本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种人母乳干细胞的制备方法及其应用。
背景技术：
干细胞是指那些具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下分化成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。利用干细胞移植受损组织，可使组织恢复再生能力，修复其功能，干细胞替代疗法为治疗各种疾病和组织损伤带来了巨大的希望。干细胞存在于胚胎、成熟机体组织、血液中，近年来研究发现，人母乳中也含有干细胞成分，母乳干细胞表现出类似人胚胎干细胞的多向分化潜能，可表达多种多能性基因，如OCT4、SOX2、NANOG等，这些基因对于维持细胞未分化状态和多能性有着非常重要的作用。人母乳干细胞具有很多天然优势：可通过无创方式获取，哺乳期女性均可提供，来源丰富。因此，人母乳干细胞可作为细胞替代疗法稳定且丰富的来源。
目前关于人母乳干细胞制备方法的文献资料较少，尚未有公知的获得认可的标准化制备方法。根据目前的文献报道，人母乳干细胞的培养多采用添加10%-20%胎牛血清的DMEM或RPMI培养基，在此基础上，有些研究学者添加了胰岛素、表皮生长因子等物质，有些研究学者添加了饲养层细胞。然而，胰岛素、表皮生长因子等物质对于维持人母乳干细胞的未分化状态没有起到非常好的效果，饲养层细胞培养较前者而言可以稍好地维持人母乳干细胞的未分化状态，但是实验步骤较为繁琐且需要花费较多的时间。因此，急需寻找一种操作简便且能较好地维持人母乳干细胞未分化状态的制备方法。
技术实现要素：
针对以上技术问题，本发明公开了一种人母乳干细胞的制备方法及其应用，操作简便，无需采用饲养层细胞共培养。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种人母乳干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
步骤S1：采集母乳；
步骤S2：分离人母乳细胞，得到纯化后的母乳细胞悬液；
步骤S3：将纯化后的母乳细胞悬液转移到包被体积百分比为0.01-0.05% 的明胶的培养板中，置于CO2培养箱中培养，每天换液1次，第6天分离单个细胞克隆并接种到新的培养板中，促进克隆形成；优选的，所述培养板为市售的超低粘附培养板；
步骤S4：当细胞融合至80%（细胞融合数量的百分数）以上时，添加胰蛋白酶，胰蛋白酶覆盖细胞表面即可，37℃消化5min，用2倍体积含10%（体积百分比）胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1000rpm离心10min，收集细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤1次，1000rpm离心10min，用新鲜的细胞培养液重悬细胞，按1:3传代。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中，所述细胞培养液的成分为：含10%（体积百分比，下同）KOSR（knockout serum replacement，血清替代物）、10 -20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10-20 ng/mL 表皮细胞生长因子、100-300 U/mL白血病抑制因子、含有0.1-0.5μmol/mL视黄醇的DMEM/F12培养基。
作为本发明的进一步改进，所述细胞培养液的成分为：含10%KOSR、12-15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、12-18 ng/mL 表皮细胞生长因子、150-250 U/mL白血病抑制因子、含有0.2-0.4μmol/mL视黄醇的DMEM/F12培养基。
作为本发明的进一步改进，所述细胞培养液的成分为：含10%KOSR、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/mL 表皮细胞生长因子、100 U/mL白血病抑制因子、含有0.5μmol/mL视黄醇的DMEM/F12培养基。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，在采集母乳之前，检测供者ABO/Rh血型、HLA分型及梅毒、HIV、HBV、HCV，然后在无菌条件下采集供者的母乳5-200mL。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中，所述分离人母乳细胞包括：将母乳和等体积的PBS缓冲液混合，4℃下1500-2000rpm下进行离心分离，吸除脂肪层和脱脂母乳成分。
作为本发明的进一步改进，余下的细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤3次，每次1000-2000rpm离心5-15min，用新鲜培养液重悬细胞沉淀，得到纯化后的母乳细胞悬液。其中，所述新鲜培养液为新鲜配置的培养液，可以为本领域常用的培养液。所述新鲜培养液可以为含10% （体积百分比）胎牛血清的DMEM培养基。
作为本发明的进一步改进，所述将母乳和等体积的PBS缓冲液混合，4℃下于2000rpm下进行离心分离20min，吸除脂肪层和脱脂母乳成分。
作为本发明的进一步改进，余下的细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤3次，每次1500rpm离心10min，用新鲜培养液重悬细胞沉淀，得到纯化后的母乳细胞悬液。其中，所述新鲜培养液为新鲜配置的培养液，可以为本领域常用的培养液。所述新鲜培养液可以为含10% （体积百分比）胎牛血清的DMEM培养基。
作为本发明的进一步改进，将纯化后的母乳细胞悬液转移到包被0.01-0.05% 明胶培养板前，所述明胶培养板提前包被1h，并用细胞培养前用PBS洗涤至少2次。
作为本发明的进一步改进，所述明胶培养板的包被明胶的体积百分比为 0.01%。
本发明还公开了一种人母乳干细胞的应用，所述人母乳干细胞采用如上任意一项所述的人母乳干细胞的制备方法制备得到，其应用于细胞替代治疗，促进人体组织修复中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，操作简便，无需采用饲养层细胞共培养，而且可以更好的维持人母乳干细胞未分化状态，且获得的人母乳干细胞数量更多。
附图说明
图1是本发明实施例1培养第20天的人母乳干细胞经流式细胞术鉴定的结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。应当理解，以下所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种人母乳干细胞的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1. 采集母乳
人母乳的采集：采集母乳之前，检测供者ABO/Rh血型、HLA分型及梅毒、HIV、HBV、HCV，然后在无菌条件下采集供者的母乳5-200mL，立即送往实验室进行人母乳干细胞的制备。
2.分离人母乳细胞
将母乳和等体积的PBS缓冲液混合，4℃下2000rpm离心20min，吸除脂肪层和脱脂母乳成分，余下的细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤3次，每次1500rpm离心10min，用新鲜的培养液重悬细胞沉淀，收获纯化后的母乳细胞悬液。
3.培养人母乳干细胞
将纯化后的母乳细胞悬液转移到包被0.01%明胶的培养板中，所述包被0.01%明胶的培养板提前包被1h，细胞培养前用PBS洗涤2次；然后置于CO2培养箱中培养，每天换液1次，第6天分离单个细胞克隆并接种到新的超低粘附培养板中，促进克隆形成。当细胞融合至80%以上时，添加适量0.25%胰蛋白酶，胰蛋白酶覆盖细胞表面即可，37℃消化5min，用2倍体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1000rpm离心10min，收集细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤1次，1000rpm离心10min，用新鲜细胞培养液重悬细胞，按1:3传代。
所述细胞培养液为含10%KOSR、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/mL 表皮细胞生长因子（EGF）、100U/mL白血病抑制因子(LIF)、0.5μmol/mL视黄醇的DMEM/F12培养基。
经流式细胞术鉴定培养第20天的人母乳干细胞，如图1所示，结果显示SOX2、NANOG、OCT4呈高表达，阳性比例分别为72%、70%、53%。说明采用本专利方法培养的人母乳干细胞纯度高。
实施例2
在实施例1的基础上，所述培养人母乳干细胞的步骤有所不同，具体如下：
将纯化后的母乳细胞悬液转移到包被0.01%明胶的培养板中，所述包被0.01%明胶的培养板提前包被1h，细胞培养前用PBS洗涤2次，然后置于CO2培养箱中培养，每天换液1次，第6天分离单个细胞克隆并接种到新的超低粘附培养板中，促进克隆形成。当细胞融合至80%以上时，添加适量0.25%胰蛋白酶，胰蛋白酶覆盖细胞表面即可，37℃消化5min，用2倍体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1000rpm离心10min，收集细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤1次，1000rpm离心10min，用新鲜细胞培养液重悬细胞，按1:3传代。
所述细胞培养液为含10%KOSR、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10ng/mL 表皮细胞生长因子（EGF）、300 U/mL白血病抑制因子(LIF)、0.1μmol/mL视黄醇的DMEM/F12培养基。
经流式细胞术鉴定培养第20天的人母乳干细胞，结果显示SOX2、NANOG、OCT4呈高表达，阳性比例分别为65%、66%、42%。说明采用本专利方法培养的人母乳干细胞纯度高。
对比例1
本例与实施例的不同在于，所述培养人母乳干细胞的步骤有所不同，其采用常规方法，具体如下：
将纯化后的母乳细胞悬液以5×104/cm2的细胞密度转移到铺有鼠胚胎成纤维细胞(MEFs，接种密度5×104/cm2)的培养皿中，置于CO2培养箱中培养，隔天半量换液1次，1周后每天换液1次，当细胞融合至80%以上时，添加适量0.25%胰蛋白酶，胰蛋白酶覆盖细胞表面即可，37℃消化5min，用2倍体积含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，1000rpm离心10min，收集细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤1次，1000rpm离心10min，用新鲜细胞培养液重悬细胞，按1:3传代。
所述细胞培养液为含10%自体血浆或胎牛血清、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10ng/mL 表皮细胞生长因子（EGF）、5μg/mL胰岛素RPMI1640培养基。
经流式细胞术鉴定培养第20天的人母乳干细胞，结果显示SOX2、NANOG、OCT4阳性比例分别为55%、62%、40%。与实施例1和实施例2对比可见，采用实施例1和实施例2的方法得到的人母乳干细胞人母乳干细胞的纯度更高，可以更好的维持人母乳干细胞未分化状态。
实施例3
对实施例1和对比实施例进行人母乳干细胞增殖活性测试，具体过程如下：
将实施例1和对比例1的人母乳干细胞在培养第20天时，在倒置显微镜下取6个视野(200×)，计数未分化细胞数量，实施例1的方法制备的人母乳干细胞数量为9.17±0.75，采用对比例1的方法制备的人母乳干细胞数量为4.17±0.75，所以，实施例1制备的人母乳干细胞数量明显高于常规方法制备的母乳干细胞。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。