本发明属于分子生物学领域，具体涉及大泷六线鱼单核苷酸多态性位点。
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：大泷六线鱼(学名：hexagrammosotakii)为六线鱼科六线鱼属的鱼类。分布于朝鲜、日本以及中国东海、黄海、渤海等海域，系冷温性近海底层鱼类。大泷六线鱼的食性很广，以底栖生物为主，也摄食小虾、小鱼。大泷六线鱼素以其味道鲜美肉质细腻而闻名，素有“北方石斑”之称，与其它鱼类相比大泷六线鱼的含水量较低(73.85％)，可食部分比值高，蛋白质含量极高(18.50％)，必需氨基酸含量高(7.25％)(kangbin)。大泷六线鱼是一种十分具有发展潜力的经济鱼种，但大泷六线鱼生长发育十分缓慢，体长一般约为15-25厘。大泷六线鱼性成熟较早，性成熟时间一般在2～3龄，雄鱼早于雌鱼，性成熟后体重增长放缓，体重拐点在3.6龄。目前，国内外有关大泷六线鱼的研究报道还比较少，主要集中在生物学地位、生态分布以及种群资源量，还有一些学者对其生理、生化等方面进行了研究。对于大泷六线鱼遗传学方面的研究相对较少，目前国外只有habib等人基于coi、coiii-nd3-nd4l和cytb对黄海和日本海附近群体遗传结构进行研究，国内的研究有刘奇和李莹等人关于大泷六线鱼遗传多样性的研究，但取样地都集中在黄渤海海域，且只使用了d-loop序列进行遗传多样性与遗传结构的分析，并未使用cytb或coi基因进行对比分析。未见大泷六线鱼单核苷酸多态性方面的研究。单核苷酸多态性标记(snp：simplenucleotidepolymorphism)，是一种广泛应用的遗传学领域的dna分子标记。snp是广泛存在真核生物基因组中的单核苷酸突变，一般有转换、颠换、缺失、插入四种形式，其中动物体中以转换颠换最为常见。单核苷酸多态性具有多态性高，提供的遗传信息多，pcr扩增效果重复性好，以及在基因组中分散分布等优点，常用于生物的遗传多样性分析，遗传图谱和杂交育种等。由于单核苷酸多态性研究所用dna的数量少，对样品要求低，因此，单核苷酸多态性分析在遗传学领域具有广泛的应用性。作为中国重要的渔业资源之一，开发大泷六线鱼与生长发育经济性状相关的snp标记研究是十分重要的。技术实现要素：本发明的目的在于提供与大泷六线鱼生长发育相关的单核苷酸多态性位点，本发明提供的单核苷酸多态性位点选自：seqnoid：1所示序列第177位等位基因为a/t，seqnoid：2所示序列第228位等位基因为g/a，seqnoid：3所示序列第228位等位基因为c/t，seqnoid：4所示序列第269位等位基因为a/g。本发明提供的单核苷酸多态性位点，其中与大泷六线鱼体长增长关联显著的单核苷酸多态性位点选自：seqnoid：1所示序列第177位等位基因为a/t，seqnoid：3所示序列第228位等位基因为c/tseqnoid：4所示序列第269位等位基因为a/g。本发明提供的单核苷酸多态性位点，其中与大泷六线鱼体重增长关联显著的单核苷酸多态性位点选自：seqnoid：2所示序列第228位等位基因为g/a，seqnoid：3所示序列第228位等位基因为c/t。本发明还提供所述单核苷酸多态性位点用于评估大泷六线鱼生长发育、大泷六线鱼选种或大泷六线鱼育种的用途。本发明提供一种大泷六线鱼单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：1)基因组dna的提取：采用天根海洋动物组织dna提取试剂盒2)单核苷酸多态性pcr扩增：利用assaydesign3.1软件设计单核苷酸多态性引物扩增大泷六线鱼基因组dna，获得其扩增产物。3)扩增产物检测：启动massarraynanodispenserrs1000点样仪，将纯化后的产物进行点样，并用maldi-tof质谱仪分析，检测结果使用typer4.0软件进行分析。4)遗传多样性分析：根据每个个体碱基类型取定基因型，利用popgene32计算遗传多样性参数。本发明体用提供能扩增出所述单核苷酸多态性位点的的引物对，引物对具有选自以下序列对所示的序列：seqidno：5和seqidno：6；seqidno：7和seqidno：8；seqidno：9和seqidno：10；seqidno：11和seqidno：12。本发明提供所述引物对在大泷六线鱼单核苷酸多态性位点检测中的用途。本发明提供了所述引物对在评估大泷六线鱼生长发育、大泷六线鱼选种或大泷六线鱼育种的用途。实施例一、单核苷酸多态性位点筛选首先采用2b-rad技术与高通量测序结合，对大泷六线鱼进行简化基因组测序，共发现158,733个snp，分布在27,404个序列标签中。通过blast比对筛选其中与生长发育相关且位于编码区域的snp位点，共得到21个snp位点。通过sequenom实验平台采用iplexgold技术及massarray系统检测了21个snp位点在四个地理群体中的多样性。四个地理群体所使用的样本分别采自大连(n39°25′，e122°51′，野生群体，29尾)，舟山(n30°03′，e122°37′，野生群体，20尾)，琅琊台(n35°30′，e119°58′，野生群体，30尾)，即墨(即墨山东省海洋生物研究院养殖场，养殖群体，60尾)，取尾鳍和肌肉组织，存放于95％的无水乙醇中，放于-80℃冰箱中备用。基因组dna的提取：使用北京天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组dna提取试剂盒提取大泷六线鱼样品基因组dna。具体流程如下：首先采用assaydesigner3.1软件进行引物设计，通过在四个地理群体120个样本中进行pcr扩增，而后扩增产物去盐后4000rpm离心4分钟，在芯片上点样，再点calibrant，并将芯片放到scout板上并放回compact中，使用massarray进行分析、质量控制及报告输出。报告结果采用popgene1.32计算等位基因数(observednumberofalleles，na)、有效等位基因数(effectivenumberofalleles，ne)、观望杂合度(observedheterozygosity，ho)、期望杂合度(expectedheterozygosity，he)、nei’氏多样性指数(nei′sgenediversityindex，nei)。多态信息含量(polymorphisminformationcontent，pic)计算公式为(式中pi和pj是第i和第j个等位基因频率，n是等位基因数目)。分析结果显示17个位点具有多态性，平均等位基因数为1.9524，平均有效等位基因数是1.4571，平均观望杂合度0.2158，平均期望杂合度为0.2432，平均多态信息含量为0.2517。二、snp位点与生长发育性状关联性研究在关联性研究中将多态性位点与大泷六线鱼体重体长增量的生长发育性状进行关联。在即墨样品中选取30尾鱼体重体长相近，年龄约在1龄左右的大泷六线鱼进行荧光鱼体t型外挂标签标记，分别记录初体重与初体长数据，在山东省海洋生物研究院即墨鳌山卫基地进行为期125天的养殖，期间每天喂食两次与养殖池内的海水保持循环，记录养殖结束后每个个体体重与体长数据。检测养殖群体中具有多态性的snp位点，利用统计软件spss对snp位点在30尾即墨养殖大泷六线鱼在不用基因型个体间的性状进行多重比较(lsd)，去除出现少于3次的基因型，保证每个位点分析价值。4个与生长相关的单核苷酸多态性位点pic值范围从0.3457～0.6084，平均为0.4600，有限等位基因数范围从1.8000～3.0958，平均为0.8682；观测杂合度0.2933～0.5115，平均值0.4089；期望杂合度0.4444～0.6770，平均值0.5554。4个位点均未偏离h-w平衡(p＞0.05)，最小等位基因频率均大于0.05，说明4个位点均未受到非随机交配的影响，且突变率较高，适合进行遗传学方面的研究，具有进一步研究的价值。与生长发育具有显著性关系的snp位点及其两翼序列如表1所示。位点单核苷酸多态性序列正向引物序列反向引物序列hos10seqidno：1seqidno：5seqidno：6hos13seqidno：2seqidno：7seqidno：8hos14seqidno：3seqidno：9seqidno：10hos17seqidno：4seqidno：11seqidno：124个单核苷酸多态性位点的多样性结果如表2所示。具有显著性的位点计算结果如表3所示，hos10中tt基因型的体长增长比较显著。hos13中gg基因型与其他基因型相比，与体重增量有着较为显著的关系。位点hos14中，体重增量上，位点缺失与其他基因型都没有明显差距：基因型tt比基因型cc、ct体重增长更快，差别极其显著；体长增量上，与其余几种基因型相比，tt基因型具有极其显著的影响。hos17位点中ga基因型的体长增量明显高于aa基因型，具有极显著的影响。总体来看hos13对于体重增长有着显著性影响，hos10与hos17对体长增长有着显著性影响，hos14则对体重体长增长都用影响。一个标记与多个性状相关联可能与体重与体长本身就具有一定联系有关。开发出的多态性位点与生长发育相关的位点在今后大泷六线鱼的生长发育、人工繁殖等研究提供参考价值。表3不同位点的不同基因型个体间生长性状的增量及多重性比较注：同列中不同字母数值间差异显著(p＜0.05)，大写字母表示差异及其显著(p＜0.01)。三、单核苷酸多态性位点引物本发明根据基于简化基因组测序(rad)利用二代测序技术所开发出的snp文库，根据blast中生长相关碱基序列的比对结果，并根据相关位点，设计了50对的筛选引物，在大泷六线鱼的20个个体中进行验证。单核苷酸多态性引物的验证扩增位于两端已知序列之间的dna区域。每个pcr循环，反应混合体系都在模板变性、引物退火和引物延伸三种不同温度下依序温育。该过程可使用一种可编程序的温度热循环仪而达到自动化。5μl体系：模板1μl，pcrmastermix4μl(water1.850μl，pcrbuffer0.625μl，mgcl20.325μl，dntp0.1000μl，primermix1.000μl，hotstartaq0.100μl)。将pcr产物用sap(shrimpalkalinephosphatase，碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dntps。反应程序：94℃30s，[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5cycles，72℃3min]40cycles，4℃保存，产物用树脂进行纯化。启动massarraynanodispenserrs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384-wellspectrochipbioarray上。将点样后的spectrochip芯片使用maldi-tof质谱仪分析，检测结果使用typer4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储媒介并递交生物信息室分析。使用软件popgene32进行遗传指标(等位基因(na：observednumberofalleles)、有效等位基因(ne：effectivenumberofalleles)、观测杂合度(observedheterozygosity)、期望杂合度(expectedheterozygosity)、香农遗传指数(shannon′sinformationindex(i))、nei氏多样性指数(nei′sgenediversityindex(nei))、多态信息含量(polymorphisminformationcontent(pic)))计算。4个单核苷酸多态性位点的多样性及引物见表4。表4其中tm是单核苷酸多态性的退火温度，na为等位基因数，ne为有效等位基因数，obs_het观望杂合度，exp-het为期望杂合度。pic为多态信息含量，i是香农指数，nei为nei氏多样性指数，pic为多态信息含量。本发明的4对引物对20个大泷六线鱼基因组dna进行扩增，遗传多样性分析结果表明每个单核苷酸多态性位点平均等位基因数为2.75，平均有效等位基因数是2.3381，平均观望杂合度0.4089，平均期望杂合度为0.5554。遗传杂合度(geneticheterozygosity)包括了观望杂合度和期望杂合度，表示群体某一特定基因位点上杂合子的比例，反应了群体遗传变异程度的大小。观测杂合度是指一个群体中观察到的杂合子所占的比例；期望杂合度则是指在哈温平衡假设下杂合度的期望值，也称为基因多样度(genediversity)，仅取决于等位基因频率。杂合度的数值越低，遗传一致性越高，遗传多样性越低，4个位点的杂合度处于相对较高的水平。4个位点均未偏离hw平衡，偏离hw平衡的原因可能是由于这些位点在繁殖时会受到选择的压力，进而影响不同等位基因产生的频率，或是由于非随机交配所导致的平衡偏离。4个位点的最小等位基因频率(minorallelefrequency，maf)均高于0.05突变率相对较高，较小的maf将会是统计效能降低，从而造成假阴性的结果，故而造成关联性研究的偏差根据计算结果得出，4对单核苷酸多态性引物可用于大泷六线鱼遗传多样性检测，数量性状遗传图谱，遗传连锁做图、以及家系和个体鉴定。本发明提供的4个单核苷酸多态性位点：seqnoid：1序列第177位等位基因a/t，seqnoid：2序列第228位等位基因g/a，seqnoid：3序列第228位等位基因c/t，seqnoid：4序列第269位等位基因a/g，均与大泷六线鱼生长发育性状显著性相关。同时验证了2b-rad技术开发大泷六线鱼单核苷酸多态性位点的可行性。本发明提供的snp位点能与大泷六线鱼生长发育相关，能有效用于大泷六线鱼评估大泷六线鱼生长发育、大泷六线鱼选种或大泷六线鱼育种。当前第1页12