NemesiastrumosaKLM花青素生物合成基因及编码蛋白和应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及Nemesia strumosa KLM花青素生物合成六个关键基因：查尔酮合成酶基因、黄烷酮3-羟化酶基因、类黄酮-3'-羟化酶基因、类黄酮-3',5'-羟基化酶基因、二氢黄酮醇-4-还原酶基因和花青素合成酶基因及其应用。

背景技术：

花青素(anthocyanin)属于黄酮类化合物，是广泛存在于被子植物(主要是开花植物)中的水溶性天然色素。植物能够呈现出不同的颜色主要与6大类花青素相关，分别为飞燕草素(delphinidin)、矢车菊素(cyanidin)、天竺葵素(pelargonidin)、芍药花色素(peonidin)、牵牛花色素(petunidin)和锦葵色素(malvidin)。Nemesia strumosa是重要的花卉品种，花形优美雅趣，色彩鲜艳多变。可用于花坛、花境中，也可栽种在花盆里作为阳台盆景。Nemesia strumosa KLM花瓣上部饱满的蓝色与下部的奶油白色形成了鲜明对比。Nemesia strumosa KLM由荷兰KLM航空公司命名，因其公司的代表色是蓝色和白色。

在花青素生物合成途径中，查尔酮合成酶(CHS)是花青素合成途径中的第一个酶，它可以催化一分子香豆酸和三分子的丙二酰辅酶A生成一分子的4-羟基查尔酮(异甘草素)；花色素苷的生物合成主要由三个关键酶F3H、F3′H和F3′5′H的作用形成三个分支，黄烷酮3-羟化酶(F3H)催化黄槲皮素形成二氢黄酮醇；类黄酮-3'-羟化酶(F3′H)催化二氢黄酮醇形成二氢槲皮素；F3′5′H催化二氢黄酮醇生成二氢杨梅黄酮；二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)分别催化二氢黄酮醇、二氢槲皮素和二氢杨梅素分别生成无色天竺葵素、无色矢车菊素和无色飞燕草素。花青素合成酶(ANS)是依赖2-酮戊二酸的双加氧酶，ANS在花青素合成的后期可以将无色花青素转化为有色花青素。编码这六个酶的基因是花青素生物合成途径的关键基因，直接关系到花青素的合成。因此Nemesia strumosa KLM花青素生物合成关键基因：查尔酮合成酶基因、黄烷酮3-羟化酶基因、类黄酮-3'-羟化酶基因、类黄酮-3',5'-羟基化酶基因、二氢黄酮醇-4-还原酶基因和花青素合成酶基因可应用于Nemesia strumosa花青素生物合成的调控，改良Nemesia strumosa的花色。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供Nemesia strumosa KLM花青素生物合成六个关键基因：

Nemesia strumosa KLM花青素生物合成六个关键基因，查尔酮合成酶基因(NsCHS)的碱基序列如SEQ ID NO：1所示、黄烷酮3-羟化酶基因(NsF3H)的碱基序列如SEQ ID NO：2所示、类黄酮-3'-羟化酶基因(NsF3′H)碱基序列如SEQ ID NO：3所示、类黄酮-3’,5’-羟基化酶基因(NsF3'5'H)的碱基序列如SEQ ID NO：4所示、二氢黄酮醇-4-还原酶基因(NsDFR)碱基序列如SEQ ID NO：5所示、花青素合成酶基因(NsANS)碱基序列如SEQ ID NO：6所示。

Nemesia strumosa KLM花青素生物合成六个关键基因编码的蛋白质，查尔酮合成酶(NsCHS)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示、黄烷酮3-羟化酶(NsF3H)氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示、类黄酮-3'-羟化酶(NsF3′H)氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示、类黄酮-3’,5’-羟基化酶(NsF3'5'H)氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示、二氢黄酮醇-4-还原酶基因(NsDFR)氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示、花青素合成酶(NsANS)氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

所述查尔酮合成酶(NsCHS)序列应用于过表达或反义调控查尔酮合成酶基因(NsCHS)的表达，改良Nemesia strumosa花青素的含量，获得新的转基因株系。

所述黄烷酮3-羟化酶基因(NsF3H)序列应用于过表达或反义调控黄烷酮3-羟化酶基因(NsF3H)的表达，改良Nemesia strumosa花青素的含量，获得新的转基因株系。

所述Nemesia strumosa KLM类黄酮-3′-羟化酶(NsF3′H)序列应用于过表达或反义调控类黄酮-3′-羟化酶(NsF3′H)的表达，改良Nemesia strumosa花青素的含量，获得新的转基因株系。

所述Nemesia strumosa KLM类黄酮-3′,5′-羟基化酶(NsF3'5'H)序列应用于过表达或反义调控类黄酮-3’,5’-羟基化酶(NsF3'5'H)的表达，改良Nemesia strumosa花青素的含量，获得新的转基因株系。

所述桑树二氢黄酮醇-4-还原酶基因(NsDFR)序列应用于过表达或反义调控二氢黄酮醇-4-还原酶基因(NsDFR)的表达，改良Nemesia strumosa花青素的含量，获得新的转基因株系。

所述Nemesia strumosa花青素合成酶(NsANS)序列应用于过表达或反义调控花青素合成酶(NsANS)的表达，改良Nemesia strumosa花青素的含量，获得新的转基因株系。

本发明所述的Nemesia strumosa KLM查尔酮合成酶基因(NsCHS)、黄烷酮3-羟化酶基因(NsF3H)、类黄酮-3'-羟化酶基因(NsF3'H)、类黄酮-3',5'-羟基化酶基因(NsF3’5’H)、二氢黄酮醇-4-还原酶基因(NsDFR)和花青素合成酶基因(NsANS)序列的克隆，依次通过以下步骤得到：1)采用SV Total RNA isolation System试剂盒(Promega，Z3100)提取Nemesia strumosa KLM花组织的总RNA，使用Fermantas公司的K1621试剂盒将提取的总RNA进行反转录合成cDNA。

2)根据NCBI网站Genbank中菊亚类各科植物、特别是相近的类群：如玄参科、唇形科物种的查尔酮合成酶基因、黄烷酮3-羟化酶基因、类黄酮-3'-羟化酶基因、类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因、二氢黄酮醇-4-还原酶基因和花青素合成酶基因的保守区域，分别设计其简并引物，用上述获得的cDNA作为模板、设计的简并引物进行普通的PCR扩增(由于是简并引物，所以退火温度设定为50℃)，先将扩增得到的PCR产物3μL进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，看完扩增结果后，再次将剩余的PCR产物进行2.0％的琼脂糖凝胶电泳，用于割胶回收。将符合基因片段大小(初步估计，相近条带都割)的条带采用北京鼎国割胶纯化试剂盒回收目的DNA片段，连接到T克隆载体pMD19-T simple vector(北京全式金公司)上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定后，送去华大基因公司(北京)进行测序。将测序得到的原始序列，在NCBI网站中的blastn进行搜索，如果出现的比对结果是其他物种的同源基因，则证明提取的目的基因正确。该PCR扩增得到的基因片段具有序列表中所示核苷酸。

上述基因片段采用信息分析的方法预测基因结构及编码的氨基酸序列。

附图说明

图1为NsCHS基因PCR电泳图，M：TAKARA DL2000；1：NsCHS基因片段扩增；

图2为NsF3H基因PCR电泳图，M：TAKARA DL 2000；1：NsF3H基因片段扩增；

图3为NsF3′H基因PCR电泳图，M：TAKARA DL 2000；1：NsF3′H基因片段扩增；

图4为NsF3′5′H基因PCR电泳图，M：TAKARA DL 2000；1：NsF3′5′H基因片段扩增；

图5为NsDFR基因PCR电泳图，M：TAKARA DL 2000；1：NsDFR基因片段扩增；

图6为NsANS基因PCR电泳图，M：TAKARA DL 2000；1：NsANS基因片段扩增。

有益效果：

本发明提供的花青素生物合成途径六个关键酶基因：查尔酮合成酶基因(NsCHS)、黄烷酮3-羟化酶基因(NsF3H)、类黄酮-3'-羟化酶基因(NsF3’H)、类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因(NsF3’5’H)、二氢黄酮醇-4-还原酶基因(NsDFR)和花青素合成酶基因(NsANS)，可通过构建过表达或反义转基因表达载体，分别将其导入Nemesia strumosa KLM中，改变Nemesia strumosa中花青素的含量，间接改良Nemesia strumosa的品质，促进花青素物质的开发利用。

具体实施方式

实施例1：

Nemesia strumosa KLM查尔酮合成酶基因(NsCHS)、黄烷酮3-羟化酶基因(NsF3H)、类黄酮-3'-羟化酶基因(NsF3’H)、类黄酮-3',5'-羟基化酶基因(NsF3’5’H)、二氢黄酮醇-4-还原酶基因(NsDFR)和花青素合成酶基因(NsANS)片段的克隆。

1)以Nemesia strumosa KLM为材料，提取花组织的总RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA；

2)根据NCBI网站Genbank中菊亚类各科植物的查尔酮合成酶基因、黄烷酮3-羟化酶基因、类黄酮-3'-羟化酶基因、类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因、二氢黄酮醇-4-还原酶基因和花青素合成酶基因的同源基因作为参考序列，特别是相近的如玄参科、唇形科物种的同源基因，分别设计简并引物，以上述cDNA为模板，扩增得到基因片段，连接到T克隆载体PMD19-T simple vector上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序。简并引物序列如下：

CHS-F：5′-AAAGCNATHAARGARTGGG-3′

CHS-R：5′-ACRCANGCRCTBGACATRTT-3′

F3H-F：5′-TGTGARGANTGGGGBATTTT-3′

F3H-R：5′-TTRAACCKCCCRTTGCTC-3′

F3′H-F：5′-GAAATYAAAGCNTTGCT-3′

F3′H-R：5′-GTNAGCCCATANGCTTC-3′

F3′5′H-F：5′-AATGCHGGTGCCACYCAC-3′

F3′5′H-R：5′-GCCCAYTCTATTRTGCTNG-3′

DFR-F：5′-AGAATGAAGTGATHAARCC-3′

DFR-R：5′-CATGWGARGARCAWATGTA-3′

ANS-F：5′-GAGTGGGGYGTHATGCAYCT-3′

ANS-R：5′-CACAGAAAACMGCCCAWG-3′

步骤1)提取总RNA的Nemesia strumosa KLM也可用Nemesia strumosa其它品种或玄参科其它物种材料，也可以扩增得到同源序列。