家蚕生殖腺特异表达的启动子及其捕获方法与流程

本发明涉及一种家蚕生殖腺特异表达的启动子及其捕获方法。

背景技术：

家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表，也是重要的经济昆虫。自2003年家蚕全基因组序列测定以来，国内外围绕蚕丝蛋白合成、分子免疫和变态发育等研究也全面深入到基因鉴定与功能分析领域，同时也推动了转基因技术和基因组编辑系统在家蚕中的应用。近几年来，随着基因敲出、基因敲入和过表达等基因组编辑的技术发展，越来越多的启动子被用来作为研究基因功能工具。尽管有关家蚕丝腺反应器及家蚕变态发育相关的研究已取得丰富积累，但从遗传发育方面来看，目前在家蚕性别决定及生殖细胞发育等方面却知之甚少，特别是关于昆虫生殖腺发育的启动子研究较少；据报道果蝇中一种锌脂转录因子nanos具有维持生殖细胞的自我更新和分化的功能，并且该启动子能在生殖腺中特异表达，具有组织特异性；而在家蚕中尚未有相关启动子的报道。因此，获得一种能够在生殖腺特异表达的启动子对家蚕遗传发育的研究具有重要的作用。

随着转基因技术在家蚕中的应用越来越广泛，家蚕启动子的研究也越来越受到人们的关注。例如，家蚕npv病毒的ie1启动子能够促进piggybac转座酶的效力，被广泛的用于转基因的研究中。tsubota等克隆了热激蛋白hsp90，其研究结果表明：该启动子能够在家蚕的大多数组织中表达，没有时期特异性；除此之外，组织特异性启动子也被应用于转基因和基因组编辑当中，促进了家蚕经济学效应，也为鳞翅目其他害虫的防治奠定了基础。如郭杨秀等克隆了丝胶启动子并利用重组杆状病毒表达系统来研究丝腺的分泌方式，结果表明所克隆的启动子能够驱动egfp在丝腺中特异表达；berghammer等克隆了3xp3的启动子，研究表明它能够被用来驱动中枢神经系统的相关基因的表达，并且在家蚕胚胎发育第五天后即可观察到基因的表达，经常被用来作为转基因阳性个体筛选的标记；杨从文等人通过构建不同长度的卵黄原蛋白vg启动子，从而获得能在蛹期特异表达的vg核心启动子序列，为家蚕蛹生物反应器高效表达外源基因基因奠定了基础；目前，尽管家蚕中枢神经系统、丝腺等发育的分子调控研究取得了许多突破性的进展，但关于家蚕生殖细胞发育相关基因及其启动子的研究则相对较少。例如，近年来，许军等克隆了β4蛋白的启动子，β4作为一种精巢特异调控元件对害虫防治方面，特别是昆虫雄性不育技术（sit）具有应用潜能。然而，现阶段仍未找到一种对环境无害、有效的害虫防治新方法，因此，从害虫的遗传调控方面来进行害虫防治也得到了许多科学家的关注。

nanos作为一种锌脂蛋白转录因子，对果蝇及其他昆虫的生殖细胞的发育都起到了重要调控作用，同时nanos也会影响生殖细胞的自我更新以及体细胞的分化。hayashi和losick等通过分析影响果蝇生殖细胞的自我更新和分化的因子，研究结果显示：nanos在果蝇的生殖腺中特异表达，并且能够抑制生殖细胞的分化；随后，在果蝇和小鼠等一些研究中也陆续报道了利用nanos启动子来优化基因组编辑的方法；然而，nanos在家蚕的报道确实少之又少，nakao等在家蚕中克隆了四个nanos蛋白，分别为：nanoso、nanosp、nanosm、nanosn；其中nanoso、nanosp能在生殖腺中特异表达，家蚕中也尚未发现即能在生殖腺中特异表达的启动子。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种家蚕生殖腺特异表达的启动子。

本发明的目的之二在于提供该启动子的捕获方法。

本发明主要是利用转基因和显微注射的平台，通过家蚕胚胎荧光检测方法获得阳性个体，在通过体外的细胞转染和活体实验来获得生殖腺特异表达的启动子nosp。

一种家蚕生殖腺特异表达的启动子，其特征在于该启动子为seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示的碱基序列。

一种载体，其特征在于该载体含有上述的启动子。

一种克隆上述的家蚕生殖腺特异表达的启动子的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

（1）阅读文献，捕获基因；参照果蝇、小鼠、斑马鱼等模式生物中已报到的生殖腺特异表达的基因，定位到nanos基因；对该基因进行系统进化树及保守性分析；

（2）网上查找家蚕生殖腺特异启动子bmnosp的基因序列，并从该基因转录起始位点上游截取0.6k、1k、2k的片段，设计引物，分别利用nosp^p0.6kbf/r、nosp^p1kbf/r、nosp^p2kbf/r进行pcr扩增；参见图5；

（3）切胶回收，并把三段序列连接到pjet1.2载体上；

（4）测序，并得到序列正确的三个片段。

本发明的家蚕生殖腺特异表达的启动子对家蚕的基因组编辑技术的发展有着重要的作用，同时，该启动子的发现给鳞翅目害虫的防治奠定了基础。从而提高转基因家蚕的遗传稳定性。除此之外，本发明也为其他害虫的启动子构建打下了基础，为害虫防治提供了新的思路。

本发明的优点在于：本发明突破了传统的转基因家蚕的遗传稳定性不高和生殖腺特异启动子缺乏的障碍，首次开发和利用家蚕nosp启动子，利用细胞转染和转基因技术分别在家蚕细胞系和活体中表达外源基因，成功的实现了外源基因在生殖腺中特异表达。该启动子的获得不仅解决了家蚕生殖腺特异启动子缺乏的问题，也进一步推动了家蚕基因组编辑技术的发展；从应用的角度来看，首先它使得转基因家蚕的遗传稳定性得以保持；其次，在害虫的遗传控制中，也可以利用该启动子的组织特异性来寻找一种对环境友好的害虫防治新方法；最后，它也为蚕丝产业的发展奠定了一定的基础。

附图说明

图1为家蚕nosp转基因质粒构建及细胞转染实验。a：三个转基因质粒分别代表三个不同片段的启动子，其大小分别为：0.6kb、1kb、2kb；b：四个转基因质粒转染后，pxl-bacii-ie1-dsred-nosp^p2kb-egfp质粒的绿色荧光蛋白表达相对其他要要高一些。white、dsred、egfp分别代表白光、红色荧光、绿色荧光。

图2为家蚕nosp转基因阳性个体。

图3为pxl-bacii-ie1-dsred-nosp^p2kb-egfp质粒在家蚕胚胎后期时表达；图中1、2代表野生型个体，3、4、5、6均代表阳性个体，图下方的电泳所用的条带则为w染色体上的一段片段。

图4为家蚕l3d2时期荧光蛋白的表达。

图5为家蚕克隆nosp基因启动子及构建转基因质粒的引物。

具体实施方式

实施例一：nosp基因启动子的捕获，其具体方法如下：

从果蝇、小鼠等已报到的生殖腺特异表达基因来查找家蚕中相对应的基因，根据保守性分析，我们选择了nanos基因；在家蚕的数据库中，我们发现了四个nanos蛋白，且nanosp有生殖腺表达的特异性；随后，网上查找家蚕生殖腺特异启动子bmnosp的基因序列，并从该基因转录起始位点上游截取0.6k、1k、2k的片段，设计引物，分别利用nosp^p0.6kbf/r、nosp^p1kbf/r、nosp^p2kbf/r进行pcr扩增；参见图5。

实施例二：利用家蚕调控生殖细胞发育启动子nosp表达外源基因，其主要的实验内容如下：

1.载体的构建：本发明所用的pxl-bacii-ie1-dsred注射转座子是由piggybac衍生来的。家蚕nosp启动子序列分别来自nanosp基因上游0.6kb、1kb、2kb的序列，通过分段全基因合成法获得，并克隆在pjet载体上。首先用含有apai的特异性引物egfp-f（5′-atgttcagatccaagggccgccaccatggtgagcaagg-3′）和egfp-r（5′-tcgacctcgaggggttcgtacgcgtatcgataagctttaa-3′）用kod酶扩增egfp连接到pjet载体上，获得测序正确的pjet-egfp；用apai酶切pxl-bacii-ie1-dsred4h后和egfp同源重组得到pxl-bacii-ie1-dsred-egfp载体；其次，利用同源重组引物nosp^p2kb-egfp-f和nosp^p2kb-egfp-r从pjet-nosp^p2kb上扩增得到nosp^p2kb片段，将该片段插入到用knapi酶切的pxl-bacii-ie1-dsred-egfp载体上；通过测序验证最终获得pxl-bacii-ie1-dsred-nosp^p2kb-egfp载体；最后，根据图5所示的引物，利用同样的方法分别获得pxl-bacii-ie1-dsred-nosp^p0.6kb-egfp和pxl-bacii-ie1-dsred-nosp^p1kb-egfp质粒。

（2）bmn细胞的检测

把构建好的三种不同片段的转基因质粒转入家蚕卵巢细胞bmn中，观察绿色荧光蛋白egfp的表达情况，转染结果显示：与阳性对照pxl-bacii-ie1-dsred相比，三个片段的转基因载体在卵巢细胞中都能表达，且由2kb片段构建的质粒驱动效果最佳，绿色荧光蛋白的表达更明显一些。在转染中所用的试剂是由照qiagen公司生产的effectenetransfectionreagentkit试剂盒提供的，具体的操作方法如下所示：

首先，进行细胞培养（在24孔板中选取15孔加入400ul的bmn细胞，其中分为5组，一组作为空白对照，三组实验组，还有一组为阴性对照，每组三个重复，隔夜培养）和质粒准备（将转染质粒pxl-bacii-ie1-dsred、pxl-bacii-ie1-dsred-nosp^p0.6kb-egfp、pxl-bacii-ie1-dsred-nosp^p1kb-egfp、pxl-bacii-ie1-dsred-nosp^p2kb-egfp纯化后，稀释至浓度200ng/ul）。其次，进行细胞转染：分别取70ul的ec加入到1.5ml的ep管中；再取7.5ul的质粒加入，混匀；加入12ul的enhance，混匀，静置4min；加入15ul的effectance,混匀，静置10min，（期间将24孔板中的培养液吸去）；然后加900ul的小牛血清培育基到ep管中，混合后，分别加到3个孔中，密封；28℃培养箱培养。72小时后，在荧光聚焦显微镜下观察转染结果。

（3）转基因家蚕的获得

本实验参照kanda﹠tamura(1991)中所用的显微注射技术对家蚕的胚胎进行注射，从而获得g1代的转基因个体。其中，pha3pig被用作辅助质粒产生转座酶，注射质粒dna的纯化方法采用qiagen公司的plasmidmidikit试剂盒进行纯化；整个注射包括四个方面：注射前蚕卵的排放及消毒处理，注射后的封口，蚕卵的培养（25℃条件下催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将g0代的蚕蛾自交，获得g1代蚕卵），阳性个体的筛选（在荧光显微镜下从g1代中挑出转基因个体饲养，并对该阳性个体中启动子的表达情况进行检测）。

启动子特异性表达的检测可通过以下方法进行：本发明的目的是验证该启动子具有组织特异性，因此只需检测到外源基因表达具有组织的特异性即可。首先第一步，细胞转染验证构建质粒和启动子是否能正常发挥作用，也可验证三个片段的启动子是否包括了启动该基因的核心序列；其次，通过显微注射获得的g1代阳性个体可验证该质粒在活体内是能正常发挥作用的。通过红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的对比，家蚕各组织绿色荧光蛋白表达的对比，来初步确证该启动子是否具有组织特异性最后，再通过相应的分子生物学手段（rt-pcr、荧光定量pcr等）检测该启动子驱动的绿色荧光蛋白的表达。

实验结果如下：

（1）为了验证bmnosp启动子的活性，我们分别克隆了nanos基因转录起始位点上游0.6kb、1kb、2kb的片段，通过同源重组将启动子序列插入到pxl-bacii-ie1-dsred-egfp载体中得到转基因质粒(附图1)。细胞转染48h后结果表明：三个片段的启动子序列均能驱动egfp的表；其中，2kb长度的启动子驱动的绿色荧光蛋白的表达较强，0.6k（pbac-nosp^p0.6kb-egfp）、1k(pbac-nosp^p1kb-egfp)表达相对较弱。bmn细胞来源于家蚕雌性卵巢，为生殖细胞，所以克隆获得的bmnosp启动子在生殖细胞中具有启动子活性。

（2）为了验证该启动子在活体内的活性，我们把获得的转基因质粒通过显微注射插入到家蚕的基因组中，并获得了阳性的准基因个体(附图2)；与野生型家蚕相比，转基因家蚕在形态、大小、发育、性别等都没有明显差异，插入位点分析结果也表明该转基因质粒没有破坏家蚕基因组中基因的活性。

（3）为了进一步研究bmnosp驱动egfp在家蚕胚胎时期的表达情况，我们解剖了胚胎发育第九天的转基因个体；与对照相比，阳性个体在生殖腺发育处，绿色蛋白表达明显，可初步判断，bmnosp基因的启动子能够驱动外源蛋白在生殖细胞中特异表达；随后的w染色体特异片段的检测表明了绿色荧光的表达没有雌雄特异性(附图3)。

（4）为了深入研究bmnosp驱动egfp在家蚕生长发育时期的表达情况；我们解剖了三龄第二天的家蚕，可以明显看到生殖腺中绿色荧光的表达聚中在精巢和卵巢的前端(附图4)；这一结果和果蝇中报道的nanos基因能够调节生殖细胞的自我更新一致。

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