淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体的杂交膜条和检测试剂盒的制作方法

本发明属于医学检测领域，具体的是涉及淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体的杂交膜条和检测试剂盒。

背景技术：

淋球菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)/梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)/沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)/解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)是临床比较常见的通过性传播的微生物。淋球菌主要引起泌尿生殖系统的化脓性感染，如淋菌性尿道炎和宫颈炎，感染初期临床上无症状，若未及时治疗，还可经由尿道或宫颈局部扩散感染，引起附睾炎、盆腔炎等疾病。解脲脲原体感染后可引起尿道炎、宫颈炎和前庭大腺炎；上行感染时，可引起男性前列腺炎或附睾炎，女性子宫内膜炎、盆腔炎和输卵管炎，是不孕不育的重要原因。沙眼衣原体感染后，在男性患者中可出现非淋菌性尿道炎、附睾炎、前列腺炎等；在女性患者中会出现子宫颈炎、尿道炎、盆腔炎等，若感染后不能得到及时诊断和治疗，会产生一系列严重并发症，如输卵管源性不孕、异位妊娠等疾病。梅毒是由梅毒螺旋体(亦称苍白螺旋体)感染人体所引起的一种系统性、慢性经典的性传播疾病，可累及人体多系统多脏器的损害，产生多种多样复杂的临床症状和体症，导致组织破坏、功能失常，甚至危及生命。故及时且精准的实验室病原体检测对早期性病患者的治疗有重要意义。目前用于检测这四种病原微生物(NG/TP/CT/UU)常见的实验方法有培养法、镜检法、酶免检测法、金标法和核酸扩增荧光探针法等，培养法检测方法虽然准确可靠，但存在耗时长、费用高、检出率低，需要高标准的实验室条件和运输条件等；酶免检测通过抗原抗体的结合反应，检测血清中的针对上述四种微生物特异性抗体。其方法简便快速但灵敏度和特异性各方面仍有待提高，核酸扩增荧光探针法通过检测上述微生物特异性的核酸序列来判断样品中是否存在相应微生物，此方法兼具灵敏度和特异性，但仍存在费用高，需要特殊仪器设备和专业技术人员操作，无法一次性检测四种病原微生物等缺点。上述方法在进行普筛时，或存在周期长、操作复杂的缺点，或存在成本高、实验条件、专业技术要求高的缺点。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种快速检测淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体的试剂盒，该试剂盒具有很好的特异性以及敏感性，可用于快速检测淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体。

实现上述目的的技术方案如下。

一种快速检测淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体的试剂盒，包括有：

(1)杂交膜条，所述杂交膜条的硝酸纤维素膜上固定有以下至少一种探针：针对淋球菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、解脲脲原体的分别与SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16完全互补的寡核苷酸序列；

(2)扩增引物：包括与(1)相应地针对淋球菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、解脲脲原体的扩增引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中至少一对扩增引物，针对淋球菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、解脲脲原体的扩增引物的正向引物的5’端分别连接有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16的标签序列，所述扩增引物的反向引物连接有第一显色标记物。

在其中一个实施例中，还包括有微球，所述微球上连接有能与第一显色标记物对应结合的第二显色标记物，优选地，所述第一显色标记物为生物素，第二第二显色标记物为链酶亲和素。

在其中一个实施例中，所述杂交膜条的硝酸纤维素膜上固定有四种探针：针对淋球菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、解脲脲原体的分别与SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、和SEQ ID NO.16完全互补的寡核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体的杂交膜条。

具体技术方案如下。

一种用于检测淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体的杂交膜条，包括有PVC板，PVC板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上固定有以下至少一种探针：针对有淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体的分别与SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16完全互补的寡核苷酸序列。

在其中一个实施例中，所述膜条上固定有四种探针：针对淋球菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体、解脲脲原体的分别与SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、和SEQ ID NO.16完全互补的寡核苷酸序列。

本发明具有以下优点：

1)本发明所述试剂盒通过特殊的检测片段选取，可以实现单种微生物的检测，更能实现在同一管PCR反应中，同时检测4种病原微生物的存在，为筛查提供了一个简单\快速\廉价的选择；

2)经过发明人的经验积累和大量实验所筛选到的扩增引物，以及探针，结合优化的杂交膜条，得到的检测淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体的试剂盒具有非常好的特异性和灵敏度，同时又能快速检测4种病原体。

3)特殊的膜杂交技术，不需要使用杂交仪，在室温情况下，在PCR管中即可完成杂交，比目前普遍使用的杂交方案，节省了时间和设备成本。

4)结果可以用肉眼判读，大大降低的使用成本。

附图说明

图1为本发明的检测试剂盒制备和检测的示意图。

图2为杂交膜条的检测结果示意图。

图3为NG特异性实验结果示意图。

图4为CT特异性实验结果示意图。

图5为UU特异性实验结果示意图。

图6为TP特异性实验结果示意图。

图7为灵敏度实验结果示意图。

图8为四种病原微生物PCR扩增片段电泳图，图中从左到右样本编号：1-8。

图9为常见干扰物质的抗干扰实验结果示意图，A:CT抗干扰实验；B：UU抗干扰实验；C:TP抗干扰实验；D:NG抗干扰实验；图中从左到右样本编号：1-8。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

一种多重PCR技术同时扩增CT/UU/NG/TP保守序列：通过序列分析，本试剂盒分别选取四种病原微生物的特异性保守区域作为目标扩增区域，并设计特异性的引物作为扩增引物，其对应扩增区域及引物见下表：

本发明所述试剂盒是采用PCR核酸扩增结合膜层析显色的方法同时进行四种病原微生物DNA(NG/TP/CT/UU)的定性检测。采通过一对分别含有核苷酸标签(Tag)和生物素标记(Biotin)的正反向引物进行PCR扩增。C-PAS膜条上固定有与正向引物核苷酸标签序列完全互补的寡核苷酸序列，PCR扩增产物可在常温下通过溶液层析作用与膜条上互补序列杂交进而固定在膜条相应的位置上，再通过生物素-链酶亲和素亲和作用进行显色，呈现出肉眼可辨析的蓝色指示条带。(可参见图1)。具体如下。

扩增片段选取和引物设计：利用NCBI数据库，查找待测四种病原微生物的基因组序列，并通过序列的比对分析，BLAST分析找到四种病原微生物的特异性的保守序列，作为待检测核酸序列(见上文数据)。利用primer 3等在线引物设计进行引物设计。并在设计好的正向引物的5端上加上特异性的核苷酸标签(CT：GCAGATTCATTGGTCAGAGAACA；UU：TGTTCTCTGACCAATGAATCTGC；NG：CGAAGTTCCGAGATGGCC；TP：CGTTGGAATCTCGTTCCAGTT)；在设计好的反向引物使用Biotin标记(第一显色标记物)。

1)核酸提取：使用宝创生物技术公司生产的核酸提取试剂盒(备案号：粤穗械备20150224号)，根据说明书要求操作，进行样本提取。其具体操作步骤如下：A)临床收集到的样本(如阴道拭子样本)，通过核酸提取试剂盒，提取样本的基因组DNA。B)提取的基因组DNA作为模板，利用本试剂盒试剂进行PCR扩增，扩增的程序如下所示；

PCR扩增的程序如下表，适用于ABI等PCR仪器。

将图7中阐述的参考品A/F/K/O,分别作为PCR的模版，进行PCR扩增。PCR扩增：提取的核酸进行PCR扩增，反应体系为：2xPCR缓冲液10ul,TP(和UU/NG/CT)引物5ul,模版DNA 5ul.混合均匀。同管扩增，PCR反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环。

第四步：4摄氏度，无限循环

凝胶电泳：配置1.5％的琼脂糖凝胶(称取1.5g琼脂糖份，加入100ml的TAE缓冲液，在微波炉中加热，直致所有琼脂糖全部溶解，将产物在50-60摄氏度的水浴锅中平衡20分钟，并按照0.01％的比率加入EB)，将PCR产物与上样缓冲液混合均匀，上样10ul,在120V的条件下进行电泳，30分钟。凝胶电泳在紫外光下进行拍照。

实验结果：扩增结果参见图8。从拍照的结果可以看出，采用四种参考品扩增，PCR反应正常进行，扩增条带明显，没有非特异性扩增产生。

2)杂交膜条制备：将硝酸纤维素膜(4cmX20cm)贴附于PVC板上(6cmX20cm)，并将吸水纸(2.1cmX20cm)贴在PVC板上，与硝酸纤维素膜有0.1cm重叠。将4条与核苷酸标签方向互补的单链核苷酸，以20ng/ul的浓度噴洒在硝酸纤维素膜上(每一厘米膜上喷洒200ng核苷酸探针)，每个探针间喷洒红色位置线(红色打印油墨)以区分。所述硝酸纤维素膜上固定的探针的位置排列依次为：针对沙眼衣原体、解脲脲原体、梅毒螺旋体、淋球菌的探针，相邻的探针的固定距离为0.5-1mm。本实施例中硝酸纤维素膜固定的探针的位置为：参见图2，内对照：距离位置线1上0.5mm,CT：位置线2下0.5mm，UU：位置线2下1mm，TP:位置线3上0.5mm,NG：位置线3下0.5mm)。将制好的大板在37摄氏度干燥过夜，并切成(2mmX6cm)的长条备用。

3)杂交显色液的配置：杂交显色液所含物质的终浓度为：100mM HEPES－HCL缓冲液，pH8.0；1M的氯化钠；0.4mM EDTA溶液，pH8.0；1％的Latex微球。溶解Hepes到去离子水，用浓HCl调整pH到8,然后加入适量NaCl和EDTA溶液，最后加水补足体积，定容到Hepes终浓度，最后每99ml溶液中加入1ml的latex微球。(杂交时间为5-10分钟，当latex微球在杂交线上富集时，就会显示出其本身蓝色。latex微球购买厂家为：日本的JSR Life Sciences Corporation)，微球上连接有链酶亲和素。

结果判读：如附图2所示，位置线3下方出现蓝色条带代表NG阳性；位置线3上方靠近位置线3一侧出现蓝色条带代表TP阳性；位置线2和位置线3中间位置出现蓝色条带，代表UU阳性；位置线2下方靠近位置线2的位置出现蓝色条带代表CT阳性。检测对象为阴性时，只在位置线1上方出现蓝色条带。

实施例2

实验样本：分两批向临床实验单位取总共12个阴道拭子样本，第一批取5个NG阳性样本(分别命名为A-1/B-1/C-1/D-1/E-1)，一个NG阴性样本，(命名为F/1)；第二批同样取5个NG阳性样本(分别命名为A-2/B-2/C-2/D-2/E-2)，1个NG阴性样本(命名为F-2).

核酸提取：拭子样本用1000ul的生理盐水充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15分钟，去除上清，所得沉淀，用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取。最后用50微升蒸馏水，洗脱核酸，备用

PCR扩增：提取的核酸进行PCR扩增，反应体系为：2xPCR缓冲液10ul,NG引物5ul,样本DNA 5ul.混合均匀。PCR反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环。

第四步：4摄氏度，无限循环

杂交反应：将稀释的显色液与PCR产物1：1混合，去除膜条，插入相应的PCR管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：从实验结果来看，NG对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂的检测特异性是非常高的(参见图3)。

实施例3：CT特异性实验

实验样本：分两批向临床实验单位取总共14个阴道拭子样本，第一批取6个CT阳性样本(分别命名为A-1/B-1/C-1/D-1/E-1/F-1)，1个CT阴性样本，(命名为G-1)；第二批同样取6个CT阳性样本(分别命名为A-2/B-2/C-2/D-2/E-2/F-2)，1个CT阴性样本(命名为G-2).

核酸提取：拭子样本用1000ul的生理盐水充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15分钟，去除上清，所得沉淀，用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取。最后用50微升蒸馏水，洗脱核酸，备用。

PCR扩增：提取的核酸进行PCR扩增，反应体系为：2xPCR缓冲液10ul,CT引物5ul,样本DNA 5ul.混合均匀。PCR反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环。

第四步：4摄氏度，无限循环

杂交反应：将稀释的显色液与PCR产物1：1混合，去除膜条，插入相应的PCR管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：从实验结果来看，CT对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂的检测特异性是非常高的(参见图4)。

实施例4：UU特异性实验

实验样本：分两批向临床实验单位取总共14个阴道拭子样本，第一批取6个UU阳性样本(分别命名为A-1/B-1/C-1/D-1/E-1/F-1)，1个UU阴性样本，(命名为G-1)；第二批同样取6个UU阳性样本(分别命名为A-2/B-2/C-2/D-2/E-2/F-2)，1个UU阴性样本(命名为G-2).

核酸提取：拭子样本用1000ul的生理盐水充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15分钟，去除上清，所得沉淀，用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取。最后用50微升蒸馏水，洗脱核酸，备用

PCR扩增：提取的核酸进行PCR扩增，反应体系为：2xPCR缓冲液10ul,UU引物5ul,样本DNA 5ul.混合均匀。PCR反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环。

第四步：4摄氏度，无限循环

杂交反应：将稀释的显色液与PCR产物1：1混合，去除膜条，插入相应的PCR管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：从实验结果来看，UU对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂的检测特异性是非常高的。

实施例5：TP特异性实验

实验样本：分两批向临床实验单位取总共14个阴道拭子样本，第一批取6个TP阳性样本(分别命名为A-1/B-1/C-1/D-1/E-1/F-1)，1个TP阴性样本，(命名为G-1)；第二批同样取6个TP阳性样本(分别命名为A-2/B-2/C-2/D-2/E-2/F-2)，1个TP阴性样本(命名为G-2).

核酸提取：拭子样本用1000ul的生理盐水充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15分钟，去除上清，所得沉淀，用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取。最后用50微升蒸馏水，洗脱核酸，备用

PCR扩增：提取的核酸进行PCR扩增，反应体系为：2xPCR缓冲液10ul,TP引物5ul,样本DNA 5ul.混合均匀。PCR反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环。

第四步：4摄氏度，无限循环

杂交反应：将稀释的显色液与PCR产物1：1混合，去除膜条，插入相应的PCR管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：从实验结果来看，TP对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂的检测特异性是非常高的(参见图6)。

实施例6灵敏度实验

参考品配置：向国家参考物质中心购买UU和NG参考品，并使用广州市宝创生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)，按照说明书步骤，进行核酸提取。提取的核酸，使用紫外分光光度仪(NanoDrop-2000)进行核酸浓度的测量，在根据测量的浓度，把核酸稀释到160ng/ul的浓度，此时的核酸拷贝数为1.0x10⁵,在用蒸馏水稀释到10⁴，10³，10²copies/ml。TP和CT的标准菌株购自中国微生物菌种保存中心。使用同样的方法进行核酸提取和参考品的浓度测定。最终我们配置了5个CT(命名为A：10⁵copies/ml；B:10⁴copies/ml；C:10³copies/ml；D:10²copies/ml；E:0copies/ml)和UU(命名为F：10⁵copies/ml；G:10⁴copies/ml；H:10³copies/ml；I:10²copies/ml；J:0copies/ml)的参考品,4个TP(命名为K：10⁴copies/ml；L:10³copies/ml；M:10²copies/ml；N:0copies/ml)和NG(命名为O：10⁴copies/ml；P:10³copies/ml；Q:10²copies/ml；R:0copies/ml)的参考品

PCR扩增：提取的核酸进行PCR扩增，反应体系为：2xPCR缓冲液10ul,TP(和UU/NG/CT)引物5ul,样本DNA 5ul.混合均匀。PCR反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环

第四步：4摄氏度，无限循环。

杂交反应：将稀释的显色液与PCR产物1：1混合，去除膜条，插入相应的PCR管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：以上所考察的参考品，均可以溯源至权威出处。从实验结果来看，UU/TP/NG/CT的最低检出限均可以达到10³copies/ml，可见本试剂的检测灵敏度是非常高的。参见图7。

实施例7常见干扰物质的抗干扰实验

采用的干扰物质：

1)洁尔阴洗液10％加入拭子样本

2)醋酸溶液10％加入拭子样本

3)含有溶血的拭子样本

4)使用过抗真菌药物的拭子样本

5)试用过抗生素的拭子样本

6)1％的SDS加入DNA样本

7)1％的乙醇加入DNA样本

8)10％的NaCL加入DNA样本

以上1-5号样本为临床确认的阳性样本，使用核酸提取试剂进行DNA提取后，备用。6-8号样本为无干扰物质的临床样本，提取DNA后，在添加对应的物质，制备干扰样本，备用。

PCR扩增：参照上述实验。

杂交反应：将稀释的显色液与PCR产物1：1混合，去除膜条，插入相应的PCR管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：参见图9，从拍照的结果可以看出，以上所考察的干扰情况，均不影响PCR的扩增和膜条的杂交反应，检测结果与临床判定结果一致。说明本申报试剂具有极强的抗干扰能力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市宝创生物技术有限公司

<120> 淋球菌、梅毒螺旋体、沙眼衣原体、解脲脲原体的杂交膜条和检测试剂盒

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 431

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcgtgccat gtacgaccag tatggtcatg cggcgtttga aggcggcgga caggggggct 60

tcggagggtt tggcggattt ggcggtgcgc agggttttga ctttggggat attttcagcc 120

aaatgtttgg aggtggttcg gggcgcgccc agcctgatta tcagggtgag gacgtgcagg 180

tcggtatcga aatcacgctt gaagaagccg caaaaggtgt gaagaaacgc atcaatattc 240

cgacttatga agcgtgtgat gtctgcaacg gcagcggcgc gaaaccgggg gcatccccgg 300

aaacctgccc gacttgcaaa ggttcgggta cggtgcacat ccagcaggcg attttccgta 360

tgcagcagac ttgtccgacc tgccgcggtg cgggcaaaca tattaaagaa ccttgcgtca 420

aatgccgtgg c 431

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtgccatgt acgaccagta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcatttgac gcaaggttct 20

<210> 4

<211> 530

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatcttggtt cagattgaac gctggcggcg tggatgaggc atgcaagtcg aacggagcaa 60

ttgtttcggc aattgtttag tggcggaagg gttagtaatg catagataat ttgtccttaa 120

cttgggaata acggttggaa acggccgcta ataccgaatg tggcgatatt tgggcatccg 180

agtaacgtta aagaagggga tcttaggacc tttcggttaa gggagagtct atgtgatatc 240

agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gctatgacgt ctaggcggat tgagagattg 300

gccgccaaca ctgggactga gacactgccc agactcctac gggaggctgc agtcgagaat 360

ctttcgcaat ggacggaagt ctgacgaagc gacgccgcgt gtgtgatgaa ggctctaggg 420

ttgtaaagca ctttcgcttg ggaataagag aagacggtta atacccgctg gatttgagcg 480

taccaggtaa agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc tgcggtaata 530

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttcagattg aacgctggcg 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tattaccgca gctgctggc 19

<210> 7

<211> 440

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agtttgaagc agtcgagggt gcagtagcgt tggcggatcg cgcgagttcc ttcatggttg 60

acagcgagga atacaagatt acgaacgtaa aggttcacgg tatgaagttt gtcccagttg 120

cggttcctca tgaattaaaa gggattgcaa aggagaagtt tcacttcgtg gaagactccc 180

gcgttacgga gaataccaac ggccttaaga caatgctcac tgaggatagt ttttctgcac 240

gtaaggtaag cagcatggag agcccgcacg accttgtggt agacacggtg ggtaccggtt 300

accacagccg ttttggttcg gacgcagagg cttctgtgat gctgaaaagg gctgatggct 360

ctgagctgtc gcaccgtgag ttcatcgact atgtgatgaa cttcaacacg gtccgctacg 420

actactacgg tgatgacgcg 440

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agtttgaagc agtcgagggt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tagtagtcgt agcggaccgt 20

<210> 10

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agagcaccat ccagatcgaa acaaatctgc tgatgatact gtttttaaag aaattaatga 60

agcttatgag gtgttatcag atcctaaaaa acgtgctcaa tacgaccaat ttggtcatga 120

tggaccgcaa gggtttgctg gagctggtgg cttttctggg tttagtgatg gatttggcgg 180

tgttgatttt gacatcaacg acatttttgg aagttttttt aaaaatggtg ctagctcacg 240

tagttcatca agccaatatg aaacgtatga cattcattta cgtttacatt tagaatttat 300

agaagctatt aagggtgttt ctaaaaatat tagttatgat cgtaaaatca catgtaacaa 360

gtgtcaagga acaggagcaa aagatcctaa agatgttaaa acttgtacaa aatgtcatgg 420

tcgtggaact acaattgaaa acgttcattc attatttgga acaattcaac aagaagttga 480

atgtcatgaa tgtgagggaa ctgg 504

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agcaccatcc agatcgaaac a 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccagttccct cacattcatg ac 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgaagttccg agtatggcc 19

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcagattcat tggtcagaga aca 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgttggaatc tcgttccagt t 21

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgttctctga ccaatgaatc tgc 23

<210> 17

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagagcacag agacaccact gacgtgcctg agatgcctca ctccaagggc cagggagaga 60

gcgatcctct ggaccatgag cctgccgtgt ctccattgct ccctcgaaaa gagcgaggtc 120

ccccggaggg cggcctgaat gaagatgagc gcc 153

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagagcacag agacaccact 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggcgctcatc ttcattcagg 20

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gctctagcca ccaatgaatc taa 23