一种与谷子米色连锁的SNP标记、引物及应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与谷子米色连锁的snp标记、引物及应用。

背景技术：

我国是谷子(小米)的原产地和世界上栽培面积最大、产量最高的国家，产量约占全世界总量的80％。同时，我国也是谷子遗传资源数量最多、多样性最丰富的国家。

米色、氨基酸含量等是影响谷子品质的重要因子，研究与谷子品质性状相关的基因及其位置功能等，对于指导谷子遗传育种具有重要的意义。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是基因组水平上由单个核苷酸碱基的变异引起的dna序列多态性，其在基因组中数量多，分布广泛，遗传稳定性好。随着基因测序技术的发展和成本的降低，对不同个体同一基因或基因片段进行直接测序和序列比较，就能够确定碱基是否存在变异。因此，snp检测有利于基因分型，适用于快速和规模化地筛查未知或已知snp与某遗传性状的关系。

目前主要利用ssr标记定位谷子性状相关的qtl，与snp标记相比，ssr标记数量少，对整个基因组覆盖度低，且自动化程度低，而利用谷子f2群体的简化基因组测序检测多态性的snp分子标记的开发应用研究不多。

开发与谷子品质、产量等相关性状的snp分子标记，对谷子辅助选育体系的建立具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供的一种与谷子米色连锁的snp标记、引物及应用，可以对谷子米色进行良好分型，用于谷子米色性状的分子标记辅助育种。

本发明提供了一种与谷子米色连锁的snp标记，包括hc-06-436标记和hc-06-250标记，所述hc-06-436标记位于谷子第六染色体第34024436bp位，所述hc-06-250标记位于谷子第六染色体第34035250bp位。

本发明还提供了一种根据上述与谷子米色连锁的snp标记的扩增引物：

所述hc-06-436的扩增引物为：

hc-06-436f：5’-tgtcatcatctgctccttcg-3’；

hc-06-436r：5’-gaggatgaggatcacggatg-3’；

所述hc-06-250的扩增引物为：

hc-06-250f：5’-cgttgagatggctgagttga-3’；

hc-06-250r：5’-ctcctttctcctggatggtg-3’。

本发明还提供了一种根据上述与谷子米色连锁的snp标记，在谷子米色性状的分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种根据上述与谷子米色连锁的snp标记扩增引物，在谷子米色性状的分子标记辅助育种中的应用。

本发明利用定位的谷子米色的qtl，根据位点序列信息开发鉴定谷子米色的snp特异性标记，开展谷子米色性状snp分子标记(hc-06-436标记和hc-06-250标记)的开发，提供的hc-06-436的扩增引物和hc-06-250的扩增引物可以对谷子米色进行良好分型，检测snp多态性表达的差异，可以用于谷子米色性状的分子标记辅助育种，为实现谷子米色性状的早期鉴定、筛选和育种提供分子辅助技术支持，对于加快谷子优质品种的选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。

附图说明

图1是谷子父母本基因组dna电泳胶图；

其中，m是d2000mark，p1是母本“黑枝谷”基因组dna条带，p2是父本“长农35号”基因组dna条带；

图2是谷子父母本的pcr扩增产物电泳胶图；

其中，m是d2000mark，13-3p1是：以hc-06-436f和hc-06-436r为引物，以母本“黑枝谷”基因组dna为模板的pcr扩增条带；13-3p2是：以hc-06-436f和hc-06-436r为引物，以父本“长农35号”基因组dna为模板的pcr扩增条带；13-4p1是：以hc-06-250f和hc-06-250r为引物，以母本“黑枝谷”基因组dna为模板的pcr扩增条带；13-4p2是：以hc-06-250f和hc-06-250r为引物，以父本“长农35号”基因组dna为模板的pcr扩增条带。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、分子标记的获得

1、遗传群体的构建

选择由山西省农业科学院谷子研究所选育的黄米色长农35号与青米色黑枝谷作为亲本材料，杂交后鉴定f1，共得到144个f2单株。采用穴播方式，将f2种植于山西农科院谷子研究所试验田，行长6m，行距0.33m，株距15cm，双亲各1行，田间试验中的栽培管理措施同当地大田管理一致。

2、谷子f2群体建库测序

2.1、dna的提取

针对上一步中获得的144个谷子f2单株，用ctab法分别提取父母本及144个谷子f2单株的基因组dna，具体方法如下：

(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3ml1.5×ctab，研磨成匀浆转入15ml的离心管中，然后往研钵中加入1ml1.5×ctab冲洗，再转入离心管中，混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×ctab配方如下(1l)：15g的ctab、75ml的1mol/ltris.cl(ph为8.0)、30ml的0.5mol/ledta、61.4g的nacl，加去离子水定容至1l，使用前加入2ml的巯基乙醇，使巯基乙醇的终浓度为0.2ml/100ml。

(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1，v/v)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15ml离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀dna。

(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥dna，加入200μlte溶解dna。

(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组dna，谷子父母本基因组dna电泳胶图见图1。其中，m是d2000mark，p1是母本“黑枝谷”基因组dna条带，p2是父本“长农35号”基因组dna条带。

(6)将得到的父母本及144个谷子f2单株的基因组dna存于-20℃备用。

2.2、基因组连锁图谱的构建

利用radseq方法，提取上述146个样本(144个f2、2个亲本)个体的基因组dna并进行dna质量检测，对合格的dna进行酶切，电泳回收dna片段，并加上接头进行cluster制备，最后上机测序。具体包括：

(1)检测基因组dna的浓度，并用水调整为20ng/μl。

(2)采用ecori酶对基因组dna进行酶切，打断基因组dna，得到酶切产物。其中，酶切体系如表1所示。酶切温度为65℃，时间为10min。

表1酶切反应体系

(3)对上一步中的酶切产物进行连接反应，得到连接产物，其中连接体系如表2所示，22℃连接反应1h，65℃、30min使失活t4dna连接酶。

表2连接反应体系

(4)用3％琼脂糖凝胶电泳1h，eb染色后切取300-700bp大小片段。用qiaquickkit进行胶纯化回收，回收产物溶于30μlebsolution，得到电泳产物。

(5)磁珠纯化，完成建库。具体纯化方法为：

首先向pcr产物中加入1.2倍体积磁珠，静置10min。然后，置于磁力架上吸附，去除上清。然后，加入500μl70％酒精洗涤两次。之后，干热仪上蒸干后，加入15μleb溶解，5min。最后，磁力架上吸附，转移上清于1.5ml离心管中。

(6)检测达到上机标准后上机测序。

对146个样本(144个f2、2个亲本)进行建库测序，得到28.83gb原始数据，平均每个个体197.44mb。将测序序列比对到参考基因组上，平均比对率84.08％，平均覆盖率8.99％，平均测序深度为3.89x。

(7)构建基因组连锁图谱

通过测序和信息分析，获得亲本间有多态的46256个snp标记。根据窗口滑动的方法，选取若干个snp为一个窗口，每次滑动一个snp确定每个窗口的基因型以及每个个体的交换位点。最后生成bin基因型和bin图。准备好的bin基因型数据，用mstmap软件构建遗传图谱，1694个bin定位到9条染色体上，再将遗传图谱数据导入到mapchart软件，整合一张基因组连锁图谱。

3、pcr反应

a.pcr反应体系：25μl体系，各组分物质的含量分别为:1μl模板dna、0.5μl引物f、0.5μl引物r、0.15μldntps、0.15μltaqdna聚合酶(活力单位0.5u)、2.5μl10×pcrbuffer、ddh2o补齐25μl，混匀，离心，

其中，引物f和引物r为两对引物连锁使用，第一对引物为：

引物f为hc-06-436f：5’-tgtcatcatctgctccttcg-3’；

引物r为hc-06-436r：5’-gaggatgaggatcacggatg-3’；

第二对引物为，

引物f为hc-06-250f：5’-cgttgagatggctgagttga-3’；

引物r为hc-06-250r：5’-ctcctttctcctggatggtg-3’。

b.扩增程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟，4℃保存；

接着，将各pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，其中谷子父母本的pcr扩增产物电泳结果见图2，其中13-3p1是：以hc-06-436f和hc-06-436r为引物，以母本“黑枝谷”基因组dna为模板的pcr扩增条带；13-3p2是：以hc-06-436f和hc-06-436r为引物，以父本“长农35号”基因组dna为模板的pcr扩增条带；13-4p1是：以hc-06-250f和hc-06-250r为引物，以母本“黑枝谷”基因组dna为模板的pcr扩增条带；13-4p2是：以hc-06-250f和hc-06-250r为引物，以父本“长农35号”基因组dna为模板的pcr扩增条带。

4、与谷子米色连锁的snp分子标记的获得

利用所构建的基因组连锁图谱，采用复合区间作图分析(cim)，对谷子米色性状表型进行qtl分析。qtl检测采用5％的总体显著水平，根据500次排列检验结果，来确定米色性状表型数据qtl分析的临界lod值。分析得到与谷子米色相关的预测bin区间和snp位点信息。

根据预测的bin区间和snp位点，比对参考基因组，得到相关区域基因序列，选取snp位点前后300bp左右，设计开发snp标记引物。以父本“长农35号”和母本“黑枝谷”的基因组dna为模板进行pcr扩增。选择引物扩增正常，pcr产物符合预测大小的扩增产物，回收产物并进行测序，选择父本“长农35号”和母本“黑枝谷”扩增基因序列有snp位点差异的标记引物。分别以f1代和f2代材料为模版，进行snp标记引物pcr扩增和结果测序，选择符合基因分型和与表型性状相关的标记引物。

最终得到与谷子米色连锁的2个snp标记：hc-06-436和hc-06-250，他们均位于谷子第六染色体34024436bp至34035250bp区间内；所述hc-06-436标记位于谷子第六染色体第34024436bp位，所述hc-06-250标记位于谷子第六染色体第34035250bp位；

针对上述snp分子标记的扩增引物如下：

所述hc-06-436的扩增引物为：

hc-06-436f：5’-tgtcatcatctgctccttcg-3’(seqidno.1所示)；

hc-06-436r：5’-gaggatgaggatcacggatg-3’(seqidno.2所示)；

所述hc-06-250的扩增引物为：

hc-06-250f：5’-cgttgagatggctgagttga-3’(seqidno.3所示)；

hc-06-250r：5’-ctcctttctcctggatggtg-3’(seqidno.4所示)。

hc-06-436引物扩增得到的hc-06-436产物片段核苷酸序列如seqidno.5所示，谷子第六染色体第34024436bp位(对应seqidno.5第301位)碱基是g或者a(序列表seqidno.5中以[g/a]形式表示)，其中母本“黑枝谷”是a，父本“长农35号”是g；

hc-06-250引物扩增得到的hc-06-436产物片段核苷酸序列如seqidno.6所示，谷子第六染色体第34035250bp位(对应seqidno.6第301位)碱基是c或者t(序列表seqidno.6中以[c/t]形式表示)，其中母本“黑枝谷”是t，父本“长农35号”是c；

二、应用分子标记判断谷子米色

以母本“黑枝谷”和父本“长农35号”杂交得到的不同子代谷子基因组dna为模板，以hc-06-436f、hc-06-436r为引物，pcr获得扩增产物，回收产物hc-06-436片段(如seqidno.5所示)并进行测序；另外，以hc-06-250f、hc-06-250r为引物，pcr获得扩增产物，回收产物hc-06-250片段(如seqidno.6所示)并进行测序。

当子代的seqidno.5序列第301位只为a，且seqidno.6序列第301位只为t时，该单株谷子米色为青色；当子代的seqidno.5序列第301位只为g，且seqidno.6序列第301位只为c时，该单株谷子米色为黄色；当子代的seqidno.5序列第301位为a和g，且seqidno.6序列第301位为t和c时，该单株谷子米色为黄色。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>山西省农业科学院谷子研究所，华大小米有限公司，华大基因农业循环经济技术有限公司，延安市农业科学研究所

<120>一种与谷子米色相关的snp标记、引物及应用

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgtcatcatctgctccttcg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gaggatgaggatcacggatg20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgttgagatggctgagttga20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctcctttctcctggatggtg20

<210>5

<211>601

<212>dna

<213>谷子第六条染色体

<400>5

cgagaatctacggatgtaatcccgcaggggctcgttgggcttctgtttgcagctcttcag60

gtcccaggaattaccgggttggacgtatgtccccttgaaattcctgacgaagaccttctt120

gagttccgcccgatcgcggatgctgttgggtggaaggaactcgagccacactcgaacaaa180

ctcccctatgcagatggggaggtactaaatgatgaagttgtcatcatctgctccttcggc240

tcggtaggcgagtcggaagtattcaagccactcactggggttcgtctcctcggtatactt300

[g/a]gcgatgttggtgggcagtcagaagcgctatgggaatgccgctttctagattcgacgacc360

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gtggatgacactacgcgtgtcacggtttggccctatgcattcgtgcacggactggcgccg600

c601

<210>6

<211>601

<212>dna

<213>谷子第六条染色体

<400>6

atttatgggcatgtcgatccatcgctgatgggatatcaacaccatgtcagcaggtagcgt60

accaaagagggggggggggggggggggggggggatgaaatactcgcgtcacatgttgctc120

gcgaaccttaacgtccaaatgtttcttcgatgtaaaacattaacgtagttgaactgcaac180

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g601