用于检测肝癌的核酸适配体及检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种用于检测肝癌的核酸适配体及检测试剂盒。
背景技术：
：核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(selex)筛选得到的，能特异结合靶物质的单链寡聚核苷酸(单链dna或rna)。核酸适体具有与抗体相媲美的亲和力与特异性，而且与抗体相比具有更多的优势，如分子量小，无免疫原性；容易化学合成，成本低；易修饰，且可以对不同部位进行修饰和取代；性质稳定，易于保存等。核酸适体的靶分子更为广泛，包括金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质，并从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。因此，核酸适体具有广泛的应用前景。肝癌是目前发病率及致死率最高的癌症之一，据世界卫生组织统计，2012年全球肝癌新发78.2万例，死亡74.6万例，其中死亡病例数目在所有类型的癌症中排名第二。肝癌主要发生在欠发达地区，特别值得一提的是中国的肝癌发病数约占全球50％，严重危害了国民的身体健康。如果能及早发现、尽早治疗，则癌症的病情往往容易得到控制，降低肝癌发病引起的死亡风险。因此，开发一种更加灵敏、简便、高效和具有特异性的肝癌检测手段，对于肝癌的临床治疗将具有十分重要的意义。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测检测人临床肝癌组织切片的核酸适体及其衍生物，还提供包括前述核酸适配体的检测试剂盒。为解决上述技术问题，提供了一种用于检测肝癌的核酸适配体，所述核酸适配体为核酸适配体sw1，所述核酸适配体sw1的核苷酸序列为seqidno.1所示的dna片段。上述的用于检测肝癌的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体还包括在核酸适配体sw1的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。上述的用于检测肝癌的核酸适配体，优选的，所述氨基化具体为在所述核酸适配体sw1核苷酸序列的5’端标记氨基基团-nh2。上述的用于检测肝癌的核酸适配体，优选的，所述巯基化具体为在所述核酸适配体sw1核苷酸序列的5’端标记巯基基团-sh。上述的用于检测肝癌的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。上述的用于检测肝癌的核酸适配体，优选的，所述荧光物质为fam荧光基团或cy5荧光基团；所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。上述的用于检测肝癌的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种；(1)与所述核酸适配体sw1的核苷酸序列的同源性在60％以上；(2)与所述核酸适配体sw1的核苷酸序列进行杂交的序列；或者(3)所述核酸适配体sw1的核苷酸序列转录的rna序列。上述的用于检测肝癌的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体还包括所述核酸适配体sw1的衍生物，所述衍生物为由所述核酸适配体sw1的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。上述的用于检测肝癌的核酸适配体，优选的，所述核酸适配体还包括所述核酸适配体sw1的衍生物，所述衍生物为由所述核酸适配体sw1改造而成的相应肽核酸。作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了一种用于检测人临床肝癌组织切片的检测试剂盒，包括上述的核酸适配体。进一步优选的，所述检测试剂盒还包括结合缓冲液和洗涤缓冲液。与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明提供了一种用于检测人临床肝癌组织切片的核酸适配体，通过selex筛选得到的核酸适配体与蛋白抗体相比具有更好的亲和力与特异性；免疫原性小；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且化学性质稳定，易于保存；便于标记等特点。(2)本发明提供了一种用于检测人临床肝癌组织切片的核酸适配体的检测试剂盒，由于核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好，采用本发明的核酸适配体进行人临床肝癌组织切片的检测时，操作更为简单、迅速。本发明的可识别人临床肝癌组织切片的核酸适配体结合能力强，解离常数均在纳摩尔范围以内。利用本发明的核酸适配体对其结合的靶分子进行钓取，可能得到其肿瘤标志物，这对于肝癌的早期诊断具有重要意义，在肝癌的诊断方面有良好的应用前景。附图说明为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为本发明实施例1的核酸适配体序列进行二级结构模拟所得的结构示意图。图2为本发明实施例1的核酸适配体对人临床肝癌组织切片的激光共聚焦表征图。图3为本发明实施例1的核酸适配体对固定的肝癌smmc-7721细胞结合效果的流式表征图。图4为流式细胞术测定核酸适配体sw1与多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721细胞的解离常数绘制曲线。图5为本发明实施例1的核酸适配体对多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721细胞结合情况的激光共聚焦表征图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。实施例1一种可用于检测人临床肝癌组织切片的核酸适配体，主要采用以下筛选方法得到：(1)合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物。随机文库lib：5’-atccattgccactgactacc-n40-gaagtcagtcggtcgttagt-3’；5’引物：5’-atccattgccactgactacc-3’；3’引物：5’-actaacgaccgactgacttc-3’。n代表a、t、g、c中任一碱基。(2)通过selex技术筛选人临床肝癌组织切片的核酸适配体(正筛选)。2.1.组织切片的处理：石蜡包埋的肝癌组织切片进行筛选之前先进行常规脱腊至水和抗原修复。然后将组织切片先置于烤箱中于50℃下烘烤30min，随后立马在二甲苯中浸泡2次，每次浸泡15min。接着将组织切片先后在无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、70％乙醇中各浸泡4min；再浸入蒸馏水2次，每次2min；再用pbs浸泡5min。之后进行微波抗原热修复，具体操作为：将组织切片放入盛有ph为6.0的0.01m柠檬酸钠缓冲液的烧杯中，置于微波炉中，调节活力控制烧杯内液体温度在92℃～98℃之间，15min后取出烧杯置于室温下冷却30min。用pbs洗涤组织切片两次后，向组织切片上滴加200μl封闭液(封闭液的制备方法为：在0.01mph为7.4的磷酸缓冲液中加入1mg/mlbsa、0.1mg/ml酵母trna和0.5mg/ml鲑鱼精dna；以下所使用的封闭液均一致)在湿盒中孵育30min，封闭组织对dna的非特异性吸附。2.2.文库预处理：将随机文库lib于12000rmp下离心5min，然后加入适量超纯水，于95下℃加热10min破坏随机文库lib的二级结构后，转移至冰上，然后加入预冷的结合缓冲液(结合缓冲液的制备方法为：0.01mph为7.4的磷酸缓冲液中加入5mmmg2+、1mg/mlbsa、0.1mg/ml酵母trna和0.1mg/ml鲑鱼精dna，以下使用的结合缓冲液均一致)使总体积为100μl得到预处理的文库溶液。2.3.正筛选：将步骤2.2中预处理的文库溶液滴加到步骤2.1中封闭的组织切片表面，置于湿盒中孵育。第一轮筛选的孵育时间为60min，随筛选轮数的增加，孵育时间逐轮递减至30min。孵育后将孵育溶液轻轻用洗涤缓冲液冲(洗涤缓冲液的制备方法为：0.01mph为7.4的磷酸缓冲液中加入5mmmg2+和1mg/mlbsa，以下使用的洗涤缓冲液成分一致)洗掉，重复浸润洗涤三次，去除组织表面未结合的单链dna。用刮刀将玻片表面的组织刮下来收集到ep管中，随后向ep管中加入1ml超纯水。将ep管置于95℃水浴锅中加热10min，之后迅速将ep管于4℃、12000rpm离心10min，上清即为含有ssdna的溶液。将含有ssdna的溶液冷冻保存，待下一步操作。(3)pcr扩增：取100μl由2.3步骤所得的含有ssdna的溶液进行pcr扩增得到扩增产物。扩增条件为：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，经过合适循环轮数(每轮筛选中pcr扩增的轮数都要经过优化，以保证pcr扩增产物的量足够下一轮筛选的同时不至于产生非特异性扩增)，72℃3min。(4)制备dna单链文库：将扩增产物与琼脂糖微球在室温下孵育30min，借助生物素与链霉亲和素之间的特异性结合能力将标记有生物素的扩增产物双链dna被捕获到链霉亲和素修饰的琼脂糖微球表面，得到修饰有扩增产物的琼脂糖微球。随后将修饰有扩增产物的琼脂糖微球于5000rpm离心弃上清，用pbs溶液离心洗涤两次。于洗涤后的沉淀中加入500μl浓度为200mm的naoh溶液，室温下反应15min；然后于5000rpm离心5min，收集上清至ep管中。脱盐柱用10mlddh2o洗涤后，加入ep管中的上清液，待上清液自然滴完后，再往脱盐柱中加入1mlddh2o，收集此时滴下的液体，此中即含有ssdna。(5)重复筛选：将步骤(4)得到的dna单链文库重复上述步骤(2)～(4)过程3次。(6)反筛选：自第四轮筛选开始引入反筛选以提高核酸适配体对肝癌组织的特异性。以癌旁正常肝组织为对照，将步骤(5)重复筛选后得到的dna单链文库进行反筛选，反筛选的具体操作为：石蜡包埋的癌旁正常肝组织切片进行筛选之前先进行常规脱腊至水和抗原修复，随后用pbs洗涤组织两次后，向组织上滴加含有随机序列的封闭液在湿盒中孵育以封闭组织对dna的非特异性吸附。随后将步骤(5)中第四轮筛选得到的dna单链文库溶液滴加到组织切片表面，置于湿盒中孵育；孵育完成后收集组织表面的溶液。(7)多轮筛选：将步骤(6)所收集的溶液染继续进行上述步骤(2)～(4)的过程，然后再一次重复步骤6、步骤2、步骤3、步骤4的过程；重复筛选过程中基于组织免疫荧光技术用激光共聚焦扫描荧光显微镜考察文库对人临床肝癌组织切片的结合情况，直至文库对人临床肝癌组织切片的结合能力满足要求后，将所得文库经测序分析，最终得到可用于检测人临床肝癌组织切片的核酸适配体sw1。在核酸适配体sw1的5’端标记cy5，记为核酸适配体cy5-sw1，其dna片段为：5’-cy5-atccattgccactgactaccagccgggtgggtgggggggtttgctggtatcgcattgtgcgaagtcagtcggtcgttagt-3’。本发明中，核酸适配体sw1的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记，均能达到与实施例1相同或相似的技术效果。对比例1阴性探针，其核苷酸序列为：cy5-random：5’-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’(5’端标记有cy5)。n代表a、t、g、c中任一碱基。考察1：用mfold服务对本实施例核酸适配体序列进行二级结构模拟。用mfold服务对本实施例核酸适配体序列进行二级结构模拟后的结构示意图如图1所示，可见sw1的模拟结构呈明显的茎环结构。考察2：激光共聚焦扫描显微镜检测核酸适配体cy5-sw1和cy5-random对人临床肝癌组织切片的结合情况和特异性。先将石蜡包埋的肝癌组织以及癌旁正常肝组织进行脱蜡至水和抗原修复处理，随后用含有随机探针的封闭液封闭组织对核酸探针的非特异性吸附。然后分别滴加体积100μl浓度为250nm的核酸适配体cy5-sw1和cy5-random与肝癌组织室温孵育半小时，之后用洗涤缓冲液浸润洗涤3次，每次3min。随后滴加100μl浓度为10μg/ml的dapi溶液对细胞核染色，洗涤缓冲液洗涤1次，滴加适量甘油封片剂，盖上盖玻片，置于激光共聚焦荧光显微镜下，检测结果如图2所示(图中的两组图片，一组是cy5荧光通道的成像，一组是cy5荧光通道与细胞核染料dapi荧光通道的叠加成像，是同一个照片不同通道的信息)。同时按照同样的方法将核酸适配体cy5-sw1和cy5-random于正常肝组织进行孵育，作为对照。从图2的检测结果表明：本实施例的核酸适配体cy5-sw1能结合人临床肝癌组织切片，而且不识别癌旁正常肝组织切片。阴性探针(即上述的阴性探针：cy5-random)与靶细胞和对照细胞也均无识别。考察3：流式细胞术检测核酸适配体cy5-sw1和cy5-random对固定的肝癌smmc-7721细胞的结合效果。将生长状态良好的肝癌smmc-7721细胞消化下来，加rimp1640培养基制成细胞悬浮液，调整细胞悬浮液中细胞密度为106个/ml。再加400μl预冷的4％多聚甲醛溶液在4℃下孵育15min，加pbs轻轻吹打，2000rpm离心洗涤3次去除固定液。然后加入200μl的透化液(透化液为0.1％tritonx-100)处理细胞10min，pbs洗涤一次后，加入400μl封闭液处理细胞30min。配置浓度为250nm的核酸适配体cy5-sw1和cy5-random，分别将核酸适配体cy5-sw1和cy5-random与肝癌smmc-7721细胞在室温下避光孵育30min，之后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。加200μl结合缓冲液重悬后用流式细胞仪收集信号，检测结果如图3所示。从图3的检测结果表明：核酸适配体cy5-sw1能与多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721细胞结合，其结合强度明显高于cy5-random与固定的肝癌smmc-7721细胞的结合强度。考察4：流式细胞术测定核酸适配体cy5-sw1与多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721细胞的解离常数。平行配置浓度分别为1000nm，500nm，125nm，62.5nm，15.625nm，4nm，1nm，0.5nm的核酸适配体cy5-sw1的探针溶液。将生长状态良好的肝癌smmc-7721细胞消化下来制成细胞悬浮液，加预冷的4％多聚甲醛溶液在4℃下孵育15min，加pbs轻轻吹打，2000rpm离心洗涤3次去除固定液。细胞经过透化处理以及用封闭液封闭组织的非特异性吸附后，分别取上述不同浓度的核酸适配体cy5-sw1的探针溶液与肝癌smmc-7721细胞在室温下孵育30min，之后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。加200μl结合缓冲液重悬后用流式细胞仪收集信号。实验中每种浓度均设置了三个平行样，收集fl4通道的信号。利用sigmaplot软件，把核酸适配体浓度和净荧光强度的数值代入单点吸附模型由y＝bmax×x/(kd+x)即可模拟核酸适配体的解离常数kd值。解离常数的曲线图如图4所示，由此可得到解离平衡常数kd如下表1所示。表1：解离常数结果序列名kd(nm)sw1123.62±17.53图4及表1的检测结果表明：本实施例的核酸适配体sw1对多聚甲醛固定的smmc-7721细胞的结合能力很强，解离常数在纳摩尔级别。考察5：激光共聚焦扫描显微镜检测核酸适配体cy5-sw1和cy5-random对多聚甲醛固定的肝癌smmc-7721细胞的结合情况。将生长状态良好的肝癌smmc-7721细胞消化下来制成细胞悬浮液，取适量细胞悬浮液移至激光共聚焦专用的培养皿中培养。培养24h左右，至细胞密度适中，状态良好，加入pbs洗涤2次，随后滴加400μl预冷的4％多聚甲醛溶液在4℃下孵育15min，加pbs轻轻吹打后弃洗涤液，重复洗涤3次去除固定剂。加入200μl的透化液处理细胞10min，pbs洗涤一次后，加入400μl封闭液处理细胞30min。随后滴加200μl浓度为250nm的cy5标记的ssdna溶液室温孵育30min，之后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3min。随后滴加100μl浓度为10μg/ml的dapi溶液对细胞核染色，洗涤缓冲液洗涤1次，置于激光共聚焦荧光显微镜下观察，检测结果如图5所示(图中的两组图片，一组是cy5荧光通道的成像，一组是cy5荧光通道与细胞核染料dapi荧光通道的叠加成像，是同一个照片不同通道的信息)。图5的检测结果表明：本实施例的核酸适配体sw1对多聚甲醛固定的smmc-7721细胞有很明显的结合，结合位点位于细胞核，其结合强度明显高于cy5-random与固定的肝癌smmc-7721细胞的结合强度。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。sequencelisting<110>湖南大学<120>用于检测肝癌的核酸适配体及检测试剂盒<130>无<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>80<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(80)<223>根据实验要求而设计，作为用于检测肝癌的核酸适配体sw1。<400>1atccattgccactgactaccagccgggtgggtgggggggtttgctggtatcgcattgtgc60gaagtcagtcggtcgttagt80当前第1页12