一种检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物及其应用的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种TaqMan-MGB探针法同时检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法和应用。

背景技术：

酒精代谢相关基因是分子进化和群体遗传学研究的热点之一。酒精化学名乙醇，饮酒后乙醇经肠胃吸收进入血液。进入体内的乙醇90％--95％通过肝脏进行代谢，其余随尿液、汗液和呼吸排出。乙醇在肝脏内主要需经过两步代谢反应：从乙醇氧化为乙醛；从乙醛再氧化为乙酸。这两步代谢反应都是在酶的催化下进行的，前者的酶叫乙醇脱氢酶(ADH)，后者的酶叫乙醛脱氢酶(ALDH)。基因科学家的研究表明，乙醇脱氢酶主要由ADH1B基因编码，乙醛脱氢酶主要由ALDH2基因编码。这两种酶的突变可影响酒精代谢进而引起乙醛等有害物质的堆积，影响身体健康。而乙醛毒性很强，是第一类致癌原。慢代谢的人饮酒后体内乙醛会迅速累积，进而引发脸红、心跳加速、恶心呕吐和头痛等不适反应。研究表明，乙醛慢代谢的人若长期饮酒，消化道癌症如食道癌和肝癌的发病率会显著上升。因此通过检测ADH1B、ALDH2两种基因，能够帮助大家更具体地了解自己的酒精代谢能力，更具体地了解饮酒的健康风险，提前做好预防；同时基因检测还能够更科学更精确地帮助酒精中毒病人确定发病原因；还能够在某些时候帮助实现用药安全，以免在治疗疾病的同时再造成其他疾病的发生。

一直以来，硝酸甘油作为首选的一线用药，在临床上被广泛地用作抗心绞痛的治疗，但该药的临床疗效常因人而异。研究显示，中国汉族人群中，硝酸甘油含服无效的比例高达25％以上，而ALDH2基因多态性与部分国人含服硝酸甘油治疗心绞痛无效相关。研究表明乙醛脱氢酶是硝酸甘油在人体内生物代谢的关键酶，ALDH2基因多态性会导致乙醛脱氢酶活性显著降低，从而影响硝酸甘油治疗心绞痛的疗效。因此，检测ALDH2基因型，可以为医生临床使用硝酸甘油提供参考，减少用药无效导致的意外死亡。

检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性对硝酸甘油的临床用药及指导人们健康饮酒具有重要的意义。目前已有很多种检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法，如测序法、毛细管电泳法、基因芯片法等，但其用于检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性存在操作复杂、易污染、成本高等特点，因此需要建立一种检测特异性和灵敏度高、准确性和精密度好、操作简单、快速、无污染、成本低廉，且可实现多个位点同时检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种同时检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的检测引物探针，以克服现有技术检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性操作复杂、易污染、成本高等问题。

本发明还要解决的技术问题是提供一种检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法。

TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物，包括如下引物和探针：

用于扩增ADH1B基因rs1229984多态性位点的引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

用于扩增ALDH2基因rs671多态性位点的引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

检测ADH1B基因rs1229984位点多态性的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

检测ALDH2基因rs671位点多态性的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

其中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7在5’末端标记Fam信号，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8在5’末端标记VIC信号；

其中，引物SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和探针SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6在同一管中共同使用；引物SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和探针SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8在同一管中共同使用。

上述TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物在检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性中的应用。

一种TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的试剂盒，包括权利要求1所述的引物和探针以及如下试剂：2x PCR反应混合液、阳性标准品。

其中，所述2x PCR反应混合液的配方如下：PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和dNTPs。

其中，所述阳性标准品为AA基因型质粒和GG基因型质粒，AA基因型质粒的插入序列如SEQ ID NO：9所示；GG基因型质粒的插入序列如SEQ ID NO：10所示。

TaqMan-MGB探针法检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)模板的准备：提取待测样品DNA；

(2)实时荧光定量PCR反应：将以步骤(1)提取的DNA为模板、权利要求1所示的引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)结果判读：根据检测到的荧光信号值，在实时荧光定量PCR仪上的“端点基因分型”模式下，根据每个样品点的颜色和对应的基因型，直接判读结果。

本发明的试剂盒根据ADH1B基因rs1229984位点和ALDH2基因rs671位点的保守基因序列设计引物和探针，保证检测方法的特异性。本发明采用TaqMan-MGB探针法实现了对ADH1B基因rs1229984位点和ALDH2基因rs671位点的快速、简单检测。本发明检测结果准确，易于判读。与测序法相比，该方法不需要对PCR产物进行一系列复杂的后续处理，PCR扩增和检测同步进行，整个检测过程无需开盖操作，降低了PCR产物造成污染的风险，大大缩短了检测时间，且降低了检测成本。

附图说明

图1为10例标本ADH1B基因rs1229984位点的检测结果图示；

图2为10例标本ALDH2基因rs671位点的检测结果图示。

具体实施方式

Taqman探针法可用于基因荧光定量分析、甲基化检测、SNP分型、miRNA定量分析等。Taqman探针法SNP分型技术的核心就是特异性的MGB探针技术，已证实的Taqman探针，3’段结合MGB技术，能更好的进行等位基因的区分。MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验。这种超强的稳定性可使短至13个碱基的探针提高错配的辨别力，并为困难多变的序列设计提供更高的灵活性。所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团(NFQ)，它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提供检测灵敏性。其具体方法是：针对同一SNP位点的不同基因型设计两条不同的TaqMan-MGB探针，把它们同时加入到PCR反应体系中，只有与靶序列完全匹配的探针才能被水解并释放出荧光信号。两条探针分别标记不同的荧光基团，分别用实时荧光定量PCR仪中对应的荧光检测通道检测荧光信号。某种基因型对应的荧光探针能够释放荧光信号，说明在原始DNA样本中含有该种基因型。如果只有一条探针能释放荧光信号，那么检测到SNP位点上是纯合子，如果两条探针都有荧光信号，那么在该SNP位点上是杂合子。该方法可以直接在实验结果中读出每个样本中SNP的基因型，不需要再对序列进行分析，具有直观性。

基于上述原理，本发明提供的TaqMan-MGB探针法同时检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的试剂盒，包括：

(1)2x PCR反应混合液：PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和dNTPs；

(2)引物探针混合液1：ADH1B基因rs1229984多态性位点的引物P1和P2，探针D1和D2；

ADH1B基因rs1229984多态性位点引物：

P1 5’-TCTGAATCTGAACAGCTTCTCT-3’(SEQ ID NO：1)

P2 5’-GGTCACCAGGTTGCCACTA-3’(SEQ ID NO：2)

ADH1B基因rs1229984多态性位点探针：

D1 5’-AGGAATCTGTCACACAGA-3’(SEQ ID NO：5)

D2 5’-AGGAATCTGTCACGCAGA-3’(SEQ ID NO：6)

(3)引物探针混合液1：ALDH2基因rs671多态性位点的引物3和4，探针3和4；

ALDH2基因rs671多态性位点引物：

P3 5′-ATTGGTCCGGTCGAAGGAGGAG-3′(SEQ ID NO：3)

P4 5′-CAACCGAGCGCCATTCAGAGTCT-3′(SEQ ID NO：4)

ALDH2基因rs671多态性位点探针：

D1 5′-TGACCTTGCGATGCTCTATGAGTG-3′(SEQ ID NO：7)

D2 5′-GCATACCCAATCGGCTCTCCA-3′(SEQ ID NO：8)

(4)阳性标准品：AA基因型质粒和GG基因型质粒；AA基因型质粒的插入序列如SEQ ID NO：9所示；GG基因型质粒的插入序列如SEQ ID NO：10所示。

(5)阴性标准品：双蒸水。

使用上述试剂盒检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)待测样品DNA的提取；

(2)实时荧光定量PCR反应：取12.5μL 2×PCR反应混合液，2.5μL引物探针混合液，双蒸水5μL，配制PCR反应液，然后加入5μL模板溶液；分别以待测样本DNA、阳性标准品及双蒸水作为模板；然后放置实时荧光定量PCR仪上进行扩增；扩增条件：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，40个循环；

(3)结果判读：根据检测到的荧光信号值分别对rs1229984和rs671位点进行基因型判定。

下列实施例进一步说明本发明，但不应当作为本发明的限制。

实施例：

(1)待测样品DNA的提取：

取200μL外周血，按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取，提取DNA用于后续实验或者存放于-20℃。

(2)荧光定量PCR扩增和检测：

在96孔板中，配制如下反应体系：12.5μL 2×PCR反应混合液，2.5μL引物探针混合液，50ng模板DNA，加水补足至总体积25μL，同时设立阳性对照和阴性对照。实时荧光定量PCR反应中的扩增程序为：95℃，2min；95℃，5s，60℃，45s，收集荧光，40个循环。

(3)结果判读：

反应结束后，应用仪器自带软件进行数据分析。根据扩增结果，对标本基因型进行判定，具体检测结果如图1和图2所示。

(4)结果统计：

10例标本的基因型结果统计如下：

以上所述，是本发明较佳的实施例，并非本发明任何形式上或实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明的范围前提下，还可以对之做一些修改和改进，这些改进和补充也应该视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州迪安医学检验中心有限公司

<120> 一种检测ADH1B基因和ALDH2基因多态性的引物及其应用

<130> SG2016122001

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增ADH1B基因 rs1229984多态性位点的上游引物

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<212> DNA

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<223> 扩增ADH1B基因 rs1229984多态性位点的下游引物

<400> 2

ggtcaccagg ttgccacta 19

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<211> 22

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增ALDH2基因 rs671多态性位点的引物的上游引物

<400> 3

attggtccgg tcgaaggagg ag 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增ALDH2基因 rs671多态性位点的引物下游引物

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<223> 检测ADH1B基因 rs1229984位点多态性的TaqMan-MGB探针

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gatgaccacg tggttagtgg caacctggtg acc 93

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gatgaccacg tggttagtgg caacctggtg acc 93