杂色曲菌素核酸适配体及其应用的制作方法

本发明属于检测
技术领域：
，涉及一种对杂色曲菌素(versicolorina，vera)具有特异性识别作用的核酸适配体分子以及其应用。
背景技术：
：杂色曲菌素(vera，versicolorina)即1,6,8-三羟基-2-羟甲基蒽醌，是黄曲霉毒素b1及杂色曲霉素(sterigmytocystin，st)合成代谢过程中的重要前体物，其结构含有与afb1和st相同的毒性基团—双呋喃环。研究表明对粮食在储藏过程中的vera进行监测，有利于对尚未检出或仅低水平检出黄曲霉毒素污染的粮食起到预警的作用。此外，20世纪80年代，wong等初步研究了vera的急性毒性和致畸变性，其ld50(小鼠静脉注射)为20mg/kg，致突变剂量为800ng/皿，因而杂色曲菌素的毒性不容忽视。vera常见于易受黄曲霉毒素污染的粮食等农产品中，若某粮食样品中检测出较高水平的vera(如100ppb以上)，即使当时未检出或低量检出黄曲霉毒素，但在储藏过程中，尤其是较长期的储藏过程中，该粮食样品存在着较高的受到黄曲霉毒素污染的风险。随着国内外对afb1、st的危害性重视程度日益加深，很多高灵敏性的分析检测方法也随之成熟，但对vera的污染和检测关注仍然不足。目前主要的分析检测的vera方法包括hplc(高效液相色谱)和tlc(薄层色谱)。hplc方法分辨率高、稳定性好、成本较低，但是样品的预处理过程较繁琐，操作技术水平要求高，对样品的前处理要求苛刻，灵敏度不够高；而tlc方法操作简单、无需复杂仪器，但其灵敏度不高，可靠性也不强。适配体亲和固相萃取柱是基于适配体的特异性作用实现特异性分离目标物，联用hplc的检测手段实现对目标物的定量分析的装置。与蛋白质抗体相比，适配体具有更优越的特点：亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，生产成本低，靶分子范围广等。因此，利用适配体制作亲和固相萃取柱，具有耗时短，操作简单、特异性强、灵敏度高、可在线和易于微型化等优点，避免了制作抗体的复杂性，因此受到了人们高度重视。技术实现要素：为了解决现有杂色曲菌素(versicolorina,vera)检测技术单一，检测方案复杂，检测时间过长的缺点，本发明的第一个目的在于提供一种杂色曲菌素核酸适配体，即vera-aptamar，它对vera具有特异性识别作用，可用于样品中vera检测样品的前处理。本发明所述的一种杂色曲菌素核酸适配体是全长49nt的单链dna，包括序列为seqidno.1的核心序列。seqidno.1：ttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttc。本发明还提供了以所述的杂色曲菌素核酸适配体为前体进行3’端氨基修饰的杂色曲菌素核酸适配体。优选地，3’端的氨基修饰基团为-(ch2)6-nh2-，也就是veraaptamar3’-(ch2)6-nh2-。本发明的第二个目的在于提供一种杂色曲菌素的样品前处理适配体亲和柱，可通过高效液相色谱检测法实现对vera的高灵敏度、高选择性的快速检测。本发明所述的杂色曲菌素的样品前处理适配体亲和柱组装有所述的杂色曲菌素核酸适配体。本发明所述的适配体亲和柱是一种亲和固相萃取柱，它是以本发明所述的适配体为分子识别元件来检测vera的，其原理是：在vera存在的情况下，本发明所述的适配体与vera特异性结合，引起所述适配体空间构象发生变化，从而特异性的从基质中捕获vera。本发明的第三个目的在于提供一种hplc紫外荧光联用检测vera的方法。本发明所述的hplc紫外荧光联用检测vera的方法，包括以下步骤：提供所述的杂色曲菌素的样品前处理适配体亲和柱；待测粮食样品与缓冲液混合上柱，清洗洗脱；收集洗脱液，浓缩，进行hplc检测。本发明的第四个目的在于提供一种生物传感器。本发明所述的生物传感器含有本发明所述的杂色曲菌素核酸适配体。本发明的第五个目的在于提供一种检测杂色曲菌素的生物检测试纸条。本发明所述的检测杂色曲菌素的生物检测试纸条含有所述的杂色曲菌素适配体。本发明的第六个目的在于提供一种检测杂色曲菌素的试剂盒。本发明所述的检测杂色曲菌素的试剂盒包括所述的生物检测试纸条。本发明的有益效果在于：(1)本发明所述的vera核酸适配体具有亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，生产成本低，靶分子范围广，长时间暴露不易变性，对周围环境要求不高等特点。(2)采用氨基修饰后一步共价偶联到载体的方式满足了与适配体结合的稳定性要求，同时大大简化了对适配体的修饰过程，还能够维持适配体的活性结构。(3)本发明基于适配体与vera的特异性识别作用，用本发明所述的适配体亲和柱组装了所述的vera核酸适配体。采用hplc检测技术，建立了一种基于适配体亲和固相萃取作为前处理的hplc检测vera的方法，为vera的检测提供了一种新的方法和途径。该适配体亲和柱配合高效液相色谱的荧光或紫外检测器联用可检测100ppb的vera。(4)本发明所述的适配体亲和固相萃柱制备过程试剂用量极少，相比传统的液液萃取与硅胶柱净化而言，处理速度更快，需要使用的有机溶剂也指数倍地减少。与传统的液液萃取手段相比，该方法具有特异性强，简便灵活，分析速度快，使用成本低廉等优点。该样品前处理方法操作简单便捷，较液液萃取法灵敏度高且更加稳定可靠。本发明为vera的检测提供了一种新的快速的样品前处理方法。附图说明图1为5μg/ml浓度下的vera标准品的hplc紫外吸收图谱，rs为16.420min，紫外检测波长288nm。图2为5μg/ml浓度下的vera标准品的hplc荧光图谱，rs为16.529min，荧光检测器的激发光波长为288nm，发射光波长为530nm。图3为含vera的实际玉米样品经过aac柱处理后的洗脱液的hplc色谱图(紫外吸收检测器)，rsvera为16.293min，紫外检测波长288nm。图4为与图3相同的含vera的实际玉米样品经过aac柱处理后的洗脱液的hplc色谱图(荧光检测器)，rsvera为16.400min,荧光检测器的激发光波长为288nm，发射光波长为530nm。图5为未经aac柱处理的含vera标品100ng/ml的溶液与bb6.4缓冲液的混合液(含6％甲醇)的过柱处理前的hplc色谱图，rsvera为16.260min，紫外检测波长为288nm。未检出荧光信号。图6为未经aac柱处理的含vera100ng/ml的玉米提取液与bb6.4缓冲液的混合液(含6％甲醇)的过柱处理前的hplc色谱图，rsvera为16.177min，紫外检测波长为288nm。未检出荧光信号。图5为含vera为100ng/mlvera标准品与缓冲液混合液，含6％甲醇，未经aac柱处理的hplc色谱图的紫外检测。图6为含vera100ng/ml的玉米提取液与缓冲液混合液，含6％甲醇，未经aac柱处理的hplc色谱图的紫外检测色谱图。未检出荧光信号。图7为标准品vera(100ng/ml)与缓冲液混合液(含6％甲醇)经aac柱处理后的hplc色谱图(紫外吸收检测器)。紫外检测波长为288nm。图8为标准品vera(100ng/ml)与缓冲液混合液(含6％甲醇)经aac柱处理后的hplc色谱图(荧光检测器)。荧光检测器的激发光波长为288nm，发射光波长为530nm。具体实施方式实施例一：本发明所述的vera核酸适配体化学合成如下表1所示的vera核酸适配体，这些核酸序列均为长度49bp的单链dna。表1如上表所示，所有杂色曲菌素核酸适配体均包括序列为seqidno.1的核心序列，该核心序列为37个碱基，分别在核心序列的两端随机引入核酸碱基。seqidno.1：ttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttc将表1所列的核酸适配体的3’端进行氨基修饰，得到vera-aptamar3’-(ch2)6-nh2-，用于以下的实施例。实施例二：vera的适配体亲和固相萃取小柱的构建(一)试剂与仪器杂色曲菌素a(vera，本实验室制备，纯度99.96％)。na2hpo4·12h2o、c6h8o7·h2o、nacl、kcl、mgcl·6h2o、甲醇为色谱纯，购自fisherscientific(thermofisher)。实验用水为超纯水(电阻率：18.2mω/cm)。nano-100，微量分光光度计，用以测定dna浓度。vera核酸适配体组装液的配制：组装液为769.5μg/ml的3’端修饰了氨基的单链dna适配体溶液，用200mm磷酸氢二钠(na2hpo4)，5mm氯化镁(mgcl)，ph8.0的适配体溶液溶解配制。(二)适配体亲和固相萃取柱的构建(1)3’端氨基化的适配体预处理1.5ml离心管中含有5od的适配体。溶解到200μl的适配体溶解液中，以封口膜封闭离心管后。置于85℃的热水浴中3min，关闭水浴锅，将离心管与热水一同转移至铝盘中随同水温一起降至室温25℃，使得适配体经历变性和退火的过程，形成特定的二级结构。(2)cnbr-activatedsepharose活化处理准确称取35mg的cnbr-activatedsepharose，置入spe空柱管中，加入1ml的1mmhcl溶胀15min后以1ml的1mmhcl，4℃淋洗6次，每次1ml，然后使用ddh2o清洗2ml，最后加入200ml适配体溶解液润洗。(3)适配体与载体偶联a.200μl的经过退火处理的适配体加入到上述已经经过预活化的cnbr-activatedsepharose中，震荡处理混合室温下25℃过夜处理。回收活化后的适配体废液。b.经过适配体偶联处理的载体简称为aac柱，向aac柱中加入3ml的200mm磷酸氢二钠溶液，ph8.0，淋洗柱体清洗掉多余的适配体。c.加入200μl的0.1mtris-盐酸(tris-hcl)，ph8.0封闭aac柱中残留的活性基团，室温下两小时。d.除去没有偶联的适配体：先使用3ml的0.1m的0.1m醋酸-醋酸钠(ch3cooh—ch3coona)，0.5mnacl，ph4.0淋洗；之后使用3ml的0.1m的0.1mtris-盐酸(tris-hcl)，0.5mnacl，ph8.0淋洗。e.加入5ml的结合缓冲液(bindingbuffer)，ph6.4，(简称为bb6.4)来复性适配体。如果暂时不使用，排空bb6.4，替换成0.05％的叠氮化钠保护液，置于4℃中保存。实施例三：适配体亲和固相萃取柱对空白液加标样品的富集(1)适配体亲和柱上样，清洗洗脱操作a)配置100ng/ml，含有6％甲醇的bb6.4溶液的vera标准液。b)上样：1ml(相当于0.05g玉米，6％甲醇)，100ng/ml的上述母液，通过柱子的速度为1滴/5秒，一个大气压下缓慢通过适配体亲和柱。1ml样品完全通过柱子后，最后利用正压将管路内的所有的上样液压出。c)清洗：加入10ml的bb6.4缓冲液，同样2滴/秒通过柱子。待所有bb6.4缓冲液完全通过适配体亲和柱后，利用正压将管路内的所有液体排空，之后抽真空30s将所有的bb6.4缓冲液完全排空。d)洗脱：向适配体亲和柱中加入1.5ml的色谱级甲醇，1滴/秒。待所有的甲醇通过柱子后，利用正压将管路内的所有甲醇完全压出到2ml离心管中。e)重生：向适配体亲和柱中加入5ml的bb6.4缓冲液，以1滴/秒的速度通过aac柱。f)样品挥干：将收集到的3个装有样品的2ml离心管放入真空干燥箱中，开启真空泵，之后开启真空干燥箱的真空阀，开启烘箱设定温度80℃。样品挥干后，关闭真空阀门，再关闭真空泵。一个柱子重复上述操作3次，避免因为适配体亲和柱之间的柱效差异干扰。(2)高效液相色谱分析采用戴安u3000高效液相色谱进行定量分析，设定检测通道为uv288nm，fld为ex288，em530nm。分析流动相梯度如下所示。a相：10mm醋酸铵/20μm乙酸钠水溶液；d相：10mm醋酸铵/20μm乙酸钠甲醇溶液。表2：vera的hplc梯度洗脱程序时间(分钟)流动相d(％)流动相a(％)0.0140601.00158511.0158515.0010025.0010026.04060404060使用同一条一个柱子重复上述操作3次，避免因为适配体亲和柱之间的组装差异导致的柱效差异干扰，作为三个平行。每一个平行的加标量为100ng，每一个挥干的平行进行hplc检测前的复溶体积为100μl。将表1所列的10个适配体分子进行实施例二和三的实验，得到的实验结果如表3所示。表3：vera在最适条件下过适配体亲和柱后的回收率注：1e(standard)的表示1号柱，e代表洗脱液即elution液，standard代表标准品。如此类推。回收率数据为第2次、3次和6次重复使用的三次结果平均±标准差。如表3所示，在37个核心碱基序列的基础上分别在两端随机引入核酸碱基，总长度为49bp的单链dna分子，经氨基修饰后以同样的方法和条件组装成亲和柱，得到相似的结果。图1和图2分别为vera标品原液(5μg/ml)上机的hplc色谱的紫外吸收图谱和荧光检测图谱。图5为未经aac柱(1号柱)处理的标品与缓冲液的混合液上机后的hplc色谱图，而图7(紫外检测)和图8(荧光检测)为相同的标品混合液经aac柱富集后的hplc效果图。表明本发明的适配体亲和柱(aac柱)具有明显的富集vera的作用。实施例四：实际样品中100ppbvera加标检测将本发明所述的适配体亲和固相萃取柱用于实际样品测定及检测其回收率，所述的样品可以是农副产品和粮食作物包括玉米、花生、大米、小麦等，也可以是其它可能含有vera的产品如饲料、饮料、食用植物油等。本实施例中选用玉米样品进行检测。玉米萃取阶段：取玉米样品5克，利用粉碎机粉碎后过20目筛网后，放入50ml的离心管中，之后加入10ml的60％甲醇水溶液，高速匀质1min。之后在离心机中1000g离心1min，取上清滤液过0.45μm玻璃纤维滤膜，经过﹣20℃过夜处理后，添加vera标准溶液至终浓度为50ng/mlvera，即得到含有vera50ng/ml的玉米提取液(相当于0.5g玉米/ml)。之后使用1ml的50ng/mlvera，60％甲醇玉米提取液与9mlbb6.4缓冲液混合降低本底干扰，得到5ng/mlvera玉米提取液(相当于0.05g玉米/ml)，6％甲醇的玉米bb6.4混合液样品液(相当于100ppbvera)。适配体亲和柱上样清洗洗脱操作：a)上样：排空上筛板以上复性用的bb6.4缓冲液，加入5ml(相当于0.25g玉米，6％甲醇)，5ng/mlvera的上述样品液，通过柱子的速度为1滴/5秒。5ml样品完全通过柱子后，最后利用正压将管路内液体排空。b)清洗：加入2ml的bb6.4缓冲液，同样1滴/5秒通过柱子。待所有bb6.4缓冲液完全通过适配体亲和柱后，利用正压将管路内的所有液体排空，之后抽真空30s将所有的bb6.4缓冲液完全排空。c)洗脱：向适配体亲和柱中加入1.5ml的色谱级甲醇，1滴/10秒。待所有的甲醇通过柱子后，利用正压将管路内的所有甲醇完全压出到2ml离心管中。d)重生：向适配体亲和柱中加入5ml的bb6.4缓冲液，以1滴/秒的速度通过适配体亲和柱。e)样品挥干：将收集到的3个装有样品的2ml离心管放入真空干燥箱中，开启真空泵，之后开启真空干燥箱的真空阀，开启烘箱设定温度80℃。样品挥干后，关闭真空阀门，再关闭真空泵。一个柱子重复上述操作3次，避免因为适配体亲和柱之间的柱效差异导致干扰。所有操作过程中避免压力突然增大或者降低，不然会造成柱体完整的截面受损影响柱效。高效液相色谱分析：采用戴安u3000高效液相色谱进行定量分析，设定检测通道为uv288nm，fld为ex288，em530nm。分析流动相梯度如下所示。样品使用60％a相40％d相作为溶解液，加入100μl复溶经过浓缩干燥的样品，上机检测前使用离心机以13200rpm(相当于11737g)转速离心5min。a相：10mm醋酸铵/20μm乙酸钠水溶液；d相：10mm醋酸铵/20μm乙酸钠甲醇溶液。表4：vera的hplc梯度洗脱程序玉米中100pb的vera加标回收率每一个平行的vera加标量为25ng，每一个挥干的平行样品进行hplc检测前的复溶体积为100μl。回收率见下表：表5：适配体亲和柱对vera的回收率注：1e(corn)的表示1号柱，e代表洗脱液即elution液，corn代表玉米提取液。如此类推。数据为第2次、3次和6次重复使用的三次结果平均±标准差。图6为未经aac柱处理的玉米样品提取液与缓冲液混合液的hplc色谱图，而图3(紫外检测)和图4(荧光检测)为相同样品经过aac柱处理后的hplc效果图。可以发现aac除了具有富集vera的作用之外，还消除了在图6中出现在目标分子vera附近的两个来自玉米的杂质峰。显示出本发明vera适配体亲和柱(aac柱)的特异选择性(消除了两个极性与目标分子相似的杂质)。如表4所示，在37个核心碱基序列的基础上分别在两端随机引入核酸碱基，总长度为49bp的单链dna分子，经氨基修饰后以同样的方法和条件组装成亲和柱，得到相似的结果。三次平行的最大变异系数c.v为11.5％，三次的回收率都能保持在较高的水平，这说明所制备的vera适配体亲和柱性能稳固。综合上述实施例的实验结果，本发明所述的杂色曲菌素(vera)核酸适配体构建的适配体亲和固相萃取柱作为前处理手段在检测玉米样品中具有显著效果。由此推知，在其他典型的粮食样品中，本发明所述的适配体亲和固相萃取柱也能作为检测vera的前处理手段。实施例五：本发明所述的杂色曲菌素核酸适配体的应用基于上述实施例的实验结果，结合本领域的已知技术，至少可以制备出以下产品：(1)生物传感器，它含有本发明所述的杂色曲菌素核酸适配体。(2)检测杂色曲菌素的生物检测试纸条，它含有所述的杂色曲菌素适配体。(3)检测杂色曲菌素的试剂盒，它包括上述的检测杂色曲菌素的生物检测试纸条。sequencelisting<110>暨南大学<120>杂色曲菌素核酸适配体及其应用<130><160>11<170>patentinversion3.4<210>1<211>37<212>dna<213>人工合成<400>1ttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttc37<210>2<211>49<212>dna<213>人工合成<400>2tgttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgcaggcccgg49<210>3<211>37<212>dna<213>人工合成<400>3gtgttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggccc49<210>4<211>49<212>dna<213>人工合成<400>4gtggggttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctagg49<210>5<211>49<212>dna<213>人工合成<400>5gttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggcccac49<210>6<211>49<212>dna<213>人工合成<400>6ttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcaggcccggccgg49<210>7<211>49<212>dna<213>人工合成<400>7ggtgttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggcc49<210>8<211>49<212>dna<213>人工合成<400>8aggtgttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggc49<210>9<211>49<212>dna<213>人工合成<400>9agtgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggcccac49<210>10<211>49<212>dna<213>人工合成<400>10taggggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctaggcccac49<210>11<211>49<212>dna<213>人工合成<400>11tggttgggcacgtccaagccgcacatttctcgtgcccttcgctagccac49当前第1页12