与现有技术相比，该方法实现了混合培养，采用生态的方法扩大了培养数量级，尤其是经济价值较高的底栖硅藻的培养数量级，从而进一步提高了藻类的培养量，同时充分利用了培养空间和营养条件；其次，该方法采收方便、简单，可实现单种分离，也可以混合使用，两种藻类混合作为饲料使用时，可以实现增加饲料营养物质多样性的目的；最后，混合培养物藻体营养物质具有更加多样化的优点。

并且，通过混合培养获得两种藻类混合生物量，共同吸收水体中过多营养盐，净化效率提高，同时，丝状藻形成的藻网膜还可有效过滤吸附水体中悬浮杂物，实现更高效净化废水的作用。

底栖硅藻能够分泌胞外多聚物，具有极强吸附生长的特性；丝状绿藻，外形多半为线状、刷状或棉花状，具有很强过滤吸附性，同时丝状绿藻占据培养水体空间生长，藻体之间遮挡少，透光性好，能够有效减少如像片状藻体对光线的遮挡。

本方法的关键点在于利用底栖硅藻强吸附生长的特性和丝状绿藻自身的过滤吸附性，将两种藻类混合培养，底栖型硅藻附着于丝状绿藻生长，同时利用了丝状绿藻占据培养水体空间生长的特性，增大底栖硅藻的培养空间，充分利用营养物质和光照，从而进一步提升了底栖硅藻的培养数量级，达到底栖硅藻高密度培养的目的。

另外，由于丝状绿藻与底栖硅藻从形态、颜色等方面的不同，培养过程可以清楚的对藻类生长情况进行观察。最后，培养结束后通过搓洗丝状藻体分别采收底栖硅藻单种和混合培养物，从而解决了单种藻类尤其是经济价值更高的底栖硅藻的单种藻类采收问题。

附图说明

图1为菱板藻扫描电子显微镜照片。

其中，图中箭头所示为分泌的胞外多聚物。

图2为底栖硅藻的单种培养照片。

图3为丝状绿藻和底栖硅藻混合培养照片。

图4为图3中底栖硅藻附着于丝状绿藻的局部图。

图5为实施例1与对应的单种藻类分别培养的对比图。

具体实施方式

一种丝状绿藻和底栖硅藻混合培养方法，包括以下步骤：

步骤1，底栖硅藻/丝状绿藻的单种暂养

底栖硅藻生物量的扩大培养，将底栖硅藻种中加入含10-30mg/L硅酸钠的f/2培养基中培养，所述f/2培养基中氮素也可用尿素替代，培养过程中温度控制在15℃-25℃，持续光照控制在1000Lx-5000Lx，盐度控制在30‰-35‰，pH控制在 7.5-8.5，培养期间可充气；培养7-10天后，对培养的底栖型硅藻进行4000转/min离心处理10min-20min，去上清并收集培养用底栖硅藻藻泥；

选取藻体鲜绿、生长状态良好的丝状绿藻进行暂养，暂养过程中，丝状绿藻湿重控制在0.5kg/L-1kg/L，培养过程中温度控制在5℃-23℃，盐度控制在30‰-35‰，自然光照控制在1000Lx-10000Lx，每天换水1/3-1/2，自然海水培养2天后得培养用丝状绿藻；

步骤2，接种

取步骤1的培养用丝状绿藻置入培养容器，使得接种的丝状绿藻的湿重质量占整个培养体积的10%-50%，添加适当营养盐培养2-5天，然后按照接种的丝状绿藻湿重的0.5%-5%的质量接种步骤1制备的培养用底栖硅藻藻泥，所述底栖硅藻藻泥接种时将其用适当海水悬浮后倒入进行混合培养，使得底栖硅藻附着至丝状绿藻上；

步骤3，混合培养

混合培养过程中温度控制在15℃-25℃，一天中光照时间控制在8h-12h，其它时间为黑暗，其中，持续同一强度光照时，光照强度保持在5000-10000Lx；非持续同一强度光照时，可逐渐改变光照强度，光照强度在开始的5h内从1000Lx开始逐渐增强至15000Lx，然后保持最强光照1-2.5h后，剩余时间内光照逐渐减弱至黑暗；该步骤中可适当充气，但充气体量不宜过大；

按照上述条件培养7-15天，直至观察到丝状绿藻藻体表面呈现底栖硅藻的颜色时停止培养，进行分离；

步骤4，底栖硅藻/丝状绿藻的采收

停止培养后，将丝状绿藻捞取并包裹于纱布中进行搓洗，将搓洗后的溶液自然沉降，然后过滤沉降物或离心处理可得底栖硅藻，纱布中得底栖硅藻和丝状绿藻的混合物。

采用该方法得到的底栖硅藻每毫升含硅藻细胞10⁸以上，均可在环境、养殖、化学等方面进行生物量的利用。

优选，步骤2和步骤3中添加f/4-f/2培养基或硅酸钠，或添加尿素、硝酸钠、硝酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠中的任意一种或多种。

优选，步骤3混合培养开始的1-3天内不充气、不搅动，利于底栖硅藻附着，增强附着效果。

若底栖硅藻和丝状绿藻混合使用，优选步骤3培养至硅藻有脱落现象时采收。

步骤4采收后的丝状绿藻藻体上会存有少量的底栖硅藻，根据培养体系中营养物质含量和底栖硅藻的密度，优选，步骤4采收得的底栖硅藻和丝状绿藻的混合物可添加营养盐或硅藻种子液，可直接进行下一次混合培养。

为进一步对上述发明方法予以说明，列举以下具体实施例。以下实施例有助于对本发明的进一步了解，但本发明并非限于这些内容。

实施例1

强壮硬毛藻与菱形藻混合培养

1）强壮硬毛藻暂养和菱形藻扩大培养

强壮硬毛藻暂养，将生长健康、颜色鲜绿的强壮硬毛藻湿重5kg-5.5kg，放入装有10L消毒海水的玻璃缸中，室温15℃-20℃，盐度31‰-33‰，自然光照5000Lx-7000Lx，充气培养，每天吸底并换海水2L-3L，暂养2天后使用。

菱形藻的扩大培养，将藻种按10%接种含25-30mg/L硅酸钠的f/2培养基中培养，培养过程中室温15℃-20℃，光照4000Lx-5000Lx，盐度31‰-33‰，pH 7.5-8.5，充气培养10天密度达到10⁵cell/mL，离心收集藻泥。

2）接种

将步骤1）暂养的强壮硬毛藻0.5kg（湿重）投入装有4L消毒海水培养缸，添加35-40mg/L硝酸钠、2-3mg/L磷酸二氢钠，充气培养2-3天后，接种步骤1）获得的5g菱形藻藻泥，将藻泥用适当消毒海水悬浮后倒入进行混合培养。同时进行两种藻单种培养作为对照。

3）混合培养

培养温度20℃，光照强度2000-5000Lx，光照周期日照：黑暗为8h：16h，培养2天后开始适当充气，气体量不宜过大。每天轻微搅动1次。培养5-8天追加少量硝酸钠、磷酸二氢钠和硅酸钠。强壮硬毛藻藻体表面出色褐色斑点，增强光照使培养体系中心达到3000-5000Lx，培养15-20天，观察到强壮硬毛藻体表面呈现深褐色菱形藻的颜色时进行分离、采收。

4）采收

将混合藻体在培养液中进行轻轻搓洗，获得菱形藻4.19×10⁸ cell/mL作为鲜活饵料直接利用。捞取出剩余藻体可用作净化氮磷，或继续培养。

如图5所示，强壮硬毛藻与菱形藻混合培养比单种培养21天的菱形藻生物量提高了3倍多。

实施例2

刚毛藻与舟形藻混合培养

1）刚毛藻暂养和舟形藻扩大培养

刚毛藻暂养，装有1L消毒海水的烧杯中暂养生长健康、颜色鲜绿的刚毛藻0.5kg-1kg（湿重），室温15℃-18℃，盐度30‰，LED白灯光强4000Lx-6000Lx，每天换消毒海水0.5L，充气暂养2-3天。

舟形藻的扩大培养，将藻种按10%接种含23-25mg/L硅酸钠的f/2培养基中培养，培养过程中室温15℃-18℃，LED白灯光强2000Lx-3000Lx，盐度30‰，pH 7.5-8.0，充气培养密度达到10⁵cell/mL以上，离心收集藻泥。

2）接种

将步骤1）暂养的刚毛藻500g（湿重）投入装有4L消毒海水培养缸，添加20-25mg/L硝酸钠、2-3mg/L磷酸二氢钠，充气培养1-2天后，接种步骤1）获得的10g舟形藻藻泥，将藻泥用适当消毒海水悬浮后倒入进行混合培养。

3）混合培养

培养温度15-18℃，光照强度3000左右，光照周期日照：黑暗为12h：12h，培养1天后，开始充弱气流，添加10mg/L硅酸钠。每天温度升高1℃达到20-23℃为止，光照强度逐渐升到6000-7000Lx。每天轻微搅动1次。培养8-10天追加少量硝酸钠、磷酸二氢钠和硅酸钠。培养15-20天，观察到刚毛藻分支藻体表面呈现深褐色舟形藻的颜色，增大通气量，褐色舟形藻有轻微脱落现象时开始采收。

4）采收

轻柔搓洗，获得至少舟形藻密度10⁸cell/mL藻液，刚毛藻湿重达到900g，混合培养的水体中营养盐去除率达到90%以上，而单种培养营养盐去除率不到50%。或者直接捞取80%混合藻晾干、粉碎，作为饲料添加。剩余20%混合藻，同时添加营养盐、刚毛藻和舟形藻种子液，继续进行培养。

实施例3

水棉（Spirogyra）与双眉藻混合培养

1）水绵暂养和双眉藻扩大培养

水绵暂养，装有5L消毒淡水的玻璃缸中暂养水绵2kg-3kg（湿重），室温25℃，日光灯光强8000Lx-10000Lx，每天换消毒培养水体1/4-1/3，充气暂养1-2天。

双眉藻的扩大培养，将藻种按10%接种含10mg/L硅酸钠的f/2培养基中培养，培养温度20℃-25℃，LED灯光强5000Lx-8000Lx，充气培养密度达到10⁴cell/mL，离心收集藻泥。

2）接种

将步骤1）暂养的水绵1kg（湿重）投入装有5L消毒淡水培养缸，添加10-20mg/L尿素，4-5mg/L磷酸氢二钠和30-35mg/L碳酸氢钠，培养1-2天后，接种步骤1）获得的10g双眉藻藻泥，将藻泥用适当消毒淡水悬浮后倒入进行混合培养。

3）混合培养

培养温度25℃，光照强度5000左右，日光灯管光照12h：12h，培养1天后添加5mg/L硅酸钠。光照强度逐渐升到8000-10000Lx。每天轻微搅动1次。培养8-10天追加少量尿素、磷酸氢二钠和碳酸氢钠。培养15-20天，观察到水绵藻丝表面呈现浅褐色双眉藻的颜色，开始采收。

4）采收

采收混合藻放入10L养鱼废水中，自然条件净化7-10天，废水悬浮物减少90%以上，营养盐去除率达到80%以上，揉搓获得至少双眉藻密度10⁸cell/mL藻液，水棉湿重至少达到2kg。

捞取藻晾干、粉碎，作为饲料添加。

实施例4

丝藻（Ulothrix）和菱板硅藻混合培养

1）丝藻暂养和菱板硅藻扩大培养

丝状藻暂养，装有500mL消毒淡水的三角瓶中暂养丝藻500g（湿重），室温25℃-28℃，日光灯光强8000Lx-10000Lx，暂养1天。

菱板藻的扩大培养，将藻种按10%接种含25mg/L硅酸钠的f/2培养基中培养，培养过程中室温25℃-28℃，日光灯照射，光强5000Lx-6000Lx，充气培养密度达到10⁴cell/mL以上，离心收集藻泥。

2）接种

将步骤1）暂养的丝藻换一半水，添加15-20mg/L硝酸钠和2-3mg/L磷酸二氢钠，接种步骤1）获得的4-5g菱板藻藻泥，将藻泥用适当消毒淡水悬浮后倒入进行混合培养。同时进行单种培养作为对照。

3）混合培养

培养温度25-28℃，自然光照条件培养1天后，观察菱板藻附着丝藻藻体上后，开始充弱气流，添加10mg/L硅酸钠。光照周期日照：黑暗为12h：12h，光照初始1000Lx，每小时增加1000-2000Lx，直到10000Lx为止，持续2-3h后，逐渐减弱光照至黑暗。每天轻微搅动1次。培养8-10天追加少量硝酸钠、磷酸二氢钠和硅酸钠。培养15-20天，丝藻藻体表面呈现菱板藻的深褐色，增大通气量，褐色菱板藻有轻微脱落现象时开始采收。

4）采收

将混合藻体捞取并包裹于纱布在培养液中进行轻轻搓洗，获得10⁸cell/mL藻液直接利用作为饵料，比单种培养数量增加1-2个数量级，丝藻质量比单种培养增加了50%（湿重）。

揉搓后的丝藻藻体上残留有菱板藻可作为种子，添加营养盐继续进行连续培养。

通过控制培养条件和工艺，本发明的方法可适用于不同硅藻和丝状藻的任意搭配培养。

以上详细描述了本发明的优选实施方式。

但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。