本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种真菌DNA提取液及提取方法。
背景技术：
真菌感染是临床常见的疾病之一。对人类有致病性的真菌约有300多种。根据侵犯人体部位的不同，临床上将致病真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌仅侵犯皮肤、毛发和指甲，而深部真菌能侵犯黏膜、深部组织和内脏，甚至引起全身播散性感染。
目前，临床常见真菌检测方法主要是通过形态学进行观察，但该方法培养时间长，受人员经验影响比较大，且形态比较接近的真菌难以通过该方法鉴定到种，因此通过分子测序方法进行真菌鉴定显得越来越重要。然而，真菌细胞壁成分复杂，往往难以得到充分裂解，且真菌中富含多糖、色素、核酸酶等物质使得真菌DNA的提取更加困难，从而限制了分子鉴定方法的应用。因此，探索临床常见真菌高效、快速的DNA提取方法十分重要。
传统的真菌DNA提取方法步骤繁琐，且耗时较长，不符合真菌分子快速鉴定方法的需求。而市售的DNA提取液，在某些真菌DNA提取方面效果不佳，提取效率不高，使用范围相对不够广。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种能够快速、有效的提取真菌DNA的真菌DNA提取液及提取方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
一种真菌DNA提取液，包括质量百分含量为4％-6％的Chelex-100、8mM-12mM的pH为8.0-8.7的tris-HCl、0.08mM-0.12mM的EDTA-Na2、质量百分含量为0.08％-0.12％的NaN3、200μg/ml-250μg/ml的蛋白酶K以及13mg/ml-15mg/ml的蜗牛酶。
在其中一个实施例中，所述Chelex-100的质量百分含量为5％；所述tris-HCl的浓度为10mM，pH为8.3，所述EDTA-Na2的浓度为0.1mM；所述NaN3的浓度为0.1％；所述蛋白酶K的浓度为200μg/ml；所述蜗牛酶的浓度为13mg/ml。
一种真菌DNA提取方法，使用上述任一实施例所述的真菌DNA提取液进行提取。
在其中一个实施例中，在提取过程中，按照每50μl的真菌DNA提取液加入45mg-55mg的真菌菌体的比例将待提取DNA的真菌菌体加入至所述真菌DNA提取液中，得到混合液。
在其中一个实施例中，在提取过程中，将真菌菌体与真菌DNA提取液的混合液置于55℃-58℃下保温以裂解细胞壁，释放出DNA，之后再置于95℃-100℃下保温使蛋白质变性，同时chelex-100吸附各种杂质以对DNA进行纯化，最后离心收集上清液
在其中一个实施例中，在55℃-58℃下保温时间为1h-2h；在95℃-100℃下保温时间为10min-15min。
在其中一个实施例中，在提取过程中，按照每50μl的真菌DNA提取液加入50mg的真菌菌体的比例将待提取DNA的真菌菌体加入至所述真菌DNA提取液中；
在提取过程中，将真菌菌体与真菌DNA提取液的混合液先置于56℃下保温1小时，再置于100℃下保温10分钟，最后离心收集上清液。
在其中一个实施例中，所述离心的转速为13000rpm，时间为10分钟。
在其中一个实施例中，在将待提取DNA的真菌菌体加入至真菌DNA提取液之前，还包括破碎所述真菌菌体的细胞壁的步骤。
在其中一个实施例中，所述破碎所述真菌菌体的细胞壁是使用液氮研磨的方法。
上述真菌DNA提取液中通过添加蜗牛酶，可以有效裂解细胞壁，使细胞内涵物有效释放；通过添加NaN3可以促进蛋白质变性，防止提取到蛋白质成分对检测结果造成影响；通过添加蛋白酶K，可进一步溶解变性的蛋白质；通过添加Chelex-100可以选择性地结合多价阳离子，去除样品和缓冲液中的金属离子，避免煮沸过程中模板DNA的降解。通过使用该真菌DNA提取液，各组分可以发挥协同作用进行真菌菌体DNA的提取，该提取液中的两种酶和chelex-100这三个成分都是不可缺少的，蛋白酶K和蜗牛酶对于细胞壁的裂解是十分重要的，二者联合应用可以提高破壁效率，缩短孵育时间；chelex-100在除杂方面优势比较明显，尤其在暗色真菌DNA提取方面优势更大，通过该方法获得的DNA纯度更高。
使用上述真菌DNA提取液对真菌DNA进行提取，操作简便，提取周期短，并且适用范围广，对大多数真菌菌体都可以有效提取，提取效率高，DNA提取的纯度高。
进一步，对某些细胞壁极为复杂的细菌，可以先对其进行破壁操作，如在一实施例中，使用液氮研磨的方式进行破壁，再使用上述真菌DNA提取液进行提取，提取效果非常明显，可以有效提取传统提取液提取不了的真菌，因而进一步拓宽了该真菌DNA提取液和提取方法的适用范围。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合具体的实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
1.配方
本实施例所用的自制真菌DNA提取液的配方如下：
可理解，在其他实施例中，真菌DNA提取液的配方不限于此，如Chelex-100的质量百分含量可以在4％-6％之间；tris-HCl的浓度可以在8mM-12mM之间，pH可以在8.0-8.7之间，EDTA-Na2的浓度可以在0.08mM-0.12mM之间；NaN3的浓度可以在0.08％-0.12％之间；蛋白酶K的浓度可以在200μg/ml-250μg/ml之间；蜗牛酶的可以在13mg/ml-15mg/ml之间。
2.步骤
在研究过程中，通过常规的PCR扩增ITS(Internal Transcribed Spacer，转录间隔区序列)基因对自制的真菌DNA提取液的DNA提取功能进行了评价。
通过收集到的34株真菌(涉及26个不同真菌属，这些菌株均经过真菌ITS基因测序鉴定)，将自制的真菌DNA提取液同市售的DNA提取液Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(厂家Takara，货号9164)进行了比对。
加50mg菌体到含有50μl真菌DNA提取液的1.5ml离心管中，水浴56℃30min保温消化，接着水浴100℃10min，最后13000rpm 10min离心获取上清液，该上清液即可作为ITS基因PCR扩增的DNA模板
结果共34株真菌，利用本实施例自制的真菌DNA提取液成功PCR扩增32株真菌，得到了清晰的、单一的扩增条带；利用市售DNA提取液成功扩增出27株真菌，结果详见下表1。本实施例所选用的真菌属达到26个，涉及的真菌种属范围广，并且实验过程中尽可能地排除了试剂外其他因素的影响，因此，上述结果有效地证明了自制的DNA提取液具有高效性的特点。
在实验过程中，对于自制的真菌DNA提取液和市售的DNA提取液均未能直接成功提出DNA的Trichophyton和Coprinopsis，在提DNA之前进行液氮研磨，经过液氮研磨破壁后，自制的真菌DNA提取液可以成功提出Trichophyton和Coprinopsis的DNA；而市售的DNA提取液仅可成功提出Coprinopsis的DNA，这进一步地说明了本实施例的真菌DNA提取液在真菌DNA提取方面的有效性。
表1本实施例自制的真菌DNA提取液和市售提取液提取真菌DNA对应的PCR检测结果
由表1可以进一步看出，本实施例的真菌DNA提取液具有操作简便、快速、高效、应用范围广的特点，是一种比较理想的提取真菌DNA的方法，可以作为后续PCR模板。极少数真菌因为细胞壁成分更加复杂直接提取DNA难以成功，此时只要在提取DNA之前加液氮破壁步骤，运用本实施例自制的真菌DNA提取液便可以成功提出DNA，进行后续的PCR；而市售的DNA提取液仍没能成功提出DNA，因此新研制试剂在提取真菌DNA方面有着极大的优势，有望研发成为一种新的试剂。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。