一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法与流程

本发明属于微囊藻毒素微生物处理技术领域，具体涉及一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法。

背景技术：

随着现代社会的飞速发展，大量含氮磷的有机物以及工农业废水排入自然水体中，使得水体发生富营养化，导致藻类快速繁殖形成“水华”，蓝藻细胞破裂后向水体中释放出多种毒素。其中微囊藻毒素(microcystin,mc)是一类出现频率最高、造成危害最严重的藻毒素，它不仅会对动植物造成损伤，甚至引发人类肝损伤和肝癌，严重威胁人类的健康。微囊藻毒素的化学性质因其独特的环状结构显得非常稳定，一般的水处理工艺达不到较好的去除效果，一般的多肽酶也不能将其分解。目前，利用微生物降解来去除mcs是相对最有效、安全的方法，微生物降解已成为环境中mcs自然归趋的主要途径之一。

目前已经被证明有降解mcs作用的菌株大部分集中在α-变形菌纲中的sphingomonas和sphingopyxiz这两个属，此外如青枯菌(ralstoniasolanacearum)、食酸戴尔福特菌、伯克霍尔德氏菌，吉氏库特菌，荧光假单胞菌等也被证明有降解作用。目前，mcs降解菌的筛选鉴定方法比较复杂，检测分离纯化的菌株能否降解mcs时需要用到大量的mcs作为材料，实验室自行纯化mcs工作量大、产量低，而mcs纯品价格昂贵。后期对mcs的浓度测定时无论是用hplc还是elisa，成本均较大。一般从腐烂藻体水中分离出的细菌数量较多，对其一一进行mcs降解实验不仅工作量大而且会消耗大量的实验资金。

技术实现要素：

本发明公开了一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法，通过设计引物对，根据检测结果来确定其能否降解mcs，从而公开了一种新型的、快速筛选mcs降解菌的方法，进而得到可有效降解微囊藻毒素的降解菌。

本发明采用如下技术方案，一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法，包括以下步骤，

（1）设计如seqidno：1以及seqidno：2所述的引物对；

seqidno：1:5'-tgcgctatgggkcagatcc-3'

seqidno：2:5'-ggtcaaacttcttgagsagctg-3'

（2）以待筛选微囊藻毒素降解菌的dna为模板，利用步骤（1）的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；

（3）检测步骤（2）的扩增产物，根据检测结果完成微囊藻毒素降解菌的筛选。

上述技术方案中，所述pcr扩增采用25µl反应体系，其中ddh2o17.2µl，10×pcr缓冲液(mg²⁺plus)2.5µl，dntps（2.5mm）2µl，引物(10µm)各1µl，rtaqdna聚合酶（5u/µl）0.3µl，模板1µl。

上述技术方案中，所述pcr扩增反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后72℃延伸5min后，4℃保存。

上述技术方案中，检测步骤（2）的扩增产物具体为步骤（2）的扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离、eb染色、紫外检测。

本发明还公开了一对特异性的引物：

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使用该对引物扩增可以快速筛选出能够降解mcs的菌株中mlra基因的保守区，长132bp，具sts序列特点。本发明对菌株进行pcr扩增，检测获得阳性结果的可认为是藻毒素降解菌；因此本发明还公开了上述引物对在微囊藻毒素降解菌筛选中的应用。

本发明还公开了一种微囊藻毒素降解的方法，包括以下步骤，

（1）设计如seqidno：1以及seqidno：2所述的引物对；

seqidno：1:5'-tgcgctatgggkcagatcc-3'

seqidno：2:5'-ggtcaaacttcttgagsagctg-3'

（2）以待筛选微囊藻毒素降解菌的dna为模板，利用步骤（1）的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；

（3）检测步骤（2）的扩增产物，根据检测结果选择微囊藻毒素降解菌；

（4）用步骤（3）的微囊藻毒素降解菌降解微囊藻毒素。

上述技术方案中，所述pcr扩增反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后72℃延伸5min后，4℃保存。

本发明具有以下优点：

（1）快速；本发明通过一次特定的pcr扩增即可完成降解筛选，就筛选时间而言，实际操作约半天时间，而采用传统方法至少3天。

（2）准确；本发明首次公开了一种通过引物对进行pcr扩增的方法筛选降解菌，数据结果显示其准确率为100%；传统方法由于要用纯藻毒素作为唯一碳源和氮源，其纯度及溶液配制条件要求较高，培养基易受其它碳源或氮源污染，因此准确率低。

（3）效果好；本发明结合引物对的设计以及pcr扩增的条件，成功对微囊藻毒素降解菌进行筛选，达到了100%的准确率，在现有技术中未见报道。

（4）成本低，本发明通过合成引物对，利用pcr扩增，再经过检测即可实现筛选，无须用到纯藻毒素等昂贵试剂，成本可大大降低，而且工业化应用程度大大高于现有技术。

附图说明

图1为实施例一电泳结果图；

图2为实施例一菌株降解mcs的能力图。

具体实施方式

实施例一

一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法，包括以下步骤，

（1）设计如seqidno：1以及seqidno：2所述的引物对；

seqidno：1:5'-tgcgctatgggkcagatcc-3'

seqidno：2:5'-ggtcaaacttcttgagsagctg-3'

其扩增的目的基因从sphingomonassp.acm-3962序列的第436位到568位，共132bp；

（2）从太湖腐烂蓝藻中分离纯化出8株细菌（编号a1、a2、a3、a5、a6、q1、q2、q3）作为待筛选降解菌；提取待筛选微囊藻毒素降解菌的总dna为模板，利用步骤（1）的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；所述pcr扩增采用25µl反应体系，其中ddh2o17.2µl，10×pcr缓冲液(mg²⁺plus)2.5µl，dntps（2.5mm）2µl，引物(10µm)各1µl，rtaqdna聚合酶（5u/µl）0.3µl，模板1µl；所述pcr扩增反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后72℃延伸5min后，4℃保存；

（3）步骤（2）的扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，eb染色，紫外检测，电泳结果如图1所示，编号为a1、a2、a6、q1、q3的5株菌得到了阳性结果；而编号为a3、a5、q2的三株菌无条带，将扩增条件以及反应体系改变后多次尝试仍无目的条带被扩增出，说明a3、a5、q2三株菌无法降解微囊藻毒素。根据检测结果完成微囊藻毒素降解菌的筛选。

将a1、a2、a6、q1、q3电泳后的条带分别割下，胶回收试剂盒回收后克隆至pmd19-tvector，送往生工生物公司进行测序，经测序后得到的序列均为132bp；其genbank接收号分别为ku977294、ku977295、ku977296、ku977297、ku977298。分别将各菌株比对，发现与mlra基因高度相似，达到92%～100%，确认在a1、a2、a6、q1、q3这几株菌株中扩增出了mlra基因序列。

对分离到的8株单菌株降解mcs的能力进行检测。结果如图2所示，其中不同小写字母表示不同细菌间0.05水平差异显著，菌株a1、a2、a6、q1、q3对mcs具有较大了降解能力，7d内将初始浓度为0.7mg/l的mcs分别降解至0.52mg/l、0.535mg/l、0.51mg/l、0.55mg/l、0.545mg/l，降解率分别达到25.4%、23.6%、27.1%、20.7%、22.1%；而a3、a5、q2三株菌的试验中，7d后的mcs浓度分别为0.685mg/l、0.657mg/l、0.67mg/l，几乎对mcs无降解效果；实际菌株降解mcs的能力与本发明的基因扩增结果一致，达到了100%的准确率，从而可以利用本发明的方法对mcs降解菌进行工业化快速筛选。

实施例二

一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法，包括以下步骤，

（1）设计如seqidno：1以及seqidno：2所述的引物对；

（2）从阳澄湖腐烂蓝藻中分离纯化出6株细菌（编号b1、b2、b3、b4、b5、b6）作为待筛选降解菌；提取待筛选微囊藻毒素降解菌的总dna为模板，利用步骤（1）的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；所述pcr扩增采用25µl反应体系，其中ddh2o17.2µl，10×pcr缓冲液(mg²⁺plus)2.5µl，dntps（2.5mm）2µl，引物(10µm)各1µl，rtaqdna聚合酶（5u/µl）0.3µl，模板1µl；所述pcr扩增反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后72℃延伸5min后，4℃保存；

（3）步骤（2）的扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离，eb染色，紫外检测，编号为b1、b2、b3、b6株菌得到了阳性结果；而编号为b4、b5株菌无条带，将扩增条件以及反应体系改变后多次尝试仍无目的条带被扩增出，说明b4、b5株菌无法降解微囊藻毒素；同时扩增条件的变化还会导致编号为b1、b2、b3、b6株菌不全是阳性结果。根据检测结果完成微囊藻毒素降解菌的筛选。

对分离到的6株单菌株降解mcs的能力进行检测，菌株b1、b2、b3、b6对mcs具有较大了降解能力，7d内将初始浓度为0.7mg/l的mcs分别降解至0.514mg/l、0.528mg/l、0.509mg/l、0.534mg/l；而b4、b5株菌的试验中，7d后的mcs浓度分别为0.692mg/l、0.667mg/l、0.671mg/l，几乎对mcs无降解效果；实际菌株降解mcs的能力与本发明的基因扩增结果一致，达到了100%的准确率，从而可以利用本发明的方法对mcs降解菌进行工业化快速筛选。

sequencelisting

<110>苏州大学

<120>一种微囊藻毒素降解菌的快速高效筛选方法

<160>2

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

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<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

5'-ggtcaaacttcttgagsagctg-3'22