本发明涉及杂交瘤细胞株QW8#及其产生的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体。
背景技术：
拟除虫菊酯是一类低毒、高效、低残留的广谱性杀虫剂。传统的拟除虫菊酯类农药属于羧酸酯化合物，分为Ⅰ型和Ⅱ型两大类。Ⅰ型拟除虫菊酯主要包括氯菊酯、苯醚菊酯、生物苄呋菊酯、联苯菊酯等，Ⅱ型拟除虫菊酯主要包括氰戊菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、苯醚氰菊酯、氟氯氢菊酯等。长期低剂量的接触拟除虫菊酯类杀虫剂会引起慢性疾病，有的具有免疫系统毒性和心血管毒性等，而且拟除虫菊酯是一种神经毒剂，会改变神经膜的通透性，影响神经传导从而导致中毒症状，另外其对脑组织生物膜、神经生理学、神经信号转导以及神经递质等方面均有一定的影响。然而，由于拟除虫菊酯的高效及光谱性，其占全球杀虫剂市场的30％，其中95％以上用于农业病虫害的防治，主要用于粮食、蔬菜、茶叶、水果、棉花，少数用于畜禽、公共和家庭卫生害虫的防治，大量广泛的使用难免造成农药残留。因此研究环境以及农产品、食品中痕量拟除虫菊酯杀虫剂的检测方法具有重要的意义。
现有拟除虫菊酯农药的检测方法主要分为仪器分析法和酶联免疫分析法。仪器分析法是借助大型精密仪器对拟除虫菊酯进行精确定量检测。主要包括:液相色谱法、气相色谱法、气质联用和液质联用等，该类方法灵敏度高，准确性高等优点，但是其所需的仪器设备昂贵，前处理复杂，限制了其在农药残留现场筛查及检测的大规模推广应用。由于大型仪器分析的局限性，免疫分析被广泛的应用于拟除虫菊酯的定量检测中。该方法将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应高度专一性、特异性相结合，具有简单、快速、灵敏度高等优点，适于现场批量检测等。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对拟除虫菊酯农药的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得抗拟除虫菊酯农药的抗体。
技术实现要素：
本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株QW8#及其产生的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体。
本发明提供了杂交瘤细胞株QW8#，该细胞株已于2016年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C2016164。其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的抗Ⅰ型拟除虫菊酯单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO:2所示的抗Ⅰ型拟除虫菊酯单克隆抗体可变区编码基因序列。
抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C2016164的杂交瘤细胞株QW8#分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。该抗Ⅰ型拟除虫菊酯单克隆抗体可以广谱识别Ⅰ型拟除虫菊酯，对醚菊酯的50％抑制浓度IC50为20.86μg/L，对氯菊酯的50％抑制浓度IC50为24.2μg/L，对苯醚菊酯的50％抑制浓度IC50为29.4μg/L。
抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体在Ⅰ型拟除虫菊酯的多残留测定中的应用。
本发明所提供的杂交瘤细胞株QW8#是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将原料3-苯氧基苄醇与丁二酸酐反应生成Ⅰ型拟除虫菊酯通用半抗原4-氧代-4-(3-苯氧基苄氧基)丁酸，然后通过活泼酯法与载体蛋白进行偶联，得到完全抗原Hapten-1-BSA。用其免疫BALB/c小鼠4-6次，最后一次加强免疫用2倍于前一次免疫剂量的Hapten-1-BSA，免疫3天后进行细胞融合。采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步利用间接非竞争ELISA，筛选出识别二苯醚结构但不识别载体蛋白(BSA)的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行梯度筛选，采用醚菊酯作为竞争原，选择吸光值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株QW8#。
本发明提供的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株QW8#注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体。
按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：将腹水从-20℃冰箱拿出室温解冻。腹水用双层滤纸过滤初步除去脂肪片、细胞碎片及其他杂质。12000r/min，离心15min，取上清，弃沉淀。精确量腹水体积。取一份体积的腹水与3份体积的醋酸盐缓冲液磁力搅拌混匀，用2mol/L HCl调pH至4.5-4.8。在磁力搅拌下缓慢加入正辛酸，每1mL腹水加33μL正辛酸，加完后室温磁力搅拌半小时，后置4℃静置2h。然后12000r/min，离心5min，取上清，双层滤纸过滤，收集滤液。量取滤液体积，加入1/10体积的0.1M pH＝7.4的PBS，用2mol/L NaOH(记录NaOH体积)调pH至7.4。将上清冰浴预冷，加硫酸铵固体至0.277g/mL，边加边搅拌，并于30min内加完，置4℃过夜。之后12000r/min，离心上述液体15min，弃上清。用一定体积的0.01mol/L PBS溶解沉淀。0.01mol/LPBS透析两天。收集透析液，12000r/min，离心15min，取上清，置-20℃预冻后真空冻干成粉保存。
醋酸盐缓冲液：0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至100mL；
0.1mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液：0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的杂交瘤细胞株QW8#可以用于制备高效价抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体，抗Ⅰ型拟除虫菊酯小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的亲和力可达8.5×108L/moL。
(2)本发明提供的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对醚菊酯的50％抑制浓度IC50为20.86μg/L，对氯菊酯的50％抑制浓度IC50为24.2μg/L，对苯醚菊酯的50％抑制浓度IC50为29.4μg/L，对其他Ⅰ型和Ⅱ型拟除虫菊酯菊酯的交叉反应率均小于1％；
(3)本发明提供的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体可应用于测定Ⅰ型拟除虫菊酯含量。
附图说明
图1为Ⅰ型拟除虫菊酯通用半抗原4-氧代-4-(3-苯氧基苄氧基)丁酸的合成路线图。
具体实施方式
实施例1：杂交瘤细胞株QW8#的筛选
1.抗原合成及动物免疫
购买市售3-苯氧基苄醇标准品进行完全抗原合成，具体的合成步骤如下：将4mg 3-苯氧基苄醇溶于2mL氯仿，加入50μL丁二酸酐，混合物在室温下搅拌反应过夜；产物蒸干后用乙酸乙酯萃取2次，得有机层，旋转蒸干，得产物Hapten-1(图1)。
取1.0mg Hapten-1溶于800μL DMF中，再分别加入0.2mmol的DCC及0.3mmol的NHS，搅拌反应过夜，将混合物逐滴加入4mL 10mg/mL的BSA溶液中，室温反应4h；4℃条件下，PBS溶液(磷酸盐缓冲液，pH 7.4)透析3d，除去3-苯氧基苄醇及过量的Hapten-1，最后进行常规紫外扫描法鉴定，鉴定结果表明制备得到了通用Ⅰ型拟除虫菊酯完全抗原Hapten-1-BSA。
购买同一批次的6～8周龄BaLb/c雌性小鼠，进行编号。饲养几天确定小鼠没有异常，利用合成的完全抗原Hapten-1-BSA进行免疫。免疫剂量为100μg/只，初次免疫选择弗氏完全佐剂乳化，进行颈背部皮下多点注射免疫，初免间隔4周，以后间隔三周进行2、3、4次免疫，使用弗氏不完全佐剂。前3次每次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价。第4次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，融合前3天取200μg免疫原溶于200μL生理盐水直接进行腹腔注射，无需乳化。
醚菊酯、氯菊酯、苯醚菊酯购于Sigma-Aldrich公司。
2.细胞融合
最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤如下：
颈椎脱臼法处死免疫小鼠，在无菌条件下取脾脏，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，然后用50％PEG融合，融合时间1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用72mL RPMI-1640基础培养液重悬，将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述RPMI-1640基础培养液为含有20％(体积百分数)胎牛血清，2％(重量百分数)生长因子和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷。
上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)购于Sigma-Aldrich公司。
3.细胞株的筛选及克隆
为了筛选到目标阳性杂交瘤细胞株-特异性强、灵敏度高的抗含二苯醚结构的拟除虫菊酯细胞株(用醚菊酯标准品进行筛选)，本实验对传统的常规两步筛选法进行了改进，在间接竞争ELISA筛选过程中采用梯度筛选法：(1)第一步利用间接非竞争ELISA，筛选出识别二苯醚结构但不识别载体蛋白(BSA)的阳性孔。(2)第二步利用间接竞争ELISA采用梯度筛选法，初次亚克隆后的检测使用5μg/mL的醚菊酯标准品，第二次亚克隆后检测加入2μg/mL的醚菊酯标准品，第三次亚克隆加入1μg/mL的醚菊酯标准品。从阳性孔中选择B/B0相对较小的。其中，B为不加醚菊酯标准品的对照吸光值，B0为加醚菊酯标准品的吸光值。采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株3G1。
实施例2：抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体杂交瘤细胞株系QW8#抗体可变区序列测定
(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株QW8#的总RNA；
(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScriptTM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；
(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以CDNA为模版扩增抗体重链、轻链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、55℃50s、70℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接在载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至苏州泓迅生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGG-3’(31mer)和5’-CAGGGGCCAGTGGATAGACAG-3’(21mer),轻链可变区引物为5’-GCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGG-3’(30mer)和5’-CTAAGCCTGACTGATGGCGAAG-3’(22mer)。
得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长363bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由121个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长327bp,序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由109个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例3：抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定
将实施例2获得的Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体杂交瘤细胞株系QW8#注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：将腹水从-20℃冰箱拿出室温解冻。腹水用双层滤纸过滤初步除去脂肪片、细胞碎片及其他杂质。12000r/min，离心15min，取上清，弃沉淀。精确量腹水体积。取一份体积的腹水与3份体积的醋酸盐缓冲液磁力搅拌混匀，用2mol/L HCL调PH至4.5-4.8。在磁力搅拌下缓慢加入正辛酸，每1mL腹水加33μL正辛酸，加完后室温磁力搅拌半小时，后置4℃静置2h。然后12000r/min，离心5min，取上清，双层滤纸过滤，收集滤液。量取滤液体积，加入1/10体积的0.1M pH＝7.4的PBS,用2mol/L NaOH(记录NaOH体积)调pH至7.4。将上清冰浴预冷，加硫酸铵固体至0.277g/mL，边加边搅拌，并于30min内加完，置4℃过夜。之后12000r/min，离心上述液体15min，弃上清。用一定体积的0.01mol/LPBS溶解沉淀。0.01mol/LPBS透析两天。收集透析液，12000r/min，离心15min，取上清，置-20℃预冻后真空冻干成粉保存。
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。
用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株QW8#分泌的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体的亚型为IgG2a。
利用间接非竞争ELISA测定QW8#的亲和力。用Hapten-1-BSA按2.0、1.0、0.5、0.25μg/mL浓度包被酶标板，100μL/孔，37℃，2h；封闭液封闭1h后，将用PBS稀释好的抗体(稀释因子1：2)加入酶标板，其余步骤同间接非竞争ELISA方法。以测定的OD450值为纵坐标，抗体浓度(mol/L)的对数值为横坐标，做出4个浓度对应的4条S形曲线。找出每条S曲线最顶部的最大OD值即ODmax，找出每条曲线50％ODmax值对应的抗体浓度。将4个浓度两两一组，根据公式Ka＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)计算抗体的亲和力常数，其中[Ab’]t、[Ab]t为每组中两个50％最大OD值对应的抗体浓度，n为每组中包被抗原浓度的倍数。得抗Ⅰ型拟除虫菊酯小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法亲和力可达8.5×108L/moL。用常规间接竞争ELISA法鉴定抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体对醚菊酯的IC50值为20.86μg/L，最低检出限为3.16μg/L；对氯菊酯的IC50值为24.2μg/L，最低检出限为3.72μg/L，对苯醚菊酯的IC50值为29.4μg/L，最低检出限为4.27μg/L。对其他Ⅰ型和Ⅱ型拟除虫菊酯菊酯的交叉反应率均小于1％。
实施例4：抗体应用
将杂交瘤细胞株QW8#分泌的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体用于实际样品检测，对农产品进行加标回收，以验证ELISA方法的可靠性。具体步骤如下：在粉碎混匀的样品中添加醚菊酯标准品至浓度分别为20μg/g、4μg/g、0.8μg/g、0.16μg/g、0.032μg/g、0.0064μg/g、0.00128μg/g、0.000256μg/g，建立基质曲线，研究得出醚菊酯基质曲线和缓冲液建立的标准曲线(缓冲液PBS中加标样品)基本吻合，说明样品基质对ELISA几乎无影响。可以根据醚菊酯标准曲线进行样品中醚菊酯、氯菊酯和苯醚菊酯总量的检测。通过加标回收试验，并通过GC-MS对结果进行验证，证明检测样品中醚菊酯、氯菊酯和苯醚菊酯总量的加标回收率在81％-95％之间，且具有较好的重复性和准确性。
序列表
＜110＞ 中国农业科学院油料作物研究所
＜120＞ 杂交瘤细胞株QW8#及其产生的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体
＜160＞ 4
＜210＞ 1
＜211＞ 363bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 1
caggttactt tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac 50
cctcagtctg acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttatggta 100
taggaatagg ctggattcgt cagtcttcag ggaggggtct ggagtggctg 150
gcacacattt ggtggaatga taataggtac tataacatag ccctgaagag 200
ccggctcaca atctccaagg atgcctccaa caaccagttt ttcctcaagc 250
tcgccagtgt ggacactgca gatattgcca cgtactactg tgttcgcggc 300
tacggccgcc ccttctatgc tatggactac tggggtcaag gaaccacagt 350
caccgtctcc tca 363
＜210＞ 1
＜211＞ 327
＜212＞ DNA
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 2
caggctgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac 50
agtcacactc acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca actagtaact 100
atgtcaactg ggtccaagaa aaaccagatc atttattcac tggtctaata 150
ggtggtacca acaaccgagg tccaggtgtt cctgccagat tctcaggctc 200
cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cactgggaca cagactgagg 250
atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaacca ttgggtgttc 300
ggtggaggaa ccaaactgac tgtccta 327
＜210＞ 1
＜211＞ 121
＜212＞ PRT
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 3
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser 30
Thr Tyr Gly Ile Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Arg 45
Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asn Arg Tyr 60
Tyr Asn Ile Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Ala 75
Ser Asn Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ala Ser Val Asp Thr Ala 90
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Tyr Gly Arg Pro Phe 105
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 120
Ser 121
＜210＞ 1
＜211＞ 109
＜212＞ PRT
＜213＞ 小鼠
＜400＞ 4
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly 15
Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr 30
Thr Ser Asn Tyr Val Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu 45
Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Gly Pro Gly Val 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu 75
Thr Ile Thr Gly Thr Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys 90
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 105
Leu Thr Val Leu 109