一种单萜类化合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种单萜类化合物及其制备方法与应用。

背景技术：

炎症是机体对各种致炎因子的刺激及损伤产生的一种以防御适应为主的非特异性免疫反应。许多疾病的发病过程都与炎症有关，临床上常见的类风湿、关节炎、哮喘、创伤、烧伤、败血性休克、心衰等都有炎症介质（细胞因子）的参与。抗炎类药物能够阻断炎症介质的产生或释放，抑制炎性反应，从而治疗与炎症介质有关的疾病的药物。目前国内外针对急慢性炎症的治疗主要以抗生素类药物为主，这些药物的治疗虽然能收到良好的效果，但因耐药菌株的不断增加，有越来越多的病例尽管用抗生素治疗，病情却得不到有效控制，而且抗生素在临床应用中产生副作用的病例是屡见不鲜。部分炎症疾病系病毒感染所致，抗生素基本无效。近年来，中外研究人员逐渐将目光转向资源丰富、纯天然的中草药、民族药，希望从中寻找新的抗炎药物。目前从中草药、民族药中发现了白芥子苷、阿魏酸、升麻苷、槲皮苷、苦参生物碱、大黄素、鱼腥草素、南蛇藤素等一系列天然抗炎药物。这些天然药物表现出的良好抗炎活性日益证明从天然产物中筛选抗炎药物是一个很有前景的方向。

土荆芥(chenopodiumambrosioidesl.)为藜科(chenopodiaceae)藜属植物，别名鹅脚草、红泽兰、臭草、钩虫草、虱子草等，为彝族民间常用药物。全草入药，有祛风、除湿，杀虫，止痒，通经、止痛之功效，用于治疗皮肤风湿痹痛、钩虫、蛔虫、痛经、闭经、皮肤湿疹和蛇虫咬伤等症。我国藜属植物有19种原种和2个亚种，主要分布于盐碱地和北方干旱地区。该藜属植物化学成分主要含挥发油、倍半萜烯、甾体、黄酮、皂苷等类型化合物。目前对土荆芥植物及其化学成分的药理活性研究报道较少。本发明试图对土荆芥中具有抗炎作用的化合物做深入研究，以期发现其中的抗炎活性天然产物，为筛选高效、低毒的抗炎药物提供依据。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种单萜类化合物；第二目的在于提供所述的单萜类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的单萜类化合物的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的单萜类化合物是以土荆芥叶为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、sephadexlh-20柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式c10h16o2，命名为4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮（4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one），具有以下结构：

。

本发明的第二目的是这样实现的，是以土荆芥叶为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、sephadexlh-20柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：

a、浸膏提取：将土荆芥叶晾干粉碎得到0.1~0.2cm粒径大小的颗粒，加入土荆芥叶重量5~10倍的体积百分浓度85~100%乙醇溶液于温度64~74℃下回流提取3~5次，每次1.5~3h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至比重为1.1~1.3得到浸膏a；

b、有机溶剂萃取：将浸膏a中加入浸膏a重量3~5倍的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取5~7次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；

c、硅胶柱层析：

1）将乙酸乙酯萃取物b上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物b重量8~10倍，用体积比为50:1~0:1的氯仿-甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经tlc监测，合并相同的部分；

2）将1）中以50:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经浓缩至相对密度1.1~1.3得到浓缩液e，然后上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为浓缩液e体积8~10倍，用体积比100:1~10:1的氯仿-甲醇有机溶剂洗脱、浓缩，经tlc监测，合并相同的部分；

d、将2）中以50:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经浓缩至相对密度1.1~1.3后分别用sephadexlh-20柱层析和半制备高效液相色谱仪分离纯化，即得所述的单萜类化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮（4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one）。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的单萜类化合物在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用。

本发明所述的单萜类化合物有良好的抑制脂多糖（lps）诱导小鼠巨噬细胞（raw264.7）产生一氧化氮（no）的作用，可为医用工业提供有应用价值的先导化合物。

附图说明

图1是本发明化合物的结构式；

图2是本发明化合物高分辨质谱（hresi-ms)；

图3是本发明化合物的核磁共振氢谱（¹hnmr)；

图4是本发明化合物的核磁共振碳谱（¹³cnmr)；

图5是本发明化合物的hsqc相关谱；

图6是本发明化合物的hmbc相关谱；

图7是本发明化合物的cosy相关谱。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的单萜类化合物是以土荆芥叶为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、sephadexlh-20柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式c10h16o2，命名为4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮（4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one），具有以下结构：

。

本发明所述的单萜类化合物的制备方法，是以土荆芥叶为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、sephadexlh-20柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：

a、浸膏提取：将土荆芥叶晾干粉碎得到0.1~0.2cm粒径大小的颗粒，加入土荆芥叶重量5~10倍的体积百分浓度85~100%乙醇溶液于温度64~74℃下回流提取3~5次，每次1.5~3h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至比重为1.1~1.3得到浸膏a；

b、有机溶剂萃取：将浸膏a中加入浸膏a重量3~5倍的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取5~7次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；

c、硅胶柱层析：

1）将乙酸乙酯萃取物b上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物b重量8~10倍，用体积比为50:1~0:1的氯仿-甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经tlc监测，合并相同的部分；

2）将1）中以50:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经浓缩至相对密度1.1~1.3得到浓缩液e，然后上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为浓缩液e体积8~10倍，用体积比100:1~10:1的氯仿-甲醇有机溶剂洗脱、浓缩，经tlc监测，合并相同的部分；

d、将2）中以50:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经浓缩至相对密度1.1~1.3后分别用sephadexlh-20柱层析和半制备高效液相色谱仪分离纯化，即得所述的单萜类化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮（4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one）。

a步骤中所述的过滤是经80~120μm的滤纸进行过滤。

a步骤中所述的减压浓缩是在温度50℃以下的条件下用旋转蒸发仪进行减压浓缩。

b步骤中所述的蒸去溶剂是采用旋转蒸发仪蒸去溶剂。

c步骤1）中所述的氯仿-甲醇有机溶剂的体积配比为50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1和0:1。

c步骤2）中所述的氯仿-甲醇有机溶剂的体积配比为100:1、50:1、25:1、20:1、15:1和10:1。

d步骤中所述的分离纯化是将2）中以50:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液浓缩至相对密度1.1~1.3后经sephadexlh-20柱色谱，以甲醇作为流动相纯化后，经半制备高效液相色谱，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的c18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μl，收集28~32min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到所述的单萜类化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮（4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one）。

本发明所述的单萜类化合物的应用为所述的单萜类化合物在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用。

所述的单萜类化合物在制备预防和/或治疗急慢性炎症药物中的应用。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

材料来源：土荆芥采于云南昆明，经云南民族大学民族医药学院杨青松副教授鉴定为chenopodiumambrosioidesl.，标本保存于云南民族大学民族医药学院标本馆。

a.粉碎：将6kg土荆芥叶晾干粉碎成粒径0.10cm大小的颗粒，得土荆芥粉末，备用；

b.回流提取：将步骤a中制得的土荆芥粉末在65℃的温度下回流提取4次，每次2小时，每次用30kg85%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；

c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏580g，备用；

d、萃取：将580g浸膏混悬于1800ml水中，依次用1800ml石油醚、1800ml乙酸乙酯以及1800ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物90g、131g、230g。

e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物（130g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-fr.9共9个组分，fr.1为27.6g，fr.2为5.7g，fr.3为4.4g，fr.4为6.3g，fr.5为9.1g，fr.6为11.2g，fr.7为15.3g，fr.8为8.8g，fr.9为34.7g，fr.1(27.1g)经200-300目硅胶柱色谱，用体积比100:1、50:1、25:1、20:1、15:1及10:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-1-fr.1-6共6个组分，fr.1-1为5.4g，fr.1-2为6.2g，fr.1-3为3.3g，fr.1-4为1.8g，fr.1-5为2.8g，fr.1-6为4.1g，fr.1-2经sephadexlh-20柱色谱，以甲醇作为流动相纯化后得到fr.a-c共3个组分，fr.a为0.9g，fr.b为2.6g，fr.c为1.8g，fr.b经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的c18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μl，收集28~32min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)(17mg)。

实施例2

a.粉碎：将6kg土荆芥叶晾干粉碎成粒径0.15cm大小的颗粒，得土荆芥粉末，备用；

b.回流提取：将步骤a中制得的土荆芥粉末在70℃的温度下回流提取4次，每次1.5小时，每次用36kg88%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；

c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.1时，得浸膏576g，备用；

d、萃取：将576g浸膏混悬于2300ml水中，依次用2300ml石油醚、2300ml乙酸乙酯以及2300ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物87g、136g、219g。

e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物（136g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-fr.9共9个组分，fr.1为28.3g，fr.2为5.4g，fr.3为4.2g，fr.4为6.0g，fr.5为8.7g，fr.6为13.2g，fr.7为16.2g，fr.8为8.5g，fr.9为30.9g，fr.1(28.3g)经200-300目硅胶柱色谱，用体积比100:1、50:1、25:1、20:1、15:1及10:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-1-fr.1-6共6个组分，fr.1-1为5.7g，fr.1-2为5.8g，fr.1-3为3.9g，fr.1-4为1.6g，fr.1-5为3.1g，fr.1-6为4.4g，fr.1-2经sephadexlh-20柱色谱，以甲醇作为流动相纯化后得到fr.a-c共3个组分，fr.a为0.8g，fr.b为2.5g，fr.c为1.9g，fr.b经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的c18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μl，收集28~32min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)(18mg)。

实施例3

a.粉碎：将6kg土荆芥叶晾干粉碎成粒径0.2cm大小的颗粒，得土荆芥粉末，备用；

b.回流提取：将步骤a中制得的土荆芥粉末在74℃的温度下回流提取4次，每次2.5小时，每次用42kg92%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；

c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏588g，备用；

d、萃取：将588g浸膏混悬于2900ml水中，依次用2900ml石油醚、2900ml乙酸乙酯以及2900ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物92g、133g、232g。

e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物（133g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-fr.9共9个组分，fr.1为27.7g，fr.2为5.2g，fr.3为4.1g，fr.4为6.4g，fr.5为8.3g，fr.6为19.9g，fr.7为16.6g，fr.8为7.9g，fr.9为30.7g，fr.1(27.7g)经200-300目硅胶柱色谱，用体积比100:1、50:1、25:1、20:1、15:1及10:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-1-fr.1-6共6个组分，fr.1-1为4.7g，fr.1-2为5.2g，fr.1-3为3.6g，fr.1-4为1.8g，fr.1-5为3.4g，fr.1-6为5.6g，fr.1-2经sephadexlh-20柱色谱，以甲醇作为流动相纯化后得到fr.a-c共3个组分，fr.a为0.6g，fr.b为2.5g，fr.c为1.6g，fr.b经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的c18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μl，收集28~32min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)(19mg)。

实施例4

a.粉碎：将6kg土荆芥叶晾干粉碎成粒径0.2cm大小的颗粒，得土荆芥粉末，备用；

b.回流提取：将步骤a中制得的土荆芥粉末在72℃的温度下回流提取4次，每次3.0小时，每次用48kg95%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；

c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.1时，得浸膏590g，备用；

d、萃取：将590g浸膏混悬于2950ml水中，依次用2950ml石油醚、2950ml乙酸乙酯以及2950ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物95g、135g、227g。

e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物（135g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-fr.9共9个组分，fr.1为29.7g，fr.2为5.1g，fr.3为4.4g，fr.4为6.2g，fr.5为8.0g，fr.6为18.9g，fr.7为15.6g，fr.8为7.6g，fr.9为31.3g，fr.1(29.7g)经200-300目硅胶柱色谱，用体积比100:1、50:1、25:1、20:1、15:1及10:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-1-fr.1-6共6个组分，fr.1-1为5.3g，fr.1-2为4.9g，fr.1-3为3.5g，fr.1-4为1.7g，fr.1-5为3.6g，fr.1-6为5.8g，fr.1-2经sephadexlh-20柱色谱，以甲醇作为流动相纯化后得到fr.a-c共3个组分，fr.a为0.7g，fr.b为2.3g，fr.c为1.5g，fr.b经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的c18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μl，收集28~32min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)(20mg)。

实施例5

a.粉碎：将6kg土荆芥叶晾干粉碎成粒径0.15cm大小的颗粒，得土荆芥粉末，备用；

b.回流提取：将步骤a中制得的土荆芥粉末在68℃的温度下回流提取4次，每次2.0小时，每次用60kg100%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；

c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏595g，备用；

d、萃取：将595g浸膏混悬于3000ml水中，依次用3000ml石油醚、3000ml乙酸乙酯以及3000ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪减压浓缩，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物98g、136g、217g。

e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物（136g）经100-200目硅胶柱色谱，用体积比50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、7:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-fr.9共9个组分，fr.1为30.4g，fr.2为4.7g，fr.3为4.6g，fr.4为6.0g，fr.5为7.8g，fr.6为18.7g，fr.7为15.5g，fr.8为7.9g，fr.9为32.2g，fr.1(30.4g)经200-300目硅胶柱色谱，用体积比100:1、50:1、25:1、20:1、15:1及10:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到fr.1-1-fr.1-6共6个组分，fr.1-1为5.5g，fr.1-2为4.7g，fr.1-3为3.8g，fr.1-4为1.6g，fr.1-5为3.4g，fr.1-6为5.7g，fr.1-2经sephadexlh-20柱色谱，以甲醇作为流动相纯化后得到fr.a-c共3个组分，fr.a为0.6g，fr.b为2.3g，fr.c为1.4g，fr.b经半制备高效液相色谱仪制备，以体积配比为80:20的甲醇-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的c18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μl，收集28~32min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)(21mg)。

实施例6

取实施例1制备的4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)，为无色油状物；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。

[α]23.6d0(c=0.23，meoh)；ir(kbr)谱在3442,3386,3132,1676,1634cm^-1有吸收，表明分子中存在羧基、羟基和双键。hresi-ms(附图2)显示其准分子离子峰m/z168.1151[m]⁺(calcd.168.1150)，结合nmr谱确定其分子式为c10h16o2，不饱和度为3。¹hnmr(附图3，数据归属见表1)显示分子中有3个甲基信号，分别为δh1.76(d,j=1.4hz,h-7)，1.00(d,j=6.9hz,h-9)及0.96(d,j=6.9hz,h-10)，有1个三取代双键信号(δ6.62(s,h-15));¹³cnmr(附图4，数据归属见表1)显示分子中有10个碳，其中有3个季碳(含1个羰基碳、1个烯碳及1个连氧季碳，其化学位移值分别为δ202.2，136.1及72.8)，2个次甲基(δ150.8和38.2)，2个亚甲基(δ34.8和31.5)，及3个甲基(δ17.8、16.9及16.0)。结合hsqc相关谱(附图5)，并对比文献数据可证实，该化合物与已知化合物4-hydroxy-2,4-dimethyl-2-cyclohexen-1-one结构相似，区别在于分子中的4位碳连接一个异丙基，而不是甲基。进一步经hmbc相关(附图6)和cosy相关(附图7)及与文献(ochoame,ariasms,aguilarr,delgadof,tamarizj.captodativeolefin3-p-nitrobenzoyloxy-3-buten-2-oneasadiels-alderketeneequivalentforthesynthesisofhydroxycyclohexenones.tetrahedron.1999,55:14535-14546)对比证实，使化合物的结构最终得到确认，命名为4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)。

通过scifinder数据库检索和文献查询证实该化合物为新化合物。

表1本发明化合物的¹h-和¹³c-nmr(cdcl3)数据。

实施例7

取实施例2制备的化合物，为无色油状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为c10h16o2。确认实施例2制备的化合物为所述的单萜类化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)。

实施例8

取实施例3制备的化合物，为无色油状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为c10h16o2。确认实施例3制备的化合物为所述的单萜类化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)。

实施例9

取实施例4制备的化合物，为无色油状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为c10h16o2。确认实施例4制备的化合物为所述的单萜类化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)。

实施例10

取实施例5制备的化合物，为无色油状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为c10h16o2。确认实施例5制备的化合物为所述的单萜类化合物4-羟基-4-异丙基-2-甲基-2-环己烯-1-酮(4-hydroxy-4-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexen-1-one)。

实施例11本发明化合物抗炎活性检测

取实施例1~5所制备的任一单萜类化合物进行抗炎活性检测试验，试验情况如下：

采用lps诱导raw264.7细胞产生no的筛选模型评价本发明化合物对no生成的抑制作用：

(1)试剂的配制：d-hank’s缓冲溶液：称取nacl8.0g、kcl0.4g、na2hpo4•12h2o0.134g、kh2po40.06g、nahco30.35g、酚酞0.02g，加入超纯水约800ml使全溶，调节ph至7.0-7.2，超纯水定容至1l，过滤，分装，湿热(121ºc、20min)灭菌，4ºc贮存备用。

pbs缓冲溶液：称取nacl8.0g、kcl0.2g、kh2po40.27g、na2hpo4•12h2o3.58g，加入超纯水约800ml使全溶，调节ph至7.2-7.4，超纯水定容至1l，过滤，分装，湿热灭菌，4ºc贮存备用。

胰酶：胰酶1.25g、edta-na20.1g，用pbs缓冲溶液定容至500ml，所有操作在冰上完成。

化合物母液：化合物以dmso为溶剂配制成100mmol/l的母液，-20ºc贮存。

(2)接种细胞：取处于对数生长期的小鼠巨噬细胞(raw264.7)，用含10%胎牛血清的dmem培养液制成细胞悬液，以8*10⁴/孔接种于96孔板，每孔100μl，于恒温培养箱培养24h。

(3)加入待检测化合物：实验分为空白组(dmso+培养液)、lps组(lps+dmso+培养液)、阳性药物组(l-nmma+lps+dmso+培养液)和化合物组(不同剂量化合物+lps+培养液)，化合物组分为100、25、6.25、1.56、0.39μm五个剂量组；小心吸出残留培养液后，根据不同分组分别给予不同的试剂和培养液，总体积100μl；每组设置3个复孔，各组dmso含量均控制在1‰。继续培养24h。

(4)no含量检测：小心吸取上清液50l，加入griessi液50l，于摇床振摇10min，再加入griessii液50μl，继续振摇10min，在全波长酶联免疫检测仪540nm处读取吸光值，根据no2^—含量标准曲线(按照griess试剂盒说明书制作)计算出no含量。运用ibmspssstatistics21和graphpadprism5对数据进行单因素方差分析、计算ic50等。

计算得本发明化合物对lps诱导raw264.7细胞产生no的半数抑制浓度为16.8±4.1µg/ml(阳性对照l-单甲基精氨酸(l-nmma），ic50为15.6±3.3µg/ml)，表明本发明的化合物具有较好的抗炎活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。