一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法与流程

本发明涉及生物鉴定领域，具体地说，涉及一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法。

技术背景

果枝是指棉花植株上能结棉铃的分支，一般着生于主茎的中上部。I式果枝是棉花中有限果枝的一种，只有1到2个果节，节间很短。在棉花生产中，I式果枝品种一经打顶就终止了棉株果枝、果节的增多，使得营养集中供给棉铃，使棉铃加速发育，集中吐絮，具有更好的成熟一致性；另外果枝短，适于密植，省去了整枝管理环节，在管理过程中可以大幅度的降低人工，且更加适合机械化采摘。

然而，由于I式果枝为单隐性基因控制，其回交转育过程需要进行大量的自交鉴定试验确定棉株的果枝特征，耗费大量的时间、人力和物力，且正常果枝植株易受环境因素的影响变成类似于I式的果枝，在选育过程中从表型难以区分。因此，亟待设计一种简单方便，干扰因素小，准确度高的方法，能在育种过程中从杂合状态的单株中鉴定出含有陆地棉I式果枝基因的材料。

SNP(Single nucleotide polymorphisms)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的突变所引起的基因多态性，在真核生物基因组中均存在并且含量非常丰富，具有多态性丰富、稳定性好、位点专一性、共显性等特点，能直观的从遗传物质上反映不同个体的核苷酸序列上的差异。目前，随着棉花基因组测序的完成，越来越多的SNP标记得到开发和应用，本发明的关键核心也来自SNP位点的开发和应用。

SNP恰好位于限制性酶切位点的情况比较少见，在酶切扩增多态性序列(CAPS)标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，则可以结合SNP位点引入新的限制性内切酶作用位点，产生和CAPS标记类似的多态性，这就是dCAPS的方法。用CAPS或dCAPS的方法可以将SNP位点转化成以PCR为基础的分子标记。

海岛棉中已经有了鉴定有限果枝中簇生铃果枝的基因鉴定方法，但是陆地棉与海岛棉属于不同的栽培种，染色体组分别为(AD)₁和(AD)₂。海岛棉中得到的鉴定方法并不适用于来源于陆地棉的I式果枝基因位点。陆地棉I式果枝的分子鉴定方法目前还没有报道。除了采用本发明提供的一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法能鉴定陆地棉果枝类型外，目前还没有其他方法。

技术实现要素：

基于现有技术的不足，本发明提供一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，通过设计dCAPS引物并结合酶切技术将扩增片段从SNP位点处切开，进而得到特异性酶切片段，通过一个碱基差异即可鉴定陆地棉I式果枝共分离基因，并且鉴定准确度高，结果可靠。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对棉花进行DNA提取；

(2)根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中的SNP位点设计dCAPS引物，所述dCAPS引物如下：

正向引物SEQ ID No.1：5’-TTCAACACCAACAAGCAGGT-3’；

反向引物SEQ ID No.2：5’-GGTCACTAGGACCAGGAACAA-3’；

并且以步骤(1)得到的DNA为模板进行PCR扩增；

(3)使用限制性内切酶Mun I对步骤(2)得到的产物进行酶切，37℃水浴2-4个小时；

(4)对步骤(3)得到的酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并进行染色，根据226bp处的特异性酶切条带判断I式果枝共分离基因的有无。

进一步地，所述步骤(1)中，棉花DNA的提取方法如下：

(a)取棉花材料真叶期幼嫩未展开叶片一片，加入DNA提取液，电钻或磨样机研磨充分后进行离心；

(b)弃去步骤(a)中离心后的上清液，加入DNA裂解缓冲液，混匀后置于水浴锅中进行水浴；

(c)将步骤(b)中的裂解混合物从水浴中取出，加入氯仿与异戊醇的混合溶剂颠倒混匀，静置后于离心；

(d)吸取步骤(c)中离心后的上清液，加入与所述上清液等体积的冰异丙醇，静置待絮状DNA成团析出，挑出絮状物，用70％乙醇清洗2到3次，最后将离心管倒置，使DNA风干，加入ddH₂O于温室溶解后测定浓度，并稀释到25ng/μl，-20℃保存备用。

进一步地，所述DNA提取液成分为：0.35M葡萄糖，0.1M Tris-HCl，5mM EDTA-Na，2％PVP，1％(V/V)β-巯基乙醇，pH值为8.0。

进一步地，所述DNA裂解缓冲液成分为1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，20mM EDTA-Na，2％CTAB，2％PVP，1％(V/V)β-巯基乙醇，pH值为8.0。

进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增的反应体系为：模板1μl，10mM正向引物1μl，10mM反向引物1μl，10×PCR Buffer 1μl，10mM dNTPs 0.2μl，25mM MgCl₂1μl，2U/μl TaqDNA聚合酶0.1μl和ddH₂O 4.7μl。

进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增的循环程序为：95℃预变性3min，95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

进一步地，所述步骤(3)中酶切反应体系为：Mun I 1μl、10×M Buffer 2μl、0.1％BSA2μl、DNA3μl、灭菌水2μl。

进一步地，所述步骤(4)中的具体方法为：向步骤(3)得到的酶切产物中加入2μl上样缓冲液，于8％的聚丙烯酰胺凝胶、1×TBE的电泳缓冲液中进行电泳检测；电泳结束后将聚丙烯酰胺凝胶置于染色液中染色10min，用蒸馏水快速清洗两遍，置于显色液中显色10min，待电泳条带清晰后，使用蒸馏水清洗两遍即可。

进一步地，所述染色液为将0.5ml浓度为40％的硝酸银加入200ml纯水中即得。

进一步地，所述显色液为3g氢氧化钠和1ml甲醛溶于200ml蒸馏水中混合均匀制得。

有益效果：本发明公开了一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法，根据与陆地棉果枝形态共分离的基因Gorai.001G121800_ATC中位于第2外显子的第17个碱基处的SNP位点设计dCAPS引物，通过一个碱基错配引入酶切位点，进而使DNA自SNP位点切开，具有G→A突变的片段就被切成了22bp和226bp，没有G→A突变的SNP位点无法切开。因此根据酶切后226bp处电泳条带的有无即可判断是否为具有G→A突变的陆地棉I式果枝共分离基因。本发明通过一个SNP位点的差异就能鉴定出材料目的性状的区别，鉴定效率高；引入限制性内切酶酶切位点后，酶切出特异性条带，鉴定结果的准确度高；鉴定过程操作简单，可公式化，易于推广应用。

附图说明

图1为本发明实验材料“鄂抗棉13”棉株；

图2为本发明实验材料“X1570”棉株；

图3为本发明SNP位点及dCAPS引物在ATC基因中的位置示意图；

图4为本发明限制性内切酶Mun I的酶切位点；

图5为本发明实验材料及其杂交后代的基因特异标记分析；其中，各泳道为：M：Marker；p₁：陆地棉I式果枝品种“X1570”；p₂：正常果枝品种“鄂抗棉13”；3-32：“X1570”与“鄂抗棉13”杂交F₂群体中随机挑选的30株I式果枝棉株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详述：

实施例

1.提取DNA

取陆地棉品种“X1570”、“鄂抗棉13”以及“X1570”与“鄂抗棉13”的杂交F₂群体中随机挑选的30株I式果枝棉株为实验材料。如图1-2所示，陆地棉品种“X1570”为湖北省农业科学院经济作物研究所从“岱字棉15”中发现的早熟变异材料“鸭棚棉”经过系统选育得到的早熟品种，属I式果枝类型，其生育期95-100天；“鄂抗棉13”为湖北省国营三湖农场农科所选育成的中熟品种，生育期122.1天，属正常果枝类型。

携带冰盒取田间生长的真叶期棉株未完全展开的幼嫩叶片，置于2ml的离心管中，加入600μl提取液，电钻或磨样机研磨充分，并且于4℃下10000rpm离心10min。加入提取液以去除棉酚，防止氧化，提取液为0.35M葡萄糖、0.1M Tris-HCl、5mM EDTA-Na、2％PVP、1％(V/V)β-巯基乙醇，其pH值为8.0。

弃去离心后的上清液，加入600μl DNA裂解缓冲液，用灭菌枪头或牙签混匀，于65℃水浴40min，水浴期间翻转混匀3-4次以保证充分裂解。DNA裂解缓冲液为1.4M NaCl、0.1M Tris-HCl、20mM EDTA-Na、2％CTAB、2％PVP、1％(V/V)β-巯基乙醇，其pH值为8.0。

将裂解混合物从水浴中取出，加入600μl体积比24:1的氯仿与异戊醇的混合溶剂进行抽提，轻轻反复颠倒60下，置于4℃或室温静置30min，然后于4℃下10000rpm离心10min。

吸取离心后的上清液，加入与上清液等体积的冰异丙醇，混合均匀后静置30min；待絮状DNA成团析出，吸除异丙醇，加入70％乙醇对絮状DNA进行悬浮浸洗，浸洗时间10min；重复浸洗两次后加入无水乙醇浸泡过夜，离心后弃去液体，将离心管倒置，加入ddH₂O于温室溶解2h后测定浓度，并稀释到25ng/μl，-20℃保存备用。

2.dCAPS引物标记扩增

如图3所示的陆地棉果枝形态共分离基因Gorai.001G121800_ATC中，与“鄂抗棉13”基因相比，“X1570”的SNP位点发生G→A突变，根据该基因第2外显子的第17个碱基处的SNP位点设计dCAPS引物，其中：

正向引物SEQ ID No.1：5’-TTCAACACCAACAAGCAGGT-3’；

反向引物SEQ ID No.2：5’-GGTCACTAGGACCAGGAACAA-3’。

以提取的棉花DNA为模板，进行PCR扩增，扩增的反应体系为：模板1μl，10mM正向引物1μl，10mM反向引物1μl，10×PCR Buffer 1μl，10mM dNTPs0.2μl，25mM MgCl₂1μl，2U/μl TaqDNA聚合酶0.1μl和ddH₂O 4.7μl。扩增循环程序为：95℃预变性3min，95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

3.Mun I酶切

扩增结束后，对扩增产物进行酶切，37℃水浴2-4个小时；酶切反应体系为：Mun I 1μl，10×M Buffer 2μl，0.1％BSA2μl，DNA 3μl，灭菌水2μl，共10μl；其中，Mun I的同裂酶为Mfe I，其酶切位点如图4所示。

4.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

酶切结束后，向酶切产物中加入2μl上样缓冲液溴酚蓝混匀，并且进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，电泳缓冲液为1×TBE，电泳电压为220伏，时间为80min。

电泳结束后，将0.5ml浓度为40％的硝酸银加入200ml纯水中制得染色液，并将聚丙烯酰胺凝胶置于染色液中染色10min，用蒸馏水快速清洗两遍，置于含1.5％氢氧化钠和0.5％甲醛的显色液中显色10min，待电泳条带清晰后，使用蒸馏水清洗两遍即可。

如图5所示，“X1570”以及“X1570”与“鄂抗棉13”杂交的30株F₂棉株于226bp处均出现特异性酶切条带，验证了其含有陆地棉I式果枝共分离基因；“鄂抗棉13”电泳条带226bp处未出现，验证了其不含陆地棉I式果枝共分离基因。由此证明了本发明鉴定结果准确可靠。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省农业科学院经济作物研究所

<120> 一种陆地棉I式果枝的分子鉴定方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttcaacacca acaagcaggt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtcactagg accaggaaca a 21