本发明涉及一种环七肽，尤其涉及一种结合Cry2Ad的环七肽及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
近十年，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensi,Bt)转基因作物商品化种植推广迅速，研究发现长期大面积种植后会造成杀虫基因逃逸，生物多样性下降以及对非目标生物的间接危害等风险，同时对土壤和水体生态系统也存在潜在的风险，因此，在进行转基因作物研究、开发和商业化的同时，必须建立恰当的方法对粮食及环境中转基因成分进行快速鉴定与检测。
目前，转基因产品的检测技术主要有基于核酸检测的多种新型PCR技术和基于蛋白质的免疫检测，其中免疫检测以其准确、经济、便捷等优势已成为快速检测类应用最为广泛的方法，市场上用于检测Bt毒素的免疫试剂盒大多数是采用以多克隆或单克隆抗体为检测元件，其免疫过程比较繁琐，且受个体和免疫过程的影响较大。噬菌体展示技术可以克服上述缺点，该技术是对含有数以亿计克隆的随机片段进行快速高通量地筛选，获得的阳性克隆可被用于分子识别、快速检测试剂开发等领域。目前利用该技术获得的针对Cry1类毒素蛋白的单链抗体和纳米抗体在Bt毒素检测方面也已得到初步应用。但是基因工程抗体货架期较短，其合成受到氨基酸序列长度和空间结构的限制，因此有一定的制约，而噬菌体肽库很好的避开了上述的瓶颈，因此该技术的应用对开发Cry2Ad检测试剂具有广阔的前景。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应用。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的结合Cry2Ad的环七肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述结合Cry2Ad的环七肽的编码基因。
所述编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的结合Cry2Ad的环七肽的衍生物，所述的衍生物为将所述的结合Cry2Ad的环七肽采用异硫氰酸荧光素(FITC)或5-羧基荧光素(5-FAM)等荧光标记物进行标记得到的检测元件。
本发明的结合Cry2Ad的环七肽或其衍生物在Cry2Ad定性、定量检测中的应用。
本发明以Cry2Ad为靶分子，将靶分子和BSA分别固相包被于酶标板上，先将噬菌体环七肽库投入BSA包被的板上进行负筛选，再将未结合的肽库与靶分子进行结合、洗脱，重复以上过程至特异性七肽明显富集，最终获得1个结合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及上述特异性抗Cry2Ad环七肽氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提及的环七肽可以通过噬菌体噬菌体扩增、基因工程重组表达及人工合成的方式进行制备。噬菌体噬菌体扩增是通过生物扩增的方式大量增殖展示有结合Cry2Ad的环七肽噬菌体粒子。基因工程重组表达是通过将结合Cry2Ad的环七肽基因与表达载体重组后进行表达。人工合成是通过化学合成多肽的方式进行制备。
本发明还涉及结合Cry2Ad环七肽的衍生物。是指对多种制备方法获得的结合Cry2Ad的环七肽进行修饰的产物，主要包括异硫氰酸荧光素(FITC)或5-羧基荧光素(5-FAM)等荧光基团检测标签。
本发明还涉及结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物在免疫学检测中的应用。本发明结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可替代ELISA检测中的检测抗体应用于夹心和竞争ELISA免疫检测。
本发明所述的结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物在粮食样品中检测应用，其具体步骤为：
(1)将500mg固体待测样品干燥磨粉过筛，加入1mL提取液(含0.15％(v/v)吐温20的磷酸缓冲液(PBS))4℃振荡2h后10000g离心10分钟取上清待测。
(2)将10μg/mL小菜蛾刷状缘膜囊泡(Brush Border Membrane Vesicles,BBMV)包被到96孔板中，每孔100μL，4℃过夜；次日洗涤后每孔加200μL MPBS(含3％脱脂奶粉PBS)室温孵育1.5h，再次洗涤后加入100μL步骤(1)制备的待测液，37℃孵育1h，PBST(含0.05％吐温20的PBS)洗涤3次，加入100μL 1011pfu七肽噬菌体上清液，37℃孵育1h后洗涤，再加入1:5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-M13噬菌体二抗孵育1h，洗涤后每孔加入100μL四甲基联苯胺(TMB)显色液，避光显色至蓝色加入50μL 2M硫酸终止显色。
(3)96孔板在酶标仪上测定OD450nm，将检测结果代入公式y＝0.1503ln(x)+0.8995，R2＝0.997，计算Cry2Ad的浓度。
本发明从公开的环七肽库中，筛选获得一种具有特异性识别Cry2Ad毒素的七肽，可用于该毒素的检测。
有益效果：本发明具有下述有益效果：
1.本发明结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可以替换抗体作为检测元件，避免多克隆或单克隆抗体制备时的动物免疫，对比基因工程抗体更方便体外合成且货架期长。
2.本发明结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可以和Cry2Ad毒素特异性结合，检测效果好，对开发快速检测试剂盒有重要的科学及现实意义。
3.本发明结合Cry2Ad的环七肽可以人工合成，简化了制备过程，节约了成本，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为以结合Cry2Ad的环七肽建立的夹心ELISA标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
本发明的结合Cry2Ad的环七肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的结合Cry2Ad的环七肽可以通过噬菌体扩增、基因工程重组表达及人工合成的方式进行制备。噬菌体扩增是指利用噬菌体侵染大肠杆菌后释放出大量展示有环七肽的噬菌体；基因工程重组表达是指将该环七肽基因连接在表达载体后大量表达；人工合成是指利用环七肽的氨基酸序列化学合成。
实施例中所涉及的试剂和培养基配方：
(1)LB液体培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
(2)LB固体培养基：在1L的LB液体培养中加入15g琼脂，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
(3)PBS溶液：称氯化钠8g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，充分溶解后定容至1L。
(4)PBST溶液：在PBS溶液中加入体积比为0.05％的吐温20。
(5)PEG/NaCl溶液：称20g PEG 8000,氯化钠14.61g，定容到100mL，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
(6)CBS溶液：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.94g，定容到1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
(7)TMB溶液：10g四甲基联苯胺溶于1mL二甲基亚砜中。
(8)底物显色液：9.875mL CPBS，100μL TMB溶液，25μL体积比为20％H2O2。
(9)TBS溶液：1mol/L Tris/HCl(pH7.5)10mL,氯化钠8.8g定容到1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
(10)TBST溶液：TBS溶液中加入不同体积比的吐温20。
(11)MPBS溶液：3％(w/v)脱脂奶粉溶于PBS溶液中。
(12)环七肽库、-96gⅢ测序引物和E.Coil ER2738购于NEB公司。
实施例1.结合Cry2Ad的环七肽的淘选及鉴定
1.结合Cry2Ad的环七肽亲和淘选具体方法：
a.第一轮淘选：以100μg/mL BSA和100μg/mL Cry2Ad包被6孔酶标板，4℃孵育过夜。次日用0.1％(v/v)吐温20(Tween-20)TBST洗涤6次后，以BSA为负筛选靶标进行预筛选，再与活化的Cry2Ad毒素结合，结合后0.1％TBST洗涤10次，并以竞争洗脱方式进行洗脱。洗脱液感染20mL对数期的E.coil ER2738进行扩增4.5h，用PEG/NaCl过夜沉淀噬菌体，次日离心后重悬，获得次级文库。
b.进一步筛选：重复步骤a的方法再进行三轮淘选，在第二至第四轮淘选中，Cry2Ad包被浓度分别为75、50、25μg/mL，第1轮洗涤条件是体积比0.1％的Tween20，第2和第3轮Tween-20浓度变为0.3％(v/v)各洗20次，第四轮Tween-20浓度为0.5％(v/v)洗涤25次。每轮洗脱时间减短。降低包被浓度、加强洗涤强度增加多肽的亲和力。
2.结合Cry2Ad的环七肽的鉴定：从第四轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑选25个噬菌斑，侵染ER2738进行扩增，扩增后的噬菌体测定滴度，采用间接ELISA进行七肽结合活性的鉴定，靶蛋白用CBS进行稀释，以10μg/mL Cry2Ad蛋白包被酶标板，4℃过夜，BSA作为阴性对照。次日封闭2h，每孔分别加入1011pfu噬菌体室温孵育1h，洗涤后加入HRP-M13抗体(1:5000稀释)结合1h，洗去未结合的抗体，加入底物TMB显色，测定吸光值A450，选取A450大于阴性对照3倍的噬菌体克隆为阳性克隆。
阳性克隆的菌液DNA测序由上海生工生物技术公司完成，引物为-96gⅢ。
实施例中涉及的核苷酸序列：
ACCTCCACCGCAACTCTGATTATGCTGACTCGAACAAGC
使用DNAMAN和Swiss数据库序列进行分析。获得相应的氨基酸序列：
ACSSQHNQSCGGG
实施例2.结合Cry2Ad的环七肽特异性检测
采用棋盘滴定确定Cry2Ad的最佳包被浓度以及阳性噬菌体克隆的最佳稀释倍数(1012、1011、1010、109、108pfu)。按最佳Cry2Ad浓度包被微孔，4℃过夜，MPBS封闭后，加入孵育过夜的毒素与多肽的混合物(取50μL最佳稀释倍数的噬菌体阳性克隆与50μL Cry2Ad毒素混匀，毒素浓度为320μg/mL开始4倍往下稀释8个梯度)，同时以BSA作为阴性对照，加入HRP标记抗M13，TMB显色后测定A450值。做3次平行重复试验，计算抑制率。抑制率计算方法：抑制率＝(抑制前A450－抑制后A450)/抑制前A450×100％。分别以类似物Cry1C、Cry1B、Cry1Ab作为竞争抑制物，测定交叉反应率(CR)，评价该方法的特异性，交叉反应率数据如表1所示：
表1特异性七肽对Cry1Ab、Cry1B、Cry1C的交叉反应率
实施例3.以结合Cry2Ad的环七肽为检测元件的夹心ELISA方法建立
(1)以噬菌体扩增的方式大量制备特异性环七肽
将展示有特异性环七肽的噬菌体加入20mL培养至对数生长期的ER2738中，37℃培养4.5h。12000g离心10min，取16mL上清液加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置1h，10000rpm离心15min，沉淀用1mL TBS重悬，即为扩增液。
(2)标准曲线的建立
用棋盘法确定BBMV的最佳包被浓度以及阳性噬菌体克隆的最佳稀释倍数。BBMV包被浓度为10μg/mL噬菌体稀释度为1011pfu。BBMV包被过夜后用PBST洗3次，1％BSA室温封闭1h。PBST洗涤后加入梯度稀释的Cry2Ad(10-0.01μg/mL)，BSA为阴性对照，孵育1h。PBST洗3次，加入1011pfu噬菌体扩增液，37℃孵育1h。加入100μL 1:5000倍稀释的HRP标记的抗M13二抗孵育1h，TMB显色后H2SO4终止，测定A450，绘制标准曲线。最低检测限为空白对照值加上三倍的标准差。标准曲线如附图1所示。
实施例4.夹心ELISA在玉米样品添加回收试验中的应用
(1)将500mg固体待测样品干燥磨粉过筛，加入1mL提取液(含0.15％吐温20的PBS)4℃振荡2h后10000g离心10分钟取上清待测。
(2)将10μg/mL BBMV包被到96孔板中，每孔100μL，4℃过夜；次日洗涤后每孔加200μL MPBS(含3％脱脂奶粉PBS)室温孵育1.5h，再次洗涤后加入100μL步骤(1)制备的待测液，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，加入100μL 1011pfu七肽噬菌体上清液，37℃孵育1h后洗涤，再加入1:5000倍稀释的HRP标记的抗-M13二抗孵育1h，洗涤后每孔加入100μL TMB显色液，避光显色至蓝色加入50μL 2M硫酸终止显色。
(3)96孔板在酶标仪上测定OD450nm，将检测结果代入公式y＝0.1503ln(x)+0.8995，R2＝0.997，计算Cry2Ad的浓度，检测结果如表2所示。
表2夹心ELISA测定Cry2Ad毒素在玉米中的添加回收率
SEQUENCE LISTING
<110> 金陵科技学院
<120> 一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应用
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acctccaccg caactctgat tatgctgact cgaacaagc 39
<210> 2
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Leu Ala Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ser Glu Arg Gly Leu Asn His
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ser Asn Gly Leu Asn Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Gly Leu
20 25 30
Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr
35