本发明涉及一种提取罗汉果甜苷的方法，具体涉及一种同时提取罗汉果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v的方法。
背景技术：
罗汉果是我国传统的药食同源植物，罗汉果甜苷是其主要的功能成分，是一类高甜度、低卡路里的理想天然甜味剂，因其具有多种生物活性而备受人们的关注。罗汉果甜苷分为多种，研究表明罗汉果甜苷是一种三萜烯葡萄糖苷，其配糖苷元是三萜烯醇，有两条由四个以下葡萄糖单位组成的葡萄糖苷侧链，以β-糖苷键与苷元相连，侧链葡糖糖之间的连接键为β-1,6和β-1,2糖苷键。其中，罗汉果甜苷v的含量最高，其次是11-o基苷v和苷ⅵ，三种甜苷的分子式如下：
罗汉果甜苷v
罗汉果11-o基苷v罗汉果甜苷ⅵ
罗汉果甜苷的提取在国内已有多年的产业化经验，对于罗汉果甜苷v的分离和提纯的研究比较广泛。
cn101029071a公开了一种从罗汉果中制备高纯度罗汉果苷v的方法，是以罗汉果鲜果为原料，通过乙醇回流提取，乙酸乙酯和正丁醇萃取，聚酰胺和硅胶层析，得到罗汉果苷v。但是，该方法过于复杂，生产成本极高，且只能获得罗汉果苷v一种成分。
cn106074669a公开了一种罗汉果多酚的提取方法，是以罗汉果果皮为原料，通过干燥，粉碎，乙醇超声提取，聚酰胺吸附，洗脱，浓缩等步骤得到罗汉果多酚提取物。但是，该方法未涉及罗汉果甜苷的分离方法。
cn1375499a公开了一种从罗汉果中提取分离多种成份的方法，是以罗汉果为原料，通过碱水提取，脂肪醇沉淀，离子交换树脂、大孔树脂、聚酰胺树脂等处理，得到罗汉果甜苷、罗汉果多糖和罗汉果黄酮。但是，该方法获得的罗汉果甜苷为多种甜苷的混合物，并未得到各甜苷的高纯产品。
cn101851265a公开了一种从干罗汉果中提取多种活性成分的方法，是先将干罗汉果去核，再通过加水闪提，离心，多次聚酰胺层析，d213脱色，醇沉，酶解等步骤，分别得到甜苷、多酚、多糖、低聚糖和氨基酸等成分。但是，该方法获得的罗汉果甜苷同样是多种甜苷的混合物，并未得到各甜苷的高纯产品。
由上可知，现有关于罗汉果11-o基苷v和苷ⅵ分离和提纯的报道很少。实际生产中得到的罗汉果提取物通常是罗汉果总苷的混合物，因此，迫切需要找到一种方法，实现单一成分的分离，并实现产业化。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种所得产品纯度、收率高，成本低，工艺条件温和，安全环保，适于工业化生产的同时提取罗汉果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种同时提取罗汉果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v的方法，包括以下步骤：
（1）正丁醇萃取：将罗汉果甜苷v精制母液用水溶解，加入正丁醇进行萃取，分离水层，得正丁醇层；
（2）浓缩析晶：将步骤（1）所得正丁醇层减压浓缩，冷却，搅拌析晶，过滤，得晶体和正丁醇析晶母液，将晶体干燥，得罗汉果甜苷ⅵ；
（3）聚酰胺层析：将步骤（2）所得正丁醇析晶母液减压浓缩至无醇，将所得浓缩物用水溶解，通过聚酰胺层析柱，收集上柱流出液，减压浓缩，干燥，得罗汉果甜苷v；
（4）梯度洗脱：先后用低度醇溶液和高度醇溶液对步骤（3）过柱后的聚酰胺层析柱进行洗脱，收集高度醇洗脱液，浓缩，冷却，析晶，过滤，干燥，得罗汉果11-o基苷v。
优选地，步骤（1）中，所述罗汉果甜苷v精制母液中，罗汉果甜苷ⅵ的质量含量为10～30%，罗汉果甜苷v的质量含量为10～15%，11-o基苷v的质量含量为5～20%。本发明所述罗汉果甜苷v精制母液来源于以罗汉果提取物为原料，用有机溶剂结晶制备高纯度罗汉果甜苷v时所产生的母液。
优选地，步骤（1）中，所述罗汉果甜苷v精制母液、水和正丁醇的质量比为1:5～10:4～30（更优选1:5～10:5～15）。本发明人研究发现，加入的水可溶解水溶性的杂质、色素以及无机盐等，通过保留在水层中以除去，而加入的正丁醇对总苷的溶解度适中，且可与水分层，实现杂质与总苷的分离，这是其它溶剂无法替代的。若正丁醇的用量过少，则总苷的萃取不彻底；若正丁醇的用量过多，将加大浓缩的任务量，并增加物料损耗。
优选地，步骤（2）、（3）中，所述减压浓缩的温度为70～90℃，减压浓缩的真空度为-0.06～-0.09mpa，浓缩至浓缩液的质量浓度为20～35%（更优选25～30%）。若浓缩后的浓缩液浓度过低，则达不到罗汉果苷ⅵ结晶的浓度，罗汉果苷ⅵ无法充分析出；若浓缩后的浓缩液浓度过高，则杂质也将析出，降低产品的纯度。
优选地，步骤（2）中，所述搅拌析晶的温度为15～30℃，转速为60～120r/min，时间为12～36h。在所述析晶条件下，使得析出的晶体为高纯的罗汉果甜苷ⅵ，而不会析出其它的甜苷或杂质。
优选地，步骤（3）中，所述水的用量为浓缩物质量的18～50倍（更优选20～30倍）。用水溶解的目的是使浓缩物以水溶液的状态通过聚酰胺层析柱层析，更有利于吸附。聚酰胺的吸附是“氢键原理”，只有与聚酰胺树脂形成氢键的物质才可吸附于其上，且树脂吸附有一个最佳的浓度，高于或低于此浓度都将导致吸附率下降，所以，若水的用量过少，水溶液中的总物质的浓度过高，则聚酰胺无法吸附11-o基苷v及黄酮、多酚等杂质，导致罗汉果甜苷v与11-o基苷v和杂质无法分离；若水的用量过多，则将延长上柱的时间，造成人力、物力的浪费。
优选地，步骤（3）中，所述聚酰胺的目数为50～200目，用量为浓缩物质量的4～20倍（更优选5～10倍），聚酰胺层析柱的高径比为1～20:1（更优选5～15:1）。使用聚酰胺的目的是吸附11-o基苷v，从而使11-o基苷v和罗汉果甜苷v分离。若聚酰胺的用量过少，或层析柱的高径比过小，都将导致11-o基苷v无法充分的被吸附；若聚酰胺的用量过多，或层析柱的高径比过大，都将增加洗脱的难度和时间。
优选地，步骤（3）中，上柱的流速为0.5～2.0bv/h。本发明方法所述1bv=1个柱床体积。
优选地，步骤（4）中，所述低度醇溶液和高度醇溶液中的醇均为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇等中的一种或几种；所述低度醇溶液的体积浓度为10～40%（更优选15～30%），所述高度醇溶液的体积浓度为50～85%（更优选70～80%）。利用低度醇和高度醇的极性不同，进行梯度洗脱，梯度洗脱先用低度醇洗脱除去黄酮、多酚等杂质，再用高度醇将目标产品11-o基苷v洗脱并收集。
优选地，步骤（4）中，所述低度醇溶液的用量为2～5bv，高度醇溶液的用量为2～5bv；所述洗脱的流速均为0.5～2.0bv/h。
优选地，步骤（4）中，所述浓缩的温度为60～80℃，浓缩至浓缩液的质量浓度为25～45%。
优选地，步骤（4）中，所述析晶的温度为15～30℃，时间为12～36h。
本发明方法的原理为：罗汉果甜苷v精制母液的成分除了含有少量罗汉果甜苷v之外，主要的成分是11-o基苷v和罗汉果甜苷ⅵ。在同时提取罗汉果甜苷ⅵ、罗汉果苷v和11-o基苷v时，由于罗汉果甜苷ⅵ在母液中所占比例高，且其极性比其它两种甜苷都小，可在正丁醇中结晶析出，所以首先提取出罗汉果甜苷ⅵ；11-o基苷v因其特有的结构可与聚酰胺形成氢键，因此可以吸附于聚酰胺层析柱，而罗汉果甜苷v不能与聚酰胺形成氢键，所以聚酰胺对罗汉果甜苷v不吸附，因而得以分离。
本发明方法的有益效果如下：
（1）本发明方法所得罗汉果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均为白色粉末，经高效液相色谱法检测，罗汉果甜苷ⅵ的纯度≥97%，收率≥83%，罗汉果甜苷v的纯度≥89%，收率≥89%，11-o基苷v的纯度≥96%，收率≥85%；实现了同时从罗汉果甜苷v精制母液中提取罗汉果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v，提高了罗汉果资源的利用率，增加了产品的附加值；
（2）本发明方法采用的分离和提纯方式条件温和，安全环保，对设备无特殊要求，适宜产业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的罗汉果甜苷v精制母液来源于湖南华诚生物资源股份有限公司以罗汉果提取物为原料，用有机溶剂结晶制备高纯度罗汉果甜苷v时所产生的母液，经高效液相色谱外标法检测，其中，罗汉果甜苷ⅵ的质量含量为20.1%，罗汉果甜苷v的质量含量为10.9%，罗汉果11-o基苷v的质量含量为15.5%；本发明实施例所使用的聚酰胺树脂（目数为50～100目）购于中国医药集团上海化学试剂公司；本发明实施例所使用的原料和化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
实施例1
（1）正丁醇萃取：将100g罗汉果甜苷v精制母液用500g水溶解，加入500g正丁醇进行萃取，分离水层，得正丁醇层；
（2）浓缩析晶：将步骤（1）所得正丁醇层在80℃、真空度为-0.07mpa下，减压浓缩至浓缩液的质量浓度为25%，冷却，在15℃，转速120r/min下，搅拌析晶12h，过滤，得晶体和正丁醇析晶母液，将晶体干燥，得18.2g罗汉果甜苷ⅵ；
（3）聚酰胺层析：将步骤（2）所得正丁醇析晶母液在80℃、真空度为-0.07mpa下，减压浓缩至无醇，将所得70g浓缩物用1750g水溶解，以1bv/h的流速通过聚酰胺层析柱（其中，聚酰胺的用量为420g，层析柱的高径比为10:1），收集上柱流出液，在80℃、真空度为-0.07mpa下，减压浓缩，干燥，得10.8g罗汉果甜苷v；
（4）梯度洗脱：先用2bv体积浓度为20%的乙醇溶液，以0.5bv/h的流速对步骤（3）过柱后的聚酰胺层析柱进行洗脱，再用4bv体积浓度为80%的乙醇溶液，以0.5bv/h的流速进行洗脱，收集体积浓度为80%的乙醇溶液的洗脱液，在65℃下，浓缩至浓缩液的质量浓度为30%，冷却，在25℃下，析晶24h，过滤，干燥，得13.8g罗汉果11-o基苷v。
本实施例所得罗汉果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均为白色粉末，经高效液相色谱外标法检测，所得罗汉果甜苷ⅵ的纯度为97.5%，收率为88.28%；罗汉果甜苷v的纯度为91.9%，收率为91.06%；罗汉果11-o基苷v的纯度为98.2%，收率为87.43%。
实施例2
（1）正丁醇萃取：将200g罗汉果甜苷v精制母液用1600g水溶解，加入2400g正丁醇进行萃取，分离水层，得正丁醇层；
（2）浓缩析晶：将步骤（1）所得正丁醇层在85℃、真空度为-0.08mpa下，减压浓缩至浓缩液的质量浓度为30%，冷却，在30℃，转速80r/min下，搅拌析晶36h，过滤，得晶体和正丁醇析晶母液，将晶体干燥，得34.3g罗汉果甜苷ⅵ；
（3）聚酰胺层析：将步骤（2）所得正丁醇析晶母液在85℃、真空度为-0.08mpa下，减压浓缩至无醇，将所得135g浓缩物用2700g水溶解，以0.5bv/h的流速通过聚酰胺层析柱（其中，聚酰胺的用量为1350g，层析柱的高径比为8:1），收集上柱流出液，在85℃、真空度为-0.08mpa下，减压浓缩，干燥，得20.8g罗汉果甜苷v；
（4）梯度洗脱：先用3bv体积浓度为15%的甲醇溶液，以1bv/h的流速对步骤（3）过柱后的聚酰胺层析柱进行洗脱，再用5bv体积浓度为75%的甲醇溶液，以1bv/h的流速进行洗脱，收集体积浓度为75%的甲醇溶液的洗脱液，在60℃下，浓缩至浓缩液的质量浓度为35%，冷却，在15℃下，析晶18h，过滤，干燥，得27.3g罗汉果11-o基苷v。
本实施例所得罗汉果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均为白色粉末，经高效液相色谱外标法检测，所得罗汉果甜苷ⅵ的纯度为98%，收率为83.62%；罗汉果甜苷v的纯度为93.5%，收率为89.21%；罗汉果11-o基苷v的纯度为96.9%，收率为85.33%。
实施例3
（1）正丁醇萃取：将150g罗汉果甜苷v精制母液用900g水溶解，加入900g正丁醇进行萃取，分离水层，得正丁醇层；
（2）浓缩析晶：将步骤（1）所得正丁醇层在75℃、真空度为-0.06mpa下，减压浓缩至浓缩液的质量浓度为30%，冷却，在25℃，转速60r/min下，搅拌析晶24h，过滤，得晶体和正丁醇析晶母液，将晶体干燥，得25.8g罗汉果甜苷ⅵ；
（3）聚酰胺层析：将步骤（2）所得正丁醇析晶母液在75℃、真空度为-0.06mpa下，减压浓缩至无醇，将所得100g浓缩物用2000g水溶解，以1.5bv/h的流速通过聚酰胺层析柱（其中，聚酰胺的用量为500g，层析柱的高径比为15:1），收集上柱流出液，在75℃、真空度为-0.06mpa下，减压浓缩，干燥，得16.9g罗汉果甜苷v；
（4）梯度洗脱：先用3bv体积浓度为30%的异丙醇溶液，以1.5bv/h的流速对步骤（3）过柱后的聚酰胺层析柱进行洗脱；再加入5bv体积浓度为70%的异丙醇溶液，以1.5bv/h的流速进行洗脱，收集体积浓度为70%的异丙醇溶液的洗脱液，在75℃下，浓缩至浓缩液的质量浓度为40%，冷却，在30℃下，析晶36h，过滤，干燥，得20.2g罗汉果11-o基苷v。
本实施例所得罗汉果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均为白色粉末，经高效液相色谱外标法检测，所得罗汉果甜苷ⅵ的纯度为97.1wt%，收率为83.09%；罗汉果甜苷v的纯度为89.6%，收率为92.61%；罗汉果11-o基苷v的纯度为97.9wt%，收率为85.06%。