环磷酸腺苷硼酸络合物及其制备方法，以及抗肿瘤药物和中子俘获治疗的硼剂与流程

本发明涉及抗肿瘤药物
技术领域：
，尤其涉及环磷酸腺苷硼酸络合物及其制备方法，以及抗肿瘤药物和中子俘获治疗的硼剂。
背景技术：
：随着医疗技术的不断发展，辐射杀灭肿瘤的技术也从无选择性的x，γ辐射(普通的医用加速器)到具有一定纵向能量选择(博拉格峰)的质子、重离子辐射治疗。尤其利用10b分子俘获超热低能中子(1ev～10kev)在肿瘤细胞中产生核反应(～3mev)具有更高量级选择性杀灭肿瘤的硼中子俘获疗法(bnct)，更是近来世界上研究的热点。bnct是把与肿瘤有特异性亲和力的硼(10b)化合物携带剂注入人体,选择性富集于肿瘤细胞,然后用超热低能中子局部照射,使具有超大中子俘获截面的10b俘获中子形成局部核反应杀死肿瘤细胞。如果10b化合物能特异性完全富集于肿瘤细胞中，则bnct杀灭肿瘤的选择性将是其他辐射治疗的百倍以上。然而目前经美国食品及药物管理局(fda)认证的第2代硼剂低分子硼化合物十一氢巯基十二硼化二钠(bsh)和对二羟苯基丙氨酸硼(bpa)尽管与第1代硼剂相比性能有了较大改进，其能在肿瘤细胞中滞留较长的时间，对肿瘤细胞有一定的选择性亲和力，肿瘤与正常组织中的硼浓度比值(t/n)，以及肿瘤与血液中硼浓度比值(t/b)均能达到＞1。但仍不能满足bnct的基本要求，即t/n或t/b≥3，因此目前bnct治疗脑肿瘤的效果并不十分理想。筛选和合成能特异性富集于肿瘤细胞的10b化合物已经成为这一技术推广的重要瓶颈。近年来，第3代硼携带剂的研究也在快速发展，主要特点是能通过和肿瘤特异性表达的抗原或受体结合，使硼剂被肿瘤细胞靶向摄取，从而达到较高的t/n或t/b值。其中研究较为广泛的有表皮生长因子受体(egfr)介导的能和表皮生长因子(egf)结合的bpa,叶酸受体(fr)介导的和叶酸能结合包含硼剂的脂质体和碳纳米颗粒,以及具有较高的亲水性,能被胶质瘤细胞t98g选择性摄取，并具有更高亲和力的结合了卟啉的硼酸盐。目前，利用这些肿瘤选择性吸收的硼剂，bnct在脑胶质瘤中取得了一定的疗效,通过fr介导的细胞内吞,能把含硼药物运送到细胞内，以及fr靶向的含硼碳纳米颗粒能够被高表达fr的hela细胞靶向摄取等相关研究也有报道。总之，现有的利用硼剂(10b)运用bnct进行辐射杀灭肿瘤，虽然能一定程度上提高10b在肿瘤细胞的浓度，但仅仅是提高其bnct中能选择性吸收中子能量来杀灭肿瘤单方面效应，肿瘤细胞杀灭效率低，选择性差。上述内容仅用于辅助理解本发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种环磷酸腺苷硼酸络合物和制备方法，以及抗肿瘤药物和bnct的硼剂，旨在解决现有的针对目前bnct中的硼剂大部分仅仅具有单一的功能，仅仅是提高其bnct中能选择性吸收中子能量来杀灭肿瘤单方面效应，肿瘤细胞杀灭效率低，选择性差问题。为解决上述问题，本发明提供一种环磷酸腺苷硼酸络合物，其特征在于，包括：优选地，所述环磷酸腺苷硼酸络合物的络合形式如下：此外，为解决上述问题，本发明还提供一种环磷酸腺苷硼酸络合物的制备方法，包括：将的溶液和包含h3bo3的溶液按照预设比例混合得到环磷酸腺苷-硼酸络合物。优选地，所述和所述h3bo3的预设比例为1：32。优选地，所述和所述h3bo3的混合时间为24小时。优选地，所述将和h3bo3混合，即得之后，还包括：利用液相色谱质谱分析仪，在260nm的检测波长下，流动相为a相0.1％甲酸水溶液和b相100％甲醇，运用c18色谱柱在预设梯度洗脱比例下进行梯度洗脱。优选地，所述预设梯度洗脱比例为：0min-2minb相0％，2min-16minb相0％-30％，16min-20minb相30％-90％，20min-25minb相90％，25min-25.1minb相90％-0％，25.1min-30minb相0％。进一步的，为解决上述问题，本发明还提供一种抗肿瘤药物，包括表皮生长因子受体抑制剂；所述表皮生长因子受体抑制剂包括权利要求1或2所述的环磷酸腺苷-硼酸络合物。进一步的，为解决上述问题，本发明还提供一种中子俘获治疗的硼剂，所述硼剂包括含硼皮生长因子受体抑制剂；所述含硼皮生长因子受体抑制剂包括权利要求1或2所述的环磷酸腺苷-硼酸络合物。优选地，所述硼剂还包括含硼核苷类表皮生长因子受体抑制剂；所述含硼核苷类表皮生长因子受体抑制剂包括权利要求1或2所述的环磷酸腺苷-硼酸络合物。本发明提供一种环磷酸腺苷硼酸络合物和制备方法，以及抗肿瘤药物和中子俘获治疗的硼剂，所述环磷酸腺苷硼酸络合物，作为含硼化合物、含硼的表皮生长因子受体抑制剂，以及含硼核苷表皮生长因子受体抑制剂，综合利用肿瘤细胞吸收硼剂，以及肿瘤细胞繁殖需要大量核苷的特性，使药物富集于肿瘤细胞并通过辐射杀死肿瘤细胞，提高了药物的选择性，进而极大提高了肿瘤细胞的杀灭效率，避免了现有的针对目前中子俘获治疗中的硼剂大部分仅仅具有单一的功能，仅仅是提高其中子俘获治疗中能选择性吸收中子能量来杀灭肿瘤单方面效应，肿瘤细胞杀灭效率低，选择性差问题。本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。附图说明应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明环磷酸腺苷硼酸络合物和制备方法，以及一种抗肿瘤药物和bnct的硼剂的0.06mmcamp及含不同浓度h3bo3在0.06mmcamp中的lc-ms色谱图；图2为本发明环磷酸腺苷硼酸络合物和制备方法，以及一种抗肿瘤药物和bnct的硼剂的环磷酸腺苷-硼酸络合物抑制egfr的自磷酸化32p-atp放射自显影图；图3为本发明环磷酸腺苷硼酸络合物和制备方法，以及一种抗肿瘤药物和bnct的硼剂的裸鼠肿瘤组织切片的tunel检测图。具体实施方式下面根据具体实施例就本发明的技术方案做进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明提供一种环磷酸腺苷硼酸络合物，其特征在于，包括：本发明提供的环磷酸腺苷硼酸络合物中，包含有h3bo3和等化合物。其中，是一种camp(cyclicadenosinemonophosphate)“腺苷-3',5'-环化一磷酸”的简称。亦称“环磷酸腺苷”“环化腺核苷一磷酸”，“环腺一磷”。以微量存在于动植物细胞和微生物中。体内多种激素作用于细胞时，可促使细胞生成此物，转而调节细胞的生理活动与物质代谢。作为一种环状的核苷酸类化合物，camp的细胞毒性和抗药性较小。上述，h3bo3为硼酸，亦称为pt，白色粉末状结晶或三斜轴面的鳞片状带光泽结晶。水中呈弱酸性。有滑腻手感，无臭味。溶于水、酒精、甘油、醚类及香精油中。无气味。味微酸苦后带甜。与皮肤接触有滑腻感。露置空气中无变化。能随水蒸气挥发。0.1mol/l水溶液ph为5.1。1g能溶于18ml冷水、4ml沸水、18ml冷乙醇、6ml沸乙醇和4ml甘油。在水中溶解度能随盐酸、柠檬酸和酒石酸的加入而增加。相对密度1.4347。熔点184℃(分解)。沸点300℃。上述，是camp与h3bo3的合成产物，在水中以络合盐的形式存在，为一种含硼的egfr抑制剂，也是一种含硼核苷类egfr抑制剂。本发明中，所使用的camp为南京澳多福尼生物科技有限公司、纯度>98％的camp，所使用的h3bo3为生工生物科技有限公司、纯度>98％的h3bo3。本发明提供一种环磷酸腺苷硼酸络合物和制备方法，以及抗肿瘤药物和bnct的硼剂，所述环磷酸腺苷硼酸络合物，作为含硼化合物、含硼的egfr抑制剂，以及含硼核苷类egfr抑制剂，综合利用肿瘤细胞吸收硼剂，以及肿瘤细胞繁殖需要大量核苷的特性，使药物富集于肿瘤细胞并通过辐射杀死肿瘤细胞，提高了药物的选择性，进而极大提高了肿瘤细胞的杀灭效率，避免了现有的针对目前bnct中的硼剂大部分仅仅具有单一的功能，仅仅是提高其bnct中能选择性吸收中子能量来杀灭肿瘤单方面效应，肿瘤细胞杀灭效率低，选择性差问题。优选地，所述环磷酸腺苷硼酸络合物的络合形式如下：camp，即为腺苷-3',5'-环化一磷酸，其结构式为camp与h3bo3在水溶液中形成环磷酸腺苷-硼酸络合物。需要理解的是，络合物是由一定数量的配体(阴离子或分子)通过配位键结合于中心离子(或中性原子)周围而形成的跟原来组分性质不同的分子或离子。需要理解的是，分子或者离子与金属离子结合，形成很稳定的新的离子的过程就叫络合反应，生成的物质叫络合物。络合物通常指含有络离子的化合物，例如络盐ag(nh3)2cl、络酸h2ptcl6、络碱cu(nh3)4(oh)2等；也指不带电荷的络合分子，例如fe(scn)3、co(nh3)3cl3等。配合物又称络合物。本发明中，在水溶液中的camp和h3bo3发生络合反应最终达到平衡状态，形成络合盐，进而成为溶液中包含有camp、h3bo3和的络合物。上述，进行络合反应的溶剂为水溶液，水作为载体使水溶性的camp和h3bo3进行反应。此外，也可使用其他溶剂进行本发明中的络合反应，例如甲醇、甲酸水溶液等。本发明中采用的药物反应载体为水。本发明还提供一种环磷酸腺苷硼酸络合物的制备方法，包括：将包含的溶液和包含h3bo3的溶液按照预设比例混合得到环磷酸腺苷-硼酸络合物。在本发明中，将camp与h3bo3进行混合后，经过络合反应，形成络合物。具体的，当h3bo3可以与具有多羟基的化合物进行反应并形成具有高络合常数的络合形式。camp上的环戊糖只有一个同侧羟基，不能在此处进行络合，但camp的碱基中的氨基具有碱性性质，对硼酸中氢离子进行吸附从而形成络合反应并成为络合盐的形式。优选地，所述和所述h3bo3的预设比例为1:32。上述，camp与h3bo3预设比例可以为1:1～1:300，在本发明中，优选比例为1:32，摩尔浓度的优选比例为0.06mm：1.92mm。优选地，所述和所述h3bo3的混合时间为24小时。优选地，所述将包含的溶液和包含h3bo3的溶液按照预设比例混合得到环磷酸腺苷-硼酸络合物之后，还包括：利用液相色谱质谱分析仪，在260nm的检测波长下，流动相为a相0.1％甲酸水溶液和b相100％甲醇，运用c18色谱柱在预设梯度洗脱比例下进行梯度洗脱。优选地，所述预设梯度洗脱比例为：0min-2minb相0％，2min-16minb相0％-30％，16min-20minb相30％-90％，20min-25minb相90％，25min-25.1minb相90％-0％，25.1min-30minb相0％。将一定比例的camp与h3bo3进行混合后，进行络合反应，在经过预设的反应时间后，通过lc-ms(液相色谱质谱分析仪)对络合物的络合情况进行检测。实验仪器和材料：lc-ms：安捷伦6120lc/ms系统(三重四极杆质谱仪)(安捷伦、ca、美国)；数据采集系统：安捷伦masshunter软件walkuplc/ms和lc系统进行数据采集；色谱柱：c18色谱柱，250mm×4.6mm(广州绿百草生物科技有限公司，中国)；有机溶剂：甲酸(lc/ms级)、甲醇(lc/ms级)；水：超纯水，通过milli-q自制；实验条件：室温，检测波长：260nm；流动相：a相为0.1％甲酸水溶液；b相为100％甲醇；实验方法：制备不同浓度的样品，分别为：0.06mmcamp、0.06mmcamp+0.48mmh3bo3、0.06mmcamp+0.96mmh3bo3、0.06mmcamp+1.92mmh3bo3；将以上样品利用lc-ms按表1中梯度洗脱时间和比例进行洗脱。表1利用lc-ms对磷酸腺苷-硼酸络合物络合物进行梯度洗脱的时间及比例检测结果见图1，图1为0.06mmcamp及含不同浓度h3bo3在0.06mmcamp中的lc-ms色谱图。由图1中可见，随着硼酸浓度的逐渐增加，主峰(保留时间9.9-10.1min)峰面积相应地发生逐渐减小的变化。此外环磷酸腺苷-硼酸络合物包含有更多的羟基且更容易通过甲醇洗脱出来，则导致环磷酸腺苷-硼酸络合物在lc-ms中具有较小的保留时间。另外，环磷酸腺苷-硼酸络合物在由camp和h3bo3进行络合后，极性变大，从而导致样品在260nm下的吸收变小的情况，由于camp碱基中的氨基具有碱性，能对硼酸中氢离子进行吸附从而形成络合盐的形式。导致硼酸的浓度对具有紫外吸收部分的碱基有影响。综合以上信息，判断经过络合反应的络合物的已经形成。此外，也可通过毛细管电泳分离法进行对环磷酸腺苷-硼酸络合物的络合情况进行验证，camp在h3bo3中，毛细管电泳的迁移率也随硼酸浓度而变化,可以判断camp和h3bo3经过络合反应后形成了络合物的形式。本发明还提供一种抗肿瘤药物，包括表皮生长因子受体抑制剂；所述表皮生长因子受体抑制剂包括权利要求1或2所述的环磷酸腺苷-硼酸络合物。表皮生长因子是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是类egf大家族的一个成员，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。表皮生长因子受体，也称为egfr(epithelialgrowthfactorreceptor)，本身具有酪氨酸激酶活性，一旦与表皮生长因子(egf)组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌的egfr表达增高。本发明中所提供的环磷酸腺苷硼酸络合物，包括以络合盐的形式存在。而环磷酸腺苷硼酸络合物物中的camp和属于表皮生长因子受体抑制剂(egfr抑制剂)，在中子获取疗法中，可具有对肿瘤细胞的抑制作用，可以抑制egfr修复辐射诱导的dna损伤。本发明还提供一种中子俘获治疗的硼剂，所述硼剂包括含硼表皮生长因子受体抑制剂；所述含硼表皮生长因子受体抑制剂包括权利要求1或2所述的环磷酸腺苷-硼酸络合物。bnct为中子治疗即硼中子俘获治疗(boronneutroncapturetherapy，简称bnct)。硼中子俘获治疗通过在肿瘤细胞内的原子核反应来摧毁癌细胞。它的原理是这样的：先给病人注射一种含硼的特殊化合物，这种化合物与癌细胞有很强的亲和力，进入人体后，迅速聚集于癌细胞内，而其他组织内分布很少。一般地，这种含硼化合物对人体无毒无害，本身韩鹏化合物对癌症也无治疗作用。这时，用一种中子射线进行照射，这种射线对人体的损伤不大，但中子与进入癌细胞里的硼能发生很强的核反应，释放出一种杀伤力极强的射线，这种射线的射程很短，只有一个癌细胞的长度。所以只杀死癌细胞，不损伤周围组织。这种有选择的只杀死形状复杂的癌细胞而不损伤正常组织的技术，称为硼中子俘获治疗技术。如果10b化合物能特异性完全富集于肿瘤细胞中，则bnct杀灭肿瘤的选择性将是其他辐射治疗的百倍以上。本发明所提供的环磷酸腺苷硼酸络合物，包括在水中以络合盐的形式存在。作为为一种含硼egfr抑制剂，可实现直接与跨膜蛋白egfr结合，在bnct中硼俘获中子产生的能量将直接破坏重要的细胞膜通道位点，导致细胞膜破裂，继而导致细胞凋亡。优选地，所述硼剂还包括含硼核苷类表皮生长因子受体抑制剂；所述含硼核苷类表皮生长因子受体抑制剂包括权利要求1或2所述的环磷酸腺苷-硼酸络合物。本发明所提供的环磷酸腺苷-硼酸络合物，为camp与h3bo3发生络合的产物，其中camp为腺苷-3',5'-环化一磷酸，亦称为环磷酸腺苷，是一种核苷类核苷类表皮生长因子受体抑制剂，通过络合反应得到环磷酸腺苷-硼酸络合物，属于一种含硼核苷类表皮生长因子受体抑制剂。需要理解的是，目前，提高硼剂对肿瘤细胞的特异性选择的方法包括一种通过核苷进入肿瘤细胞与肿瘤细胞同步繁殖，从而提高对肿瘤细胞的杀伤力的方法。该方法利用肿瘤细胞繁殖时需要大量核苷的原理，将10b连接到核苷上，就能使10b更多进入肿瘤细胞的dna中，由于肿瘤细胞的繁殖速率远大于正常细胞，这样硼化合物聚积将在肿瘤细胞的浓度不仅高于正常细胞，而且能聚积在肿瘤细胞核之一关键靶点，这将极大提高对肿瘤细胞的杀伤力。本发明提供的环磷酸腺苷硼酸络合物，在溶剂中以络合盐的形式存在。将10b连接至核苷类egfr抑制剂camp上，从而形成了含硼核苷类egfr抑制剂，可使肿瘤细胞对含硼核苷类egfr抑制剂具有选择性，当肿瘤细胞将含硼核苷类egfr抑制剂吸收后，形成多基因靶点破坏，从而达到选择性辐射诱导肿瘤细胞凋亡的作用。综上，本发明所提供的环磷酸腺苷硼酸络合物，作为一种egfr抑制剂，本身可以特异性直接降低肿瘤细胞增殖，增强肿瘤细胞的辐射敏感性，从而极大加强辐射产生的自由基诱导的凋亡作用；作为一种含硼egfr抑制剂，直接与egfr结合，在bnct中硼俘获中子产生的能量直接破坏重要的细胞膜通道位点，导致细胞凋亡；作为一种含硼核苷类egfr抑制剂，使肿瘤细胞对含硼核苷类egfr抑制剂具有选择性，将含硼核苷类egfr抑制剂吸收进入肿瘤细胞的细胞核中，继而形成多基因靶点破坏，达到选择性辐射诱导肿瘤细胞凋亡。综合以上三点的效应，极大的提高硼中子俘获选择性杀灭肿瘤的效率，继而极大的降低辐射剂量。由于大部分肿瘤细胞膜的egfr远远高于正常细胞，因此特异性含硼egfr抑制剂将选择性的富集在肿瘤细胞膜上，达到t/n或t/b≥3。并由于其多重诱导细胞凋亡的作用，因此富集在肿瘤细胞上的含硼egfr抑制剂可以在较低的浓度达到理想的效果。通过32p-atp同位素示踪技术确定环磷酸腺苷-硼酸络合物抑制egfr自身磷酸化能力为了确定环磷酸腺苷-硼酸络合物抑制egfr自身磷酸化能力，本发明中对通过32p-atp同位素示踪技术筛选egfr自磷酸化抑制效果好的核苷类含硼络合剂，通过比较，了解和验证抑制剂的抑制效力情况。实验仪器和材料：egfr/her1/erbb1(aa668-1210)(重组人表皮生长因子受体/gst嵌合体，由780个氨基酸组成，分子质量89.1kda，sino生物公司(pa，美国)；[γ32p]-atp(3000ci/毫摩尔，10mci/ml，perkinelmer公司，ca，美国)；反应缓冲液(10倍t4pnk反应缓冲液)；camp(生工生物科技有限公司，纯度>98％)；环磷酸腺苷-硼酸络合物，自制；fla7000激光扫描仪(ge，英国)。实验方法：1、将含2μl0.52mg/ml人类egfr/her1/erbb1反应(aa668-1210)重组人表皮生长因子受体/gst嵌合体，由780个氨基酸组成，分子质量89.1kda，sino生物公司(pa，美国)(>85％纯度))，1μl[γ32p]-atp(3000ci/毫摩尔，10mci/ml，perkinelmer公司，ca，美国)和1.2μl反应缓冲液(10倍t4pnk反应缓冲液)加或不加不同浓度的camp(2μl，4μl和8μl5μmcamp(生工生物科技有>98％、纯度)以及不同浓度环磷酸腺苷-硼酸络合物(1μl，2μl和3μl5mmh3bo3+2μl5μmcamp)。每个反应溶液保持12μl体积(去离子水调节)。2、在37℃孵育24h后，各反应液5μl加入7m尿素变性凝胶电泳(15cm×15cm)使用1xtbe缓冲液与10w功率常温1-2h。3、分离后的凝胶覆盖着荧光屏的成像板收集32pγ辐射激发光，暴露3h后，荧光屏是利用fla7000激光扫描仪读取(ge，英国)。实验结果：如图2所示；1道显示egfr+γ-32p-atp；2-4道显示egfr+32p-atp+camp(不同浓度)反应后；5-7道，显示egfr+32p-atp+环磷酸腺苷-硼酸络合物(不同浓度)反应后放射自显影图；8道显示酶活性示踪对照图(poly(5tyr)标记；9道显示放射自显影强度对照图(20b的32p-rna，是由rna(20b)和t4pnk在γ-32p-atp存在下反应得到的)。放射自显影结果如图2所示，camp和环磷酸腺苷-硼酸络合物均能抑制egfr自身磷酸化，环磷酸腺苷-硼酸络合物具有更强的抑制效果。这是由于egfr与atp结合口袋也能与camp结合，导致camp类似化合物能竞争性抑制egfr自磷酸化过程。而由于硼酸是多元弱酸能与碱性的氨基络合，因此能对camp有一定的络合作用，同时也能和egfr与atp结合口袋位点的氨基结合，导致环磷酸腺苷-硼酸络合物更牢固的吸附在egfr与atp结合口袋位点上，从而环磷酸腺苷-硼酸络合物能更强地竞争性抑制egfr自磷酸化过程。抗肿瘤动物实验免疫组化分析：实验材料：裸小鼠移植瘤模型使用非小细胞肺癌a549细胞具有野生型egfr表达的模型(已由广东实验动物中心造模)。肿瘤移植后达到5至6mm的直径，该载瘤裸鼠被用于抗肿瘤实验。所有裸鼠为雌性，体重19-20g；甲状腺素钠(生工生物科技有限公司，纯度>98％)；动物分组：上述小鼠随机分为3个不同给药剂量的组别：a组：去离子水，即为阴性对照组；b组：去离子水+(环磷酸腺苷-硼酸络合物溶液)；c组：去离子水+(甲状腺素钠+环磷酸腺苷-硼酸络合物溶液)。所有治疗持续四周。口服剂量:b组：camp浓度为1.6mg/ml和h3bo3浓度为16mg/ml(环磷酸腺苷-硼酸络合物饮用溶液，ph＝7，用naoh溶液，调节ph)；c组：甲状腺素钠浓度0.010mg/ml(甲状腺素钠+环磷酸腺苷-硼酸络合物溶液，ph＝7，用naoh溶液调节ph。a组自由饮用水和食物。b组c组为给药组，饮用药液保持0.20-0.30ml/天，每只裸鼠控制给药时间和给药量。通过环磷酸腺苷-硼酸络合物抑制非小细胞肺癌细胞a549对裸鼠移植瘤生长的影响：口服4周后，小鼠体重、体温、肿瘤组织重量等指标见表2。由表1可知，在实验期间的3组小鼠的体重没有统计学显着的变化。其中，c组、b组肿瘤组织质量显著低于a组，且c组明显低于b组。c组肿瘤ca含量显著高于b组和a组。结果表明，环磷酸腺苷-硼酸络合物可显著抑制肿瘤生长。c组ca含量较高，在一定程度上，可能由于细胞凋亡的引起钙流失，导致抑制肿瘤生长。表2肿瘤生长抑制裸鼠移植模型(n＝5)使用t检验进行统计分析。所有p值均为双侧p≤0.05被认为有统计学意义。从表2肿瘤生长抑制率可以得出，c组与a组进行对比，肿瘤生长抑制率为2.8(1.50/0.53)，实验结果优于其他egfrtkis报道(solitdb2005，boehrers2008)的肿瘤抑制剂的肿瘤生长抑制率(2.1，921/438)。从表2中可以得出，ca在c组甲状腺素钠+环磷酸腺苷-硼酸络合物处理的肿瘤组织中的含量显著提高。细胞内钙离子与细胞凋亡关系密切。由甲状腺素钠-解偶联剂诱导较高的体温将导致肿瘤细胞更容易凋亡。因此用甲状腺素钠+环磷酸腺苷-硼酸络合物协同抑制肿瘤生长的机制更有利于肿瘤细胞凋亡。免疫组化凋亡化分析：通过给药对实验小鼠进行治疗4周后，小鼠体重在同一时间进行称重记录于表2中。所有的肿瘤细胞移植瘤在切除后，称重，并进行比较。部分肿瘤组织通过免疫组化分析的末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)的dutp缺口末端标记(tunel)法检测肿瘤细胞凋亡。部分肿瘤组织进行检测ca含量，测定结果记录在表2中。图3为裸鼠肿瘤组织切片的免疫组化图。从图3中可以得出，tunel阳性细胞在c组肿瘤细胞显著增加，说明细胞凋亡的过程可以通过egfr抑制剂与解偶联剂协同增强，从而进一步抑制肿瘤生长。肿瘤组织中钙含量的icp-ms分析：磨碎的肿瘤组织样本0.2g加入聚四氟乙烯(ptfe)消化容器。一个体积8ml硝酸加入到每一个样本，然后，他们被放置在室温下30分钟。标本采用微波消解系统消解(ethosone；里程碑，意大利)。消化后的溶液，用去离子水稀释至50毫升的总量。进一步的分析进行了使用电感耦合等离子体质谱法(nexion300x；珀金埃尔默，美国)。详细的过程可以参考我们以前的工作(25)。bnct实验比较：上述a组和c组各3只肿瘤直径约8mm，停药12小时后，分别固定肿瘤部位于铍镅中子源(105个中子/cm2s)1厘米处辐照24小时，吸收剂量根据美国国家标准(ansi/ans-6.1.1-1977)转化剂量率为1.25×10-6gy/n/cm2shr；因此24小时1cm处裸鼠吸收剂量为1.25×10-6×105×24/(4×3.14×12)＝2.4x10-1gy,由于屏蔽窗作用裸鼠其余部位收到辐射较小。辐照后3天后均不给药自由食物，比较其辐照前后肿瘤体积变化。表3.辐照前后肿瘤体积变化(n＝3)组别肿瘤组织体积cm3a组0.25±0.08b组0.03±0.10pac<0.05使用t检验进行统计分析。所有p值均为双侧p≤0.05被认为有统计学意义。辐照后a组裸鼠(去离子水，即为阴性对照组)3天后肿瘤直径接近增长1mm，而b组合c组作为给药组，肿瘤直径未见明显变化。说明前期给药加辐照更能诱导肿瘤凋亡。综上，环磷酸腺苷-硼酸络合物作为含硼抑制剂，对肿瘤细胞的生长具有一定的抑制作用。统计分析：统计分析采用t-test；p值进行双边比较，p≤0.05被认为有统计学意义。以上仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
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