球孢白僵菌菌株EHM‑068及其应用的制作方法

本发明涉及农作物害虫生物防治技术领域，尤其涉及一种球孢白僵菌菌株ehm-068及其应用。

背景技术：

二化螟(chilosuppressaliswalker)，属鳞翅目，螟蛾科，俗名钻心虫、蛀心虫、蛀秆虫等，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一。二化螟除为害水稻外，还能为害茭白、玉米、高粱、甘蔗、油菜、蚕豆、麦类以及芦苇、稗、李氏禾等杂草。二化螟幼虫通过蛀害水稻叶鞘、心叶、稻茎等部位造成枯鞘、枯心苗、白穗等危害，在成熟期则会造成半枯穗状虫伤株，导致严重减产。二化螟一般可导致水稻减产5％-10％，严重的高达20％-30％。

稻水象甲(lissorhoptrusoryzophiluskuschel)属鞘翅目，象虫科，沼泽象亚科，稻水象属，主要为害水稻等禾本科农作物的生长，其成虫啃食稻叶，幼虫蛀食稻根，具有危害时间长、繁殖传播速度快、抗药性和抗逆性强等特点。一般造成水稻减产15％-20％，严重的减产50％以上，甚至绝收，是水稻上重要检疫性害虫，严重影响水稻的生长发育及稻谷产量，稻水象甲已经成为我国水稻生产的一大潜在威胁，我国将其列为近年来重点加强防治的5个外来入侵生物之一。

目前在水稻生产过程中对二化螟和稻水象甲的防治主要以化学药剂防治为主。但长期使用化学药剂不仅会使害虫对多种常用杀虫剂产生抗药性，致使二化螟和稻水象甲频繁爆发，进而导致用药量的不断增加。此外，化学药剂的施用还会对环境造成污染，不利于农业生产的可持续性发展。因此，寻找一种环保、无公害、高效且能同时防治两种水稻害虫的生物防治手段具有十分重要的意义。

球孢白僵菌(beauveriabassiana)是一种丝状真菌，属半知菌亚门(deuteromycotina)丝孢纲(hyphomycetes)丛梗孢目(moniliales)丛梗孢科(moniliaceae)白僵菌属(beauveriaspp.)，是广谱性昆虫致病性真菌，主要进行无性繁殖，产生分生孢子，也可进行有性生殖产生子实体。白僵菌具有致病力强，能在寄主间形成流行病、不污染环境、易于规模化生产等优点，使得球孢白僵菌在农业生产过程中大范围应用于害虫的防治，是十分高效的微生物杀虫剂。球孢白僵菌存在一定的寄主专化性，有研究表明不同来源区域、不同寄主来源的菌株对靶标害虫的致病能力差异十分显著，不同菌株的致死时间(lt90)可相差数倍至数十倍。

目前，在利用白僵菌进行田间害虫防治时，常因为针对不同靶标害虫生产相应的专化性菌种，在一定程度上造成了不便，不利于应用球孢白僵菌进行生物防治的进一步推广。

有鉴于此，提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种能够同时对水稻害虫二化螟和稻水象甲具有高致病力的球孢白僵菌菌株ehm-068，该菌株能够大幅度提高对水稻害虫二化螟和稻水象甲的防治效果，并且该菌株的生物学特性良好，且环保无污染、不易产生抗药性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种球孢白僵菌菌株ehm-068，所述球孢白僵菌菌株ehm-068，分类命名为球孢白僵菌(beauveriabassiana)，已于2016年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno.12110。

进一步地，所述球孢白僵菌菌株ehm-068的序列如seqidno:1所示。

进一步地，所述球孢白僵菌菌株ehm-068菌落培养初期表现为绒状，后期形成乳粉状的孢子层，孢子层厚度均匀，中心稍有凸起；菌丝透明，具有分隔和分支，无色光滑；分生孢子梗多呈瓶装，单生或簇生；分生孢子为单细胞，无色，呈球形或卵圆形，大小2-3μm×2-2.5μm。

上述球孢白僵菌菌株ehm-068在防治二化螟中的应用。

上述球孢白僵菌菌株ehm-068在防治稻水象甲中的应用。

上述球孢白僵菌菌株ehm-068在制备杀虫剂中的应用。

在球孢白僵菌孢子粉中加入分散剂、湿润剂、乳化剂、消泡剂、调节剂等中的一种或几种作为助剂，或吸附载体按一定比例混合后，制备成粉剂、可湿性粉剂、悬浮剂或微粒剂。

杀虫剂中球孢白僵菌株ehm-068菌株的分生孢子的含量为40-100亿孢子/g菌剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明提供的球孢白僵菌菌株ehm-068，能够同时对水稻二化螟和稻水象甲具有高致病力的球孢白僵菌菌株，大幅度提高且明显超过实验室原保存菌株(菌株xj8)对水稻二化螟和稻水象甲的防治效果，并且该菌株的生物学特性良好，且环保无污染、不易产生抗药性。

2.本发明提供的球孢白僵菌菌株ehm-068可用于制备杀虫剂，使用方便，对水稻的主要害虫二化螟和稻水象甲的防治效果好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的球孢白僵菌ehm-068的菌落形态图；

图2为本发明提供的球孢白僵菌ehm-068的分生孢子形态图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的球孢白僵菌菌株ehm-068，分类命名为球孢白僵菌(beauveriabassiana)，已于2016年3月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmccno.12110。

实施例1球孢白僵菌菌株ehm-068的分离与鉴定

(1)分离纯化

将从吉林省公主岭市稻田内采集到的自然感染的稻水象甲成虫僵虫充分僵化后，将其体表上的白粉状物轻轻抖落至含有0.1％吐温-80灭菌水溶液的灭菌三角瓶中，充分震荡使白僵菌孢子均匀分散，取配好的孢子悬浮液进行梯度稀释后，用无菌涂布棒蘸取不同稀释倍数的白僵菌孢子液均匀涂布于pda培养基平板上，置于温度为26℃、相对湿度为90％的环境下培养。

当有单个菌落长出后，用无菌接种针挑取菌落转移至另一个新的pda培养基平板上单独培养，继续培养确认无其他杂菌后，分离纯化完成。

将得到的白僵菌菌株转入盛有pda斜面培养基，在25℃、相对湿度为90％的下培养10-15天，待有大量分生孢子长出后，在4℃冷藏箱中保藏。

(2)形态学鉴定：

将分离到的球孢白僵菌ehm-068菌株接种在pda平板上，26℃的条件下，培养观察菌落形态特征、产孢结构和孢子形状与大小。

将分离到的球孢白僵菌ehm-068菌株接种在温度为26℃、相对湿度为95％的培养箱中培养15天，用0.1％吐温-80的水溶液冲洗平面，离心后重悬于0.1％吐温-80的水溶液中，稀释成1×10⁷个/ml的孢子悬液，接种到pda培养基平板后置于培养箱中培养，观察菌落形态特征、产孢结构和孢子形状与大小。

图1为本发明提供的球孢白僵菌ehm-068的菌落形态图；图2为本发明提供的球孢白僵菌ehm-068的分生孢子形态图。如图1和图2所示，菌落逐渐从白色至乳白色，初期为绒状，后期形成乳粉状的孢子层，孢子层厚度均匀，中心稍有凸起；菌丝透明，具有分隔和分支，无色光滑；分生孢子梗多呈瓶装，单生或簇生；分生孢子为单细胞，无色，呈球形或卵圆形，大小2-3μm×2-2.5μm。

(3)菌株的its序列测定及分子鉴定：

菌株的dna依据百泰克真菌基因组dna提取试剂盒指南进行提取。利用引物its4和its5用于rrna的扩增。

以提取的dna为模板，以真菌its5区通用引物进行pcr扩增、测序。

pcr反应体系为20μl，反应条件为：95℃预变性8min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，循环33次；72℃延伸10min。

引物its4：tcctccgcttattgatatgc(5’到3’端)

引物its5：ggaagtaaaagtcgtaacaagg(5’到3’端)

本发明球孢白僵菌菌株的its测序结果见测序结果见seqidno：1，与ncbi数据库的三柱白僵菌的同源性达到99.3％，可见该菌株为球孢白僵菌(beauveriabassiana)。

实施例2白僵菌菌株ehm-068的生物学特性指标

白僵菌菌株的产孢量、孢子萌发速率、菌株生长速率和致病力是反映菌株优良性状的重要指标。

(1)产孢量的测定

菌株的产孢量反映了菌株的繁殖能力、孢子在环境中的扩散能力和传播范围，是衡量一个菌株优劣的重要指标之一。

首先，将白僵菌菌株用0.1％吐温-80无菌水分别配制成浓度为1x10⁷个/ml的分生孢子悬浮液。在pda固体平板培养基上接种200ul分生孢子悬浮液，用灭菌玻璃棒涂布均匀，然后置于温度为25℃，相对湿度为90％的条件下培养10-15天。用直径为0.8cm的打孔器在菌落中央到边缘的中点处，取出一定面积的菌落，移于小三角烧瓶中，加入0.1％吐温-80无菌水，在旋涡振荡器上充分振荡使孢子均匀分散，配成孢子悬浮液。每个培养皿按三角形三点取样，每菌株5次重复，用血球计数板测定孢子数量，最后统计换算成每株菌株平均每平方厘米产孢量。试验采用本实验室原有保存的菌株xj8作为对照(ck)菌株。

球孢白僵菌菌株的产孢量见表1。

表1球孢白僵菌菌株的产孢量

从表1中可以看出，球孢白僵菌菌株ehm-068的平均产孢量为2.97×10⁸/cm²，明显高于ck菌株放入平均产孢量2.33×10⁸/cm²，且与ck菌株差异极显著。

(2)孢子萌发率的测定

孢子萌发快慢反映了菌株的侵染、致病性能，是衡量一个菌株生防潜力的重要指标。

将白僵菌菌株用0.1％吐温-80无菌水分别配制成浓度为1x10⁷个/ml的分生孢子悬浮液，然后接种于液体培养基中，(25±1)℃振荡培养(150r/min)，14h后镜检萌发孢子数。镜检稀释至每个视野有20-30个孢子，每次镜检5个视野，不少于100个孢子，以可见芽管长度等于或者大于孢子直径长度作为孢子已萌发的标准，统计孢子萌发率。试验采用本实验室原有保存的菌株xj8作为对照(ck)菌株。

球孢白僵菌菌株的孢子萌发率见表2。

表2球孢白僵菌菌株的孢子萌发率

从表2中可以看出，球孢白僵菌菌株ehm-068的的平均孢子萌发率为95.02％，ck菌株的平均孢子萌发率为94.58％，两者相差不大，且差异不显著。

(3)菌株生长速率的测定

菌株营养生长快慢是反映菌株优良性状的重要指标之一。

将球孢白僵菌菌株接种到pda斜面培养基上，在温度为25℃、相对湿度为90％的条件下培养。培养10-15天后，取分生孢子以0.1％吐温-80无菌水配制成浓度为1×10⁷个/ml的分生孢子悬浮液。然后用微量移液器吸取浓度为1x10⁷个/ml的分生孢子悬浮液5ul接种于pda固体培养基中央，每皿一点，每个菌株做5个重复。最后置于温度为25℃、相对湿度为90％的条件下培养8天，用游标卡尺十字交叉测量菌落生长直径，记录生长速率，计算出平均生长速率(mm/d)。试验采用本实验室原有保存的菌株xj8作为对照(ck)菌株。

球孢白僵菌菌株的生长速率见表3。

表3球孢白僵菌菌株的生长速率

注：同一列数据后标不同小写(大写)字母者表示经duncan氏新复极差测验，在p0.05(p0.01)水平上差异显著，下表同。

从表3中可以看出，球孢白僵菌菌株ehm-068生长速率较快，平均生长速率达3.706mm/d，明显高于对照组ck菌株的平均生长速率。经过duncan氏新复极差测，在α＝0.01水平上，菌株ehm-068菌落生长速率与ck菌株差异达极显著水平。

(4)室内杀虫活性测定

菌株致病能力直接关系着菌株的杀虫效果，是衡量菌株优良性状的极为重要指标。

供试试虫：春季在稻茬中采集越冬存活二化螟幼虫，在室内解除滞育后进而化蛹、羽化、产卵、孵化，幼虫利用人工饲料饲养，当发育至3龄后进行白僵菌菌株室内生测试验；春季从田间采集的稻水象甲成虫，室内饲养10d后，挑选健康活跃活虫作为供试试虫。

将白僵菌菌株接种到pda平板培养基上，在25℃、相对湿度为90％的条件下，培养10-15天后，取分生孢子以0.1％吐温-80无菌水配制成浓度为1.5×10⁶个/ml的分生孢子悬浮液。将分生孢子悬浮液倒入经高温灭菌的喉头喷雾器内，将供试二化螟3龄幼虫(或稻水象甲成虫)放在经灭菌的搪瓷盘里，然后用喉头喷雾器对每个菌株进行喷雾接种(每个重复按喷雾器3下)，每个菌株设4个重复，每个重复20头二化螟3龄幼虫(或稻水象甲成虫)。喷雾接种后，将二化螟3龄幼虫(或稻水象甲成虫)单头放入装有滤纸条的指形管中。指形管管口用棉球塞好，以保持通气。对照组用等量的0.1％吐温-80无菌水接种。将处理和对照均置于温度为25℃、相对湿度为90％的条件下培养。三日内向指形管内加水以保持高湿，第二天起逐日调查统计感染死亡虫数，并记录僵虫数，累计调查15天，最后统计累计死亡率。试验采用本实验室原有保存的菌株xj8作为对照(ck)菌株。

球孢白僵菌菌株对二化螟的致病力见表4。

球孢白僵菌菌株对稻水象甲的致病力见表5。

表4球孢白僵菌菌株对二化螟的致病力

从表4和表5可知，球孢白僵菌菌株ehm-068对二化螟和稻水象甲的致病力均较强，死亡率分别为93.75％和75.00％，矫正死亡率分别为93.42％和73.68％，均高于对照(ck)菌株对二化螟和稻水象甲的防治效果，且均与对照(ck)菌株差异显著。

表5球孢白僵菌菌株对稻水象甲的致病力

从表4中可以看出，球孢白僵菌菌株ehm-068对二化螟的lt90值仅为5.29天，低于ck菌株lt90值的5.88天；从表5中可以看出，球孢白僵菌菌株ehm-068对二化螟的lt90值仅为8.03天，低于ck菌株lt90值的9.14天。

综上，可以看出，球孢白僵菌菌株ehm-068对二化螟和稻水象甲均有良好的防治效果。

实施例3采用球孢白僵菌菌株ehm-068制备的杀虫剂防治二化螟和稻水象甲

1)田间试验方法：

在2016年5-6月在吉林省公主岭市选取水稻田作为试验基地，水稻田面积为300m²，本试验共设置六个处理，随机排列。处理一至四均采用含有本发明提供的球孢白僵菌菌株ehm-068的杀虫剂，其中杀虫剂中球孢白僵菌株ehm-068菌株的分生孢子的含量为50亿孢子/g菌剂，处理一至四的喷施量分别为62.5g/亩.次、125g/亩.次、250g/亩.次和500g/亩.次，处理五采用生物农药喷施，处理六用水喷施作为对照试验。处理一至六用背负式喷雾器向稻田茎叶均匀喷雾，插秧1周后(5月25日)施药1次，隔7天再喷1次。孕穗期(6月30日)左右施药1次，隔7天再喷1次。

2)调查方法

于第一次、第二次施药后3天(即5月28日和6月5日)分别调查不同处理稻水象甲成虫密度，每田块各随机调查5点，每点调查100丛水稻植株；

7月25日调查二化螟危害的枯心率、枯鞘率、白穗率。

杀虫剂对稻水象甲田间防效情况表5。

杀虫剂对二化螟田间防效情况表6。

表5杀虫剂对稻水象甲田间防效情况表

从表5中可以看出：处理一至四采用含有本发明提供的球孢白僵菌菌株ehm-068制备的杀虫剂，第一次施药3天后的田间稻水象甲成虫量开始减少，至第二次施药后3天后，成虫量明显减少；处理一至四，第二次施药后3天后田间防治效果分别为46.25％、64.29％、77.94％和78.67％。随着杀虫剂喷施量的增加，对稻水象甲的田间防治效果增加。除处理一对稻水象甲的田间防治效果略低外，处理二至四的对稻水象甲的田间防治效果都超过了60％，远高于不施用杀虫剂的对照组；虽然处理五采用化学农药对稻水象甲的田间防治效果达到了98.75％，但是化学农药成本高，并且容易造成环境污染。

表6杀虫剂对二化螟田间防效情况表

从表6中可以看出：处理一至四采用含有本发明提供的球孢白僵菌菌株ehm-068制备的杀虫剂，水稻植株的枯心率、枯鞘率、白穗率3个指标较对照组ck都有明显降低，其中处理三、处理四对水稻二化螟的平均防效都达到了65％以上，可见含有本发明提供的球孢白僵菌菌株ehm-068制备的杀虫剂对水稻二化螟都有明显效果。虽然处理五采用化学农药对二化螟的平均防效都达到了85.54％，但是化学农药成本高且容易造成环境污染。

综合表5和表6可以看出，含有本发明提供的球孢白僵菌菌株ehm-068制备的杀虫剂对水稻生产过程中的主要害虫稻水象甲和二化螟都有明显效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>吉林省农业科学院

<120>球孢白僵菌菌株ehm-068及其应用

<130>2017

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<212>dna

<213>球孢白僵菌

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