本发明涉及一种鸭特异性cpgodn及其在制备鸭病毒病治疗药物中的应用，属于兽医药领域。
背景技术：
：近年，鸭坦布苏病毒（dtmuv）、禽流感、鸭瘟等鸭病毒病严重危害养鸭产业，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。疫苗是预防和控制病毒性疫病强有力的手段，但在实际生产中，时常会出现免疫失败或者在疫苗提供有效保护前就已发生感染的情况。所以迫切需要既能提高机体免疫力抑制病毒复制又能增强疫苗免疫效果的药物来预防和控制鸭病毒性传染病的发生和流行。cpg寡脱氧核苷酸（cpgoligonucleotide，cpgodn），是指含有非甲基化胞嘧啶(c)和鸟嘌呤(g)二核苷酸为核心序列的dna或寡脱氧核苷酸序列，其基序为5′-rd-cpg-yy-3′，是dna具备免疫刺激活性的结构基础。cpgodn被机体toll样受体（toll-likereceptors，tlr）识别后能够快速激活多种免疫细胞，作为免疫增强剂已得到广泛验证和应用。cpgodn在激活先天性免疫、增强疫苗免疫效果、治疗变态反应等方面均显示出较广阔的应用前景。cpgodn的免疫刺激作用具有种属特异性，小鼠最佳刺激活性的基序是5’-gacgtt-3’，而人和鸡的最佳刺激活性基序为5’gtcgtt3’。鸭的cpgodn研究较少，已有的研究表明，含5’-gtcgtt-3’基序的分子也可有效刺激鸭免疫反应的产生，但5’-gacgtt-3’基序的活性更强。除种属特异性外，cpgodn存在构效关系，即结构影响活性，骨架结构（含cpg基序的数量及位置）、侧翼序列、末端polyg修饰、连接序列均为分子活性的影响因素。目前，尚未见相关有效抑制病毒复制的鸭种属特异性cpgodn的研究。技术实现要素：针对目前预防和控制鸭病毒病发生和流行的药物缺乏等问题，本发明提供一种起效快、作用范围广、可增强疫苗免疫效果的鸭特异性cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn）。本发明的另一目的是提供一种上述鸭特异性cpgodn在制备治疗鸭病毒病药物中的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。一种鸭特异性cpg寡脱氧核苷酸（cpgodn），包含gacgtt基序且含有8-24个核苷酸。所述鸭特异性cpgodn包括1-4个重复gacgtt基序，优选为3个重复。所述鸭特异性cpgodn重复基序之间无连接序列。所述鸭特异性cpgodn中的磷酸二酯键部分或全部被硫代磷酸酯键取代。所述鸭特异性cpg-odn的gacgtt基序不位于所述鸭特异性cpgodn的5’端。作为优选，所述鸭特异性cpg-odn为seqidno.1所示的核苷酸序列。一种上述鸭特异性cpgodn在制备治疗鸭病毒病药物中的应用。上述治疗鸭病毒病药物为治疗鸭坦布苏病毒的药物。本发明具有以下优点：本发明合成的鸭种属特异性cpgodn活性序列，比已知鸭特异性cpgodn活性更强，能够有效抑制鸭坦布苏病毒的复制，体外抑制率可达95%左右，为dtmuv及其他鸭源病毒性疫病的治疗提供了新的手段和依据。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。实施例1鸭特异性cpgodn的合成。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成seqidno.1，seqidno.2和seqidno.3所示核苷酸序列，其中，磷酸二酯键全部被硫代磷酸酯键取代，分别命名为cpgodn-d1，cpgodn-d2和cpgodn-d3，其中cpgodn-d2和cpgodn-d3为对照序列。表1cpgodn序列实施例2鸭特异性cpgodn对鸭成纤维细胞的刺激增殖作用。为了检验cpgodn的种属特异性及其对鸭细胞的刺激增殖效果，进行其对鸭成纤维细胞（def）的刺激增殖试验，具体操作步骤如下：将密度为1×107个/ml的鸭成纤维细胞（def）加入96孔细胞板，每孔100μl，置于37℃、5%co2细胞培养箱中培养24h，使def贴壁并生长成单层细胞。将3条不同cpgodn用细胞培养液稀释后分别加入上述96孔板，每孔终体积120μl，cpgodn终浓度为20μg/ml，轻轻混匀后放入细胞培养箱继续培养48h。每条cpgodn重复6孔，同时添加磷酸缓冲液替代cpgodn的阴性对照和无细胞的dmem空白对照。在培养终止前4h，每个细胞孔加入mtt10μl，继续孵育4h，取出后弃上层营养液，按100μl/孔加入dmso，置于摇床上晃动10min，使结晶紫完全溶解。然后酶标仪上测定各孔od490的值。各cpgodn作用于def的效果以刺激指数(stimulationindex,si)来衡量，其计算方法为：sicpgodn=。计算不同序列cpgodn刺激下def增殖样品的od490平均值，并得到相应的刺激指数，如表2所示：与阴性对照和空白对照相比，cpgodn-d1-d3均可刺激细胞增殖，其中cpgodn-d1效果更显著，指数达到1.2432，而cpgodn-d2和cpgodn-d3仅为1.0359和1.028。3条cpgodn序列差异在于基序之间的连接序列，cpgodn-d1不含连接序列，而cpgodn-d2和cpgodn-d3分别含有两个和一个碱基，连接序列对分子活性的影响显著，但不存在规律性，即不能通过连接碱基数量的多少来判定效果的好坏。cpgodn-d2在已有研究中作为免疫增强剂进行了应用，而本发明设计的cpgodn-d1活性要显著强于cpgodn-d2，为后续的研究应用提供了更好的基础材料。表2不同序列cpgodn的刺激指数实施例3鸭特异性cpgodn-d1对dtmuv的抑制效果的测定。1.对培养载体毒性的测定由于dtmuv是在非洲绿猴肾（vero）细胞上培养增殖，因此进行cpgodn-d1对vero细胞毒性的测定。具体步骤如下：将cpgodn-d1用细胞培养液分别稀释成300、200、150、100、80、50、30、20、10μg/ml的浓度，加入vero细胞密度长成80%的96孔板中，每孔加100μl，各浓度重复6孔，同时设置对照组。培养72小时后每个细胞孔加入mtt10μl，继续孵育4h，取出后弃上层营养液，按100μl/孔加入dmso，置于摇床上晃动10min，使结晶紫完全溶解。用酶标仪测定各孔od490的值。结果以阴性对照为参照，测定值低于阴性对照表明对细胞产生毒性。表3cpgodn-d1对vero毒性浓度3002001501008050302010阴性od4900.20620.24250.2510.2650.2750.2440.24080.2310.19550.1695结果如表3所示，数据表明，在300μg/ml的浓度范围内，cpgodn-d1对vero细胞无毒性作用。2.对dtmuv的抑制效果的测定将生长状况良好的vero细胞接种于96孔板，分组进行cpgodn-d1不同浓度对病毒抑制效果的影响。药物处理组：待铺满单层时弃去营养液，加入100tcid50病毒液100μl，37℃吸附1.5h，洗涤后每孔加入含cpgodn-d2或cpgodn-d3的维持液（浓度均为30μg/ml）或含cpgodn-d1的维持液（浓度分别为40、30、20、10、5μg/ml），每个浓度重复6孔。病毒处理组：待铺满单层时弃去营养液，加入100tcid50病毒液100μl，37℃吸附1.5h，洗涤后加入100μl的维持液。细胞对照组：待铺满单层时弃去营养液，加入100μl的维持液。病毒对照组与细胞对照组均重复6孔。将各组置于37℃，5%co2的培养箱中培养72h。随后每孔加入5mg/ml的mtt10μl，37℃孵育4h，小心弃去孔内液体，每孔加入100μldmso，震荡10min后，读取od490数值，按照下式计算抑制率：抑制率（%）=×100%。结果如表4所示，表中数据表明，cpgodn-d1在30μg/ml的浓度下抑制病毒复制的效果最为显著，为95.48%，优于同浓度的cpgodn-d2和cpgodn-d3。表4不同浓度cpgodn-d1对dtmuv的抑制效果<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所<120>一种鸭特异性cpg寡脱氧核苷酸及其应用<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1tcgacgttgacgttgacgtt20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2tcgacgttgacgttttgacgtt22<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3tcgacgttgacgtttgacgtt21当前第1页12