具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的油菜蛋白质、其编码基因及应用的制作方法

本发明属于抗除草剂蛋白质领域，具体涉及一种具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的油菜蛋白质、其编码基因及应用。

背景技术：

油菜是我国四大主要油料作物之一(其他为大豆、花生、向日葵)，是我国播种面积最大，分布最广的油料作物。

由于机械化直播油菜的推广，杂草对油菜产量的影响越来越大。杂草的发生对油菜产量一般减产20％～30％，严重时达50％以上，最严重的田块颗粒无收。油菜田中杂草种类复杂，一类是看麦娘、棒头草等禾本科杂草，另一类是繁缕、猪殃殃等阔叶杂草。同时防除这两类杂草涉及到除草剂混用问题。但是，混用除草剂需要的技术性非常强，由于除草剂具有高度选择性和强烈杀伤力，稍有不慎容易造成药害甚至毁坏作物。而种植抗除草剂油菜则可以避免这个问题。

油菜内源的抗除草剂乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxy acid synthase，简称AHAS)蛋白质由ahas基因突变产生，表达抗除草剂AHAS蛋白质可以使植物获得抗除草剂特性，解决田块中的杂草问题。AHAS蛋白质主要分布在微生物和植物中，在动物中几乎不存在，AHAS抑制除草剂对人畜无害。因此，发掘和研究具有抗除草剂活性的油菜AHAS蛋白质具有良好的创新性和经济价值。

目前，培育抗AHAS抑制除草剂油菜的方法为以油菜种子或者植株为材料进行化学或者物理诱变，进行植物体内基因组突变。这种方法获得抗除草剂油菜的试验时间长(大于3年)，获得新突变体难(突变结果为核苷酸单个碱基变化引起单个氨基酸的替换，容易与已经存在的突变重复)，而且成功几率小(通常突变成功率小于百万分之一)，很多实验室进行超过5年的研发无法获得新的突变体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的油菜蛋白质、其编码基因及应用，其为油菜乙酰羟基酸合成酶(即AHAS)突变体蛋白质，该蛋白质具有抗咪唑啉酮类除草剂的活性，其编码基因转化的植物具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。

与目前通过体内突变获得的氨基酸替换突变体不同，本发明采用氨基酸删除策略，通过基因体外突变，改造油菜AHAS蛋白质，获得油菜AHAS突变体蛋白质，使其具有抗除草剂特性。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的油菜蛋白质，其为油菜乙酰羟基酸合成酶的突变体蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示。

本发明其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的抗咪唑啉酮类除草剂活性的蛋白质为前体全长蛋白质,该前体全长蛋白质删除信号肽后成为成熟蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的基因，其为编码所述具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的油菜蛋白质的核苷酸序列。

进一步，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。

本发明所述具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的油菜蛋白质用于培育抗咪唑啉酮类除草剂植物。

一种获得抗咪唑啉酮类除草剂植物的方法，包括，将所述油菜AHAS突变体蛋白质的编码基因转化到植物中,使植物产生具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的油菜AHAS突变体蛋白质。

进一步，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。

进一步，所述咪唑啉酮类除草剂为咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟或者甲基咪草烟，但不限于这几种咪唑啉酮类除草剂。

进一步，所述植物为油菜、玉米或棉花，但不限于这几种植物。

本发明抗除草剂活性的油菜蛋白质，其为油菜中经过人工改造的AHAS突变体蛋白质，源于油菜中ahas1基因的表达，将油菜AHAS通过体外突变，获得AHAS突变体蛋白质，其氨基酸序列的特点为：与野生型油菜AHAS蛋白质相比，缺失Ser638位点氨基酸，该突变体蛋白质对咪唑啉酮类除草剂具有抗性。

将本发明获得的AHAS突变体蛋白质的编码基因转化到植物中，在植物中进行表达，使植物中含有油菜AHAS突变体蛋白质，可使植物具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。

本发明的油菜AHAS突变体蛋白质的编码基因的核苷酸序列不限于油菜内源序列，可以是表达所述蛋白质的人工合成核苷酸序列。

在油菜、玉米或者棉花中表达油菜AHAS突变体，得到转基因油菜R-RA1M6、转基因玉米M-RA1M6、转基因棉花C-RA1M6，在转基因植物和野生型植物苗期喷洒抗咪唑啉酮类除草剂，野生型植物植株全部死亡，转基因植物全部存活。说明表达本发明AHAS突变体蛋白质的植物具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明采用氨基酸删除策略，对氨基酸进行定点突变，可对删除氨基酸后的突变体蛋白质进行体外抗除草剂活性测定，为开发更多新型抗除草剂AHAS突变体蛋白质提供基础，具有操作简单，筛选过程简单、创新性强等优点。

2)本发明的AHAS突变体蛋白质是通过体外突变获得的，体外突变具有可设计性强、试验时间短、创新性强等体内突变无法比拟的优点，获得突变体时间小于2个月，同时，通过特定的突变设计，避免与已报道AHAS突变体蛋白质重复。

3)将本发明AHSA突变体蛋白质的编码基因表达后，获得的AHAS全长突变体蛋白质和AHAS无信号肽成熟突变体蛋白质均具有抗咪唑啉酮类除草剂的特性。

附图说明

图1为本发明实施例1中纯化后的AHAS蛋白质PAGE电泳图；

其中，泳道1：纯化后的RA1WS蛋白质；泳道2：纯化后的RA1M6S蛋白质；Mk：蛋白质Marker，分子量已在图上标出。

图2和图3为本发明实施例2中RA1M6S及其对照RA1WS对咪唑啉酮类除草剂(咪唑乙烟酸和甲氧咪草烟)的抗性曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例中，如无特殊说明为《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002年)所记载方法。

引物合成和测序委托生工上海生物工程股份有限公司进行，试剂、菌株、载体等实验用品从杭州西格玛生物技术公司购买。

咪唑烟乙酸除草剂为山东先达公司的“豆说好”，稀释浓度为稀释200倍。甲基咪草烟除草剂为德国巴斯夫公司的“百垄通”，稀释浓度为稀释1000倍。甲氧咪草烟除草剂为美国氰胺公司的“金豆”，稀释浓度为稀释100倍。

实施例1获得油菜内源乙酰乳酸合成酶突变体蛋白质，包括以下步骤：

1.构建删除Ser638位点氨基酸的ahas1基因

1)通过多聚合链式反应(PCR)的方法，从油菜因组中扩增出ahas1基因(NCBI序列号：Z11524)。

其中，进行PCR反应使用的引物为：

BN A1F：5’ctaaccatggcggcggcaacatcgtc；

BN A1EcoR：5’gaattctcagtacttagtgcgaccatcccctt。

PCR反应体系为：2×高保真聚合酶预混液50μl、引物BN A1F(10μM)4μl、引物BN A1EcoR(10μM)4μl、野生型油菜基因组DNA 1μl和去离子水41μl，总体积为100μl。

PCR程序：a)95℃，10分钟；b)95℃，40秒；c)52℃，40秒；d)68℃，2分钟；e)循环步骤2-4，25次；f)68℃，10分钟；g)16℃，保存。

2)通过琼脂糖电泳分离、纯化出步骤1)的PCR产物，即ahas1基因，将PCR产物进行T克隆(pGEMT，美国Promega公司)，获得克隆T-RA1W。

3)以T-RA1W为模板，使用引物TA A1629SF和TA A1629SR进行PCR反应，将PCR产物进行T克隆，获得删除Ser638氨基酸的突变体克隆T-RA1M6。

其中，PCR反应体系和程序中，除模板和引物外其它条件与步骤1)相同。

引物的具体序列为：

TA A1629SF：5’cacgtgctgcctatgatcccaggtggtgcttttaaggacatg；

TA A1629SR：5’catgtccttaaaagcaccacctgggatcataggcagcacgtg。

其中，RA1M6的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.表达、纯化删除信号肽的AHAS成熟蛋白质

(1)以T-RA1W为模板，使用引物BN A1BamF和BN A1EcoR进行PCR反应，将PCR产物进行T克隆，获得删除信号肽的野生型T-RA1WS。

其中，PCR反应体系和程序中，除模板和引物外其它条件与上述步骤1)相同，引物的具体序列为：

BN A1BamF：5’ggatccacaatgactttcgtctcccgctacgctc；

BN A1EcoR：5’gaattctcagtacttagtgcgaccatcccctt。

(2)构建蛋白质表达载体，将RA1WS克隆入pGEX4T2(美国GE生命科学公司)，获得表达无信号肽的AHAS野生型蛋白质的载体4T2-RA1WS。

(3)将表达无信号肽的AHAS野生型蛋白质的载体转入表达菌株Rosetta中，培养、收获细胞，超声波破碎细胞，将离心获得上清液通过GST柱，清洗GST柱，最终洗脱获得成熟的野生型蛋白质RA1WS。

同理，采用与上述步骤(1)至步骤(3)同样的方法，以删除Ser638位点氨基酸的T-RA1M6基因为模板，以引物BN A1Bam和BN A1EcoR为引物，进行PCR反应、T克隆、构建表达载体4T2-RA1M6S，将表达载体4T2-RA1M6S转入表达菌株Rosetta中进行表达，获得无信号肽而且删除Ser638氨基酸的成熟AHAS突变体蛋白质RA1M6S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

将获得的野生型蛋白质RA1WS和成熟的AHAS突变体蛋白质RA1M6S进行SDS-PAGE电泳检测，蛋白质胶参见图1。

由图1可见，泳道1中的RA1WS和泳道2中的RA1M6S蛋白质在90kDa位置具有明显条带，此位置与蛋白质的理论大小相符。此外，该蛋白质条带在整个泳道的蛋白质条带中占主要比例，说明获得了高纯度的成熟的油菜AHAS野生型蛋白质和成熟的油菜AHAS突变体蛋白质。

实施例2检测AHAS突变体蛋白质对除草剂的抗性

分别以实施例1获得的野生型蛋白质RA1WS和突变体蛋白质RA1M6S为检测主体，水为空白对照处理，以浓度在0-100μM的不同品种除草剂(咪唑烟乙酸和甲氧咪草烟)为影响因素，进行抗除草剂生物测定。

在2mL的离心管中配置溶液反应体系：450μl AHAS活性测定缓冲液，10μlAHAS蛋白质(RA1WS或RA1M6S，0.5μg/μl)，40μl影响因素溶液(以水为空白对照处理)，总体积500μl。

AHAS活性测定缓冲液：100mM丙酮酸钠，10mM氯化镁，1mM TPP，50μM FAD，50mM磷酸盐，pH7.4。

反应程序：将含有不同影响因素反应体系的离心管置于37℃反应1小时；20μl 30％硫酸终止反应。60℃反应0.5小时；加入250μl 1.7％α-萘酚，0.17％肌酸，60℃显色0.5小时。从离心管中取出200μl，检测含有不同影响因素的溶液在525nm吸光度值。

检测结果：以除草剂浓度为0(影响因素溶液为水对照)的野生型蛋白质RA1WS处理的525nm吸光度值为100％活性，计算野生型和突变体蛋白质在不同影响因素条件下的活性比例，绘制曲线图，结果参见图2-图3。

由图2-图3可见，随着咪唑啉酮类除草剂的增加，RA1WS活性降低至0；而RA1M6S活性在高浓度除草剂中依然保持接近100％活性。

因此，本发明获得的RA1M6S对咪唑啉酮类除草剂具有抗性。

实施例3油菜ahas1突变体基因在植物中的转化及表达

1.构建AHAS突变体蛋白质的表达元件

为了在单子叶和双子叶植物中表达AHAS突变体蛋白质，以pCambia1300载体(简称1300)为载体，用辣椒斑驳病毒35S(简称35S)启动子和终止子构建AHAS表达元件，35S启动子和终止子的DNA序列见http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA1300/，具体步骤如下：

(1)以实施例1获得的T-RA1M6为模板，使用引物BN A1BamF和BN A1SacR，通过PCR和BamH1/Sac1双酶切，获得ahas1突变体片段RA1M6T；

其中，引物序列为：

BN A1BamF：5’ggatccacaatgactttcgtctcccgctacgctc；

BN A1SacR：5’gagctctcagtacttagtgcgaccatcccctt。

(2)以1300载体为模板，使用引物35S-Hind和35S-Bam，通过PCR和BamH1/Hind3双酶切，获得启动子片段35S；

其中，引物序列为：

35S-Hind：5’gcgaagcttcatggagtcaaagattcaaa；

35S-Bam：5’gtgggatccagtcccccgtgttctctccaaatgaa。

(3)以1300载体为模板，使用引物ter-Sac和ter-Kpn，通过PCR和BamH1/Hind3双酶切，获得终止子片段ter；

其中，引物序列为：

ter-Sac：5’gtggagctcagtagatgccgaccggatctgt；

ter-Kpn：5’cagggtacccgccgaattaattcggggga。

(4)将1300进行HindIII/SacI双酶切，获得片段1300HS，与35S和RA1M6T进行连接、克隆，获得1300-35S-RA1M6。

(5)将1300-35S-RA1M6进行SacI/KpnI双酶切，与ter连接、克隆，获得表达油菜AHAS突变体的载体1300-RA1M6。

(6)将载体1300-RA1M6转入农杆菌菌株LBA4044中，获得表达AHAS突变体蛋白质的植物转化农杆菌。

2.获得表达AHAS突变体蛋白质的植物

转基因植物的获得方法为现有成熟技术，转基因植物制备委托上海博祈生物科技有限公司进行。

使用农杆菌介导法将载体1300-RA1M6分别转入油菜、玉米和棉花中，获得转基因油菜R-RA1M6，转基因玉米M-RA1M6、转基因棉花C-RA1M6。

在获得的转基因植物转基因油菜R-RA1M6、转基因玉米M-RA1M6、转基因棉花C-RA1M6和对应野生型植物的苗期喷除草剂，十天后，统计死亡率，结果参见表1。

表1

由表1可知，野生型植物植株全部死亡，而转基因植物全部存活，说明表达本发明油菜AHAS突变体蛋白质的植物具有抗咪唑啉酮类除草剂活性。

<110> 上海市农业科学院

<120> 具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的油菜蛋白质、其编码基因及应用

<130> 1711036

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> SEQ ID NO.1

<211> 654

<212> PRT

<213> 油菜（Brassica napus）

<400> 1

Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Leu Thr Pro Gln Lys Asp Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

35 40 45

Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu

50 55 60

Lys Thr Asp Lys Asn Lys Thr Phe Val Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu

65 70 75 80

Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly

85 90 95

Val Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His

100 105 110

Gln Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His

115 120 125

Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly

130 135 140

Lys Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu

145 150 155 160

Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala

165 170 175

Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln

180 185 190

Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr

195 200 205

Leu Val Met Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe

210 215 220

Phe Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro

225 230 235 240

Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met

245 250 255

Arg Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser

260 265 270

Gln Leu Gly Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val

275 280 285

Leu Tyr Val Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg

290 295 300

Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu

305 310 315 320

Gly Ser Tyr Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met

325 330 335

His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu

340 345 350

Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu

355 360 365

Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala

370 375 380

Glu Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val

385 390 395 400

Lys Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu

405 410 415

Glu Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln

420 425 430

Lys Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro

435 440 445

Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala

450 455 460

Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe

465 470 475 480

Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly

485 490 495

Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn

500 505 510

Pro Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met

515 520 525

Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys

530 535 540

Ile Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu

545 550 555 560

Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro

565 570 575

Ala Arg Glu Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala

580 585 590

Cys Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu

595 600 605

Ala Ile Gln Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val

610 615 620

Ile Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Gly Gly Thr

625 630 635 640

Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

645 650

<210> SEQ ID NO.2

<211> 1965

<212> DNA

<213> 油菜（Brassica napus）

<400> 2

atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60

cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa agactcctcc 120

cgtctccacc gtcctctcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180

ccttcccctg aaaaaaccga caagaacaag actttcgtct cccgctacgc tcccgacgag 240

ccccgcaagg gtgctgatat cctcgtcgaa gccctcgagc gtcaaggcgt cgaaaccgtc 300

tttgcttatc ccggaggtgc ttccatggag atccaccaag ccttgactcg ctcctccacc 360

atccgtaacg tccttccccg tcacgaacaa ggaggagtct tcgccgccga gggttacgct 420

cgttcctccg gcaaaccggg aatctgcata gccacttcgg gtcccggagc taccaacctc 480

gtcagcgggt tagcagacgc gatgcttgac agtgttcctc ttgtcgccat tacaggacag 540

gtccctcgcc ggatgatcgg tactgacgcc ttccaagaga caccaatcgt tgaggtaacg 600

aggtctatta cgaaacataa ctatttggtg atggatgttg atgacatacc taggatcgtt 660

caagaagctt tctttctagc tacttccggt agacccggac cggttttggt tgatgttcct 720

aaggatattc agcagcagct tgcgattcct aactgggatc aacctatgcg cttacctggc 780

tacatgtcta ggttgcctca gcctccggaa gtttctcagt taggtcagat cgttaggttg 840

atctcggagt ctaagaggcc tgttttgtac gttggtggtg gaagcttgaa ctcgagtgaa 900

gaactgggga gatttgtcga gcttactggg atccccgttg cgagtacttt gatggggctt 960

ggctcttatc cttgtaacga tgagttgtcc ctgcagatgc ttggcatgca cgggactgtg 1020

tatgctaact acgctgtgga gcatagtgat ttgttgctgg cgtttggtgt taggtttgat 1080

gaccgtgtca cgggaaagct cgaggctttc gctagcaggg ctaaaattgt gcacatagac 1140

attgattctg ctgagattgg gaagaataag acacctcacg tgtctgtgtg tggtgatgta 1200

aagctggctt tgcaagggat gaacaaggtt cttgagaacc gggcggagga gctcaagctt 1260

gatttcggtg tttggaggag tgagttgagc gagcagaaac agaagttccc tttgagcttc 1320

aaaacgtttg gagaagccat tcctccgcag tacgcgattc agatcctcga cgagctaacc 1380

gaagggaagg caattatcag tactggtgtt ggacagcatc agatgtgggc ggcgcagttt 1440

tacaagtaca ggaagccgag acagtggctg tcgtcatcag gcctcggagc tatgggtttt 1500

ggacttcctg ctgcgattgg agcgtctgtg gcgaaccctg atgcgattgt tgtggatatt 1560

gacggtgatg gaagcttcat aatgaacgtt caagagctgg ccacaatccg tgtagagaat 1620

cttcctgtga agatactctt gttaaacaac cagcatcttg ggatggtcat gcaatgggaa 1680

gatcggttct acaaagctaa cagagctcac acttatctcg gggacccggc aagggagaac 1740

gagatcttcc ctaacatgct gcagtttgca ggagcttgcg ggattccagc tgcgagagtg 1800

acgaagaaag aagaactccg agaagctatt cagacaatgc tggatacacc aggaccatac 1860

ctgttggatg tgatatgtcc gcaccaagaa catgtgttac cgatgatccc aggtggcact 1920

ttcaaagatg taataacaga aggggatggt cgcactaagt actga 1965

<210> SEQ ID NO.3

<211> 584

<212> PRT

<213> 油菜（Brassica napus）

<400> 3

Thr Phe Val Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp

1 5 10 15

Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Glu Thr Val Phe Ala

20 25 30

Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser

35 40 45

Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe

50 55 60

Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly Ile Cys Ile

65 70 75 80

Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp

85 90 95

Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro

100 105 110

Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu

115 120 125

Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met Asp Val Asp

130 135 140

Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Thr Ser Gly

145 150 155 160

Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln

165 170 175

Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro Gly Tyr Met

180 185 190

Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser Gln Leu Gly Gln Ile Val

195 200 205

Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly

225 230 235 240

Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn

245 250 255

Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala

260 265 270

Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg

275 280 285

Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala

290 295 300

Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys

305 310 315 320

Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly

325 330 335

Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys Leu Asp Phe

340 345 350

Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys Phe Pro Leu

355 360 365

Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln

370 375 380

Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val

385 390 395 400

Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro

405 410 415

Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu

420 425 430

Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala Ile Val Val

435 440 445

Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala

450 455 460

Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu Leu Asn Asn

465 470 475 480

Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala

485 490 495

Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu Asn Glu Ile

500 505 510

Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala Cys Gly Ile Pro Ala Ala

515 520 525

Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln Thr Met Leu

530 535 540

Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro His Gln Glu

545 550 555 560

His Val Leu Pro Met Ile Pro Gly Gly Thr Phe Lys Asp Val Ile Thr

565 570 575

Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

580

<210> SEQ ID NO.4

<211> 1755

<212> DNA

<213> 油菜（Brassica napus）

<400> 4

actttcgtct cccgctacgc tcccgacgag ccccgcaagg gtgctgatat cctcgtcgaa 60

gccctcgagc gtcaaggcgt cgaaaccgtc tttgcttatc ccggaggtgc ttccatggag 120

atccaccaag ccttgactcg ctcctccacc atccgtaacg tccttccccg tcacgaacaa 180

ggaggagtct tcgccgccga gggttacgct cgttcctccg gcaaaccggg aatctgcata 240

gccacttcgg gtcccggagc taccaacctc gtcagcgggt tagcagacgc gatgcttgac 300

agtgttcctc ttgtcgccat tacaggacag gtccctcgcc ggatgatcgg tactgacgcc 360

ttccaagaga caccaatcgt tgaggtaacg aggtctatta cgaaacataa ctatttggtg 420

atggatgttg atgacatacc taggatcgtt caagaagctt tctttctagc tacttccggt 480

agacccggac cggttttggt tgatgttcct aaggatattc agcagcagct tgcgattcct 540

aactgggatc aacctatgcg cttacctggc tacatgtcta ggttgcctca gcctccggaa 600

gtttctcagt taggtcagat cgttaggttg atctcggagt ctaagaggcc tgttttgtac 660

gttggtggtg gaagcttgaa ctcgagtgaa gaactgggga gatttgtcga gcttactggg 720

atccccgttg cgagtacttt gatggggctt ggctcttatc cttgtaacga tgagttgtcc 780

ctgcagatgc ttggcatgca cgggactgtg tatgctaact acgctgtgga gcatagtgat 840

ttgttgctgg cgtttggtgt taggtttgat gaccgtgtca cgggaaagct cgaggctttc 900

gctagcaggg ctaaaattgt gcacatagac attgattctg ctgagattgg gaagaataag 960

acacctcacg tgtctgtgtg tggtgatgta aagctggctt tgcaagggat gaacaaggtt 1020

cttgagaacc gggcggagga gctcaagctt gatttcggtg tttggaggag tgagttgagc 1080

gagcagaaac agaagttccc tttgagcttc aaaacgtttg gagaagccat tcctccgcag 1140

tacgcgattc agatcctcga cgagctaacc gaagggaagg caattatcag tactggtgtt 1200

ggacagcatc agatgtgggc ggcgcagttt tacaagtaca ggaagccgag acagtggctg 1260

tcgtcatcag gcctcggagc tatgggtttt ggacttcctg ctgcgattgg agcgtctgtg 1320

gcgaaccctg atgcgattgt tgtggatatt gacggtgatg gaagcttcat aatgaacgtt 1380

caagagctgg ccacaatccg tgtagagaat cttcctgtga agatactctt gttaaacaac 1440

cagcatcttg ggatggtcat gcaatgggaa gatcggttct acaaagctaa cagagctcac 1500

acttatctcg gggacccggc aagggagaac gagatcttcc ctaacatgct gcagtttgca 1560

ggagcttgcg ggattccagc tgcgagagtg acgaagaaag aagaactccg agaagctatt 1620

cagacaatgc tggatacacc aggaccatac ctgttggatg tgatatgtcc gcaccaagaa 1680

catgtgttac cgatgatccc aggtggcact ttcaaagatg taataacaga aggggatggt 1740

cgcactaagt actga 1755