一种焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的引物及其应用的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的方法及引物。

背景技术：

aldh2基因编码的乙醛脱氢酶和adh1b基因编码的乙醇脱氢酶是酒精代谢过程中的关键酶，乙醇脱氢酶负责将乙醇(酒的成分)氧化为乙醛，生成的乙醛作为底物进一步在乙醛脱氢酶催化下转变为无害的乙酸(醋的成分)。编码基因的多态性造成酶催化能力的改变会影响酒精代谢进而引起乙醛等有害物质的堆积，影响身体健康。其中aldh2基因存在的g1510a多态性(rs671)会导致氨基酸序列第487位上的谷氨酸被赖氨酸所替换(即，glu487lys)，具有催化活性的野生型称为g等位基因(即，aldh2*1)，而催化能力显著降低的突变型称为a等位基因(即aldh2*2)。adh1b基因存在的a143g多态性(rs1229984)会导致氨基酸序列第48位的组氨酸被精氨酸所替换(即，his48arg)，野生型a等位基因(即，adh1b*1)会减缓乙醇代谢，突变型称为g等位基因(即，adh1b*2)可导致乙醇脱氢酶活性极大增强，乙醇代谢至乙醛的速度较快，促进了体内乙醛的堆积。乙醛毒性高于乙醇，是造成宿醉的主要原因之一。

硝酸甘油具有舒张血管，降低心脏前后负荷，扩张冠状动脉，减少心肌耗氧等作用，是治疗心绞痛的经典药物。但临床上部分病人在使用硝酸甘油时并不能迅速有效地缓解心绞痛。研究发现，起舒张血管作用的实际是由硝酸甘油转化释放的no所介导的，而在转化过程中起关键作用的是乙醛脱氢酶。aldh2基因snp位点rs671多态性导致乙醛脱氢酶酶活性显著降低，从而影响了硝酸甘油治疗心绞痛的有效率。

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与sanger测序法相媲美，而速度却大大的提高。在整个反应体系中，以单链的pcr产物作为模板，测序引物与其退火结合，四种dntp按照既定的顺序加到反应体系中，dntp与模板链上的碱基互补结合，在dna聚合酶的作用下释放与掺入量等摩尔数的焦磷酸基团ppi。硫酸化酶催化释放的ppi与腺苷-5'-磷酸硫酸酐形成等量的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosinetriphosphate,atp)，atp驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化态转化，并发生光信号。通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比，根据获得的峰值图即可读取准确的dna序列信息。

技术实现要素：

本发明需要解决的技术问题是，提供一种灵敏、准确、操作简便的新型检测方法，实现对aldh2基因snp位点rs671型和adh1b基因snp位点rs1229984型多态性的同时快速检测，以弥补现有检测方法的不足。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的引物，包括seqidno.：1～4所示的扩增引物、seqidno.：5～6所示的测序引物；其中seqidno.：1和seqidno.：3的5’端进行生物素标记；

其中，seqidno.：1～2所示引物对用于扩增aldh2基因；seqidno.：3～4所示引物对用于扩增aldh2基因；seqidno.：5所示测序引物用于snp位点rs671测序；seqidno.：6所示测序引物用于adh1b基因snp位点rs1229984测序。

其中，所述的酒精代谢基因为aldh2基因和adh1b基因。

上述焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的引物在在检测aldh2基因snp位点rs671和adh1b基因snp位点rs1229984多态性中的应用在本发明的保护范围之内。

一种焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的方法，该方法包括如下步骤：

(1)提取dna模板；

(2)多重pcr：将seqidno.：1～4所示的4条引物混合，进行多重pcr；

(3)单链纯化：使用链霉亲和素包被的磁珠对pcr扩增产物进行单链纯化；

(4)焦磷酸测序：将seqidno.：5～6所示的2条引物混合，进行多重焦磷酸测序；

步骤(1)中，所述的dna模板为口腔黏膜细胞dna或edta抗凝全血的dna。

步骤(2)中，多重pcr扩增反应条件如下：95℃预变性2min，95℃变性25s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。

步骤(2)中，seqidno：1～4所示引物浓度的比例是1：1。

步骤(4)中，seqidno：5～6所示引物的浓度是1：1。

步骤(4)中，设置测序序列：c/tgc/taggacag。

步骤(4)中，设置碱基加样顺序：actgctaga。

有益效果：

本发明提供了一种可以同时扩增及检测aldh2基因和adh1b基因序列片段的引物，该引物的特异性好，不会发生交叉反应，准确性好。此外，本发明提供的焦磷酸测序检测序列和加样顺序，配合pcr扩增引物和焦磷酸测序引物实现了一种在一次测序反应中同时检测aldh2基因snp位点rs671和adh1b基因snp位点rs1229984多态性的焦磷酸测序方法。与传统普通焦磷酸测序一次测序反应中只能检测一个snp多态性相比，本发明检测的通量更高，有效减少检测时间、人力和成本。同时，还具有检测结果准确、特异性好、灵敏度高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点，可以为健康饮酒和硝酸甘油的临床用药提供指导。

附图说明

图1为aldh2基因snp位点rs671和adh1b基因snp位点rs1229984联合测序法检测结果图，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。

图2为aldh2基因snp位点rs671焦磷酸检测结果图，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。

图3为adh1b基因snp位点rs1229984焦磷酸检测结果图，其中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。

具体实施方式

下述实施例对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

实施例1：引物。

针对aldh2基因snp位点rs671和adh1b基因snp位点rs1229984的基因多态性位点，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好、不会发生交叉反应且pcr反应条件非常接近的引物。

扩增aldh2基因序列片段的引物对：

f1(seqidno.：1)：5′-cggggagtggccgggagttgggc-3′，5’进行生物素标记

r1(seqidno.：2)：5′-cctcaagccccaacaggccctga-3′；

扩增adh1b基因序列片段的引物对：

f2(seqidno.：3)：5′-cagcttctctttattctgtagat-3′，5’进行生物素标记

r2(seqidno.：4)：5′-cctaaaatcacaggaagggggg-3′；

aldh2基因snp位点rs671的焦磷酸测序引物：

seqidno：5：5′-actcacagttttcactt-3′；

adh1b基因snp位点rs1229984的焦磷酸测序引物：

seqidno：6：5′-accacgtggtcatctgt-3′。

实施例2：aldh2基因snp位点rs671和adh1b基因snp位点rs1229984多态性的同时检测。

1、提取edta抗凝全血的dna样品：提取方法参照tianampblooddnakit(购自tiagen，货号dp318)的说明书，将dna样品稀释至50ng/μl，备用；

2、多重pcr扩增：

(1)配制pcr扩增引物混合物，aldh2基因snp位点rs671及adh1b基因snp位点rs1229984的引物浓度比为1：1，引物混合物终浓度为10μmol/l，震荡混匀微离心。pcr扩增采用takarapcramplificationkit(购自takara公司，货号r011)，以提取得到的样本dna为模板，反应体系如表1所示；

表1多重pcr扩增体系

(2)多重pcr扩增反应条件包括：95℃预变性2mins，95℃变性25s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min，结束后16℃保温；

(3)pcr扩增结束后，取pcr扩增产物取5μl做琼脂糖凝胶电泳检测有片段，表明pcr扩增成功。

3、制备焦磷酸测序单链模板：配制焦磷酸测序引物混合物，aldh2基因snp位点rs671及adh1b基因snp位点rs1229984的测序引物浓度比为1：1，引物混合物终浓度为10pmol/μl，震荡混匀微离心。使用扩增出条带的pcr产物50μl与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20分钟，用vacuumpreptool将与磁珠结合后的pcr产物吸起，然后在70％乙醇中清洗10s；denatureationbuffer洗10s；最后移到washingbuffer中清洗20s；vaccumpreptool放入含有aldh2基因snp位点rs671和adh1b基因snp位点rs1229984测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入85℃烘箱2分钟，再冷却到室温。

4、焦磷酸测序：打开pyromark^tmidv1.0软件，在snp测序模式下设置测序序列：c/tgc/taggacag；设置碱基加样顺序：actgctaga。室温条件下，在焦磷酸测序仪(pyromarkq96id)上进行测序反应。

5、结果判定：带生物素标记的正向dna序列经焦磷酸测序，测序结果图中“actgctaga”的第二和第三位碱基“ct”为aldh2基因snp位点rs671多态性的判别位点，对应正向序列的g/a；第四和第五位碱基“ct”为adh1b基因snp位点rs1229984多态性的判别位点，对应正向序列的g/a。

实施例3：临床样品检测。

将本发明所述的焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的引物及方法对20例临床样本进行aldh2基因snp位点rs671和adh1b基因snp位点rs1229984多态性的同时检测，检测方法按照实施例2中的步骤实施。同时，使用普通焦磷酸测序法对样品分别进行aldh2基因snp位点rs671和adh1b基因snp位点rs1229984多态性检测，检测结果与联合检测方法进行比对。比对结果如表1所示：

表1样品检测结果对照表

利用本发明提供的的焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的引物及方法分析20例样本得到的检测结果与普通焦磷酸测序法得到的检测结果一致。图1为利用本发明提供的引物及方法检测上述20例样品时的部分结果图；图2为焦磷酸测序法检测aldh2基因snp位点rs671多态性结果图。

本发明所提供的引物和检测方法在aldh2基因snp位点rs671和adh1b基因snp位点rs1229984多态性进行准确分型鉴定时，可实时监测反应进程、反应时间短、pcr产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于临床检验的要求。

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<110>杭州迪安医学检验中心有限公司

<120>一种焦磷酸测序联合测序法检测酒精代谢基因的引物及其应用

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<223>扩增adh1b基因序列片段的上游引物

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<223>扩增adh1b基因序列片段的下游引物

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