一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法与流程

文档序号:12411456阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法,其特征在于包括将肠管剪切为10-12cm的肠段,洗脱肠管表面杂质和肠管表面粘液后,以含EDTA和EGTA的消化液B洗脱肠上皮细胞层,再以含Liberase TL和DNase I的消化液C消化;最后以流式细胞仪进行分选得到小鼠肠道固有层原代树突状细胞。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于包括如下步骤:

(1)将肠管平均剪切为4段,每段长10-12cm的肠段,用聚乙烯细管将肠管翻转并用细线结扎固定,使肠管肠上皮细胞层暴露,并浸泡在装有平衡盐溶液B的试管中,并多次摇晃试管、更换平衡盐溶液B以洗脱肠管表面杂质;

(2)将平衡盐溶液B更换为消化液A,摇晃试管以洗脱肠管表面粘液;

(3)将消化液A更换为平衡盐溶液B,使用平衡盐溶液B再次清洗肠管多次,以中和消化液A;

(4)将平衡盐溶液B更换为消化液B,多次摇晃试管、更换新的消化液B,以洗脱肠上皮细胞层;所述的消化液B为含25-35mM EDTA及25-35mM EGTA的不含钙镁离子的PBS;

(5)将消化液B更换为平衡盐溶液B,使用平衡盐溶液B再次清洗肠管多次,以中和消化液B;

(6)将肠管自试管中取出,放入无菌平板培养皿中,加入消化液C,放入细胞培养箱,37℃、5%CO2消化80分钟后取出;消化液C为含10%FBS的DMEM培养基+Liberase TL+DNase I,其中Liberase TL终浓度:0.1-0.2mg/ml,DNase I终浓度:150-250U/ml;

(7)用移液枪轻柔吹打试管表面数次,将培养液经100um滤网过滤后,于4℃条件下离心1600rpm、5分钟,收集沉淀;

(8)用1ml稀释后抗体混悬步骤(7)所得细胞团,室温下离心3000rpm、3分钟,收集沉淀即得所述的固有层原代树突状细胞;所述的抗体选自DAPI、CD11c、MHC-II、CD103或CD11b中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述的平衡盐溶液B为不含钙镁离子的PBS。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述的消化液A为含1mM DTT的不含钙镁离子的PBS。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述的消化液B为含30mM EDTA及30mM EGTA的不含钙镁离子的PBS。

6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述的消化液C中Liberase TL终浓度为0.167mg/ml,DNase I终浓度为200U/ml。

7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于步骤(8)中以流式缓冲液稀释抗体,抗体的稀释比为1:100。

8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于所述的流式缓冲液为含钙镁离子的PBS+5%FBS。

9.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于流式细胞仪分选时设置DAPI-CD11c+MHCII+即可得到固有层树突状细胞;或在此基础上,同时加做CD103或CD11b染色以行树突状细胞亚群分选或分析。

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