一种具有胃肠运动刺激活性的多肽的制作方法

本发明涉及新的多肽，特别涉及一种具有胃肠运动刺激活性的多肽。

背景技术：

胃动素(motilin)是一种能够刺激胃窦、十二指肠和结肠的胃肠道的直链多肽激素。尽管这种激素的作用机制尚不十分清楚，但它的确具有增强胃蠕动和刺激胃蛋白酶分泌的功能，而且对于调节消化间期移行性复合运动也起重要作用。人类胃动素由22个氨基酸残基组成，可由下式表示：h-phe-val-pro-ile-phe-thr-tyr-gly-glu-leu-gln-arg-met-gln-glu-lys-glu-arg-asn-lys-gly-gln-oh。

胃动素用于健康人可加速肠道内容物的运送，提高胃的排空能力。在体外实验中，胃动素可刺激人和兔十二指肠平滑肌条和离体胃肠平滑肌细胞的收缩。此外，胃动素及其某些衍生物在人和兔的胃窦组织中具有与放射标记的胃动素的竞争位点，这种现象说明对于胃肠道特异性受体的刺激与胃动素的生理作用有关。据报道注入胃动素可刺激糖尿病胃轻瘫病人胃中固体和液体的排空[peeterstl,etal.,effectofmotilinongastricemptyinginpatientswithdiabeticgastroparesis.gastroenterology.1992,102(1):97-101]。此外，胃动素已用于治疗由胃肠道恶性肿瘤所致的麻痹性肠梗阻[meyeretal.，resultsoftreatmentof，1991，86(10):515-517]。

本发明人发现，胃动素n端1-14位的多肽(胃动素拟似肽1-14)末端的苯丙氨酸(phe，式1a)上的‘nh2-’基团被‘nh2-ch2-ch2-’基团取代(式1b)后，(h-⁺nh2-ch2-ch2-phe-val-pro-ile-phe-thr-tyr-gly-glu-leu-gln-arg-met-gln)，其多肽促进肠平滑肌条收缩作用明显增强，促进胃动力作用明显增加，且均明显强于胃动素。

本发明人还发现，本发明的促胃肠动力肽可显著促进细胞内ca²⁺释放，且该作用明显强于胃动素。我们对其作用机制进行了初步探讨：当将细胞上胃动素受体的第119位上含有羧基末端、呈负电荷的谷氨酸(e)被含有羧基末端、呈负电荷的天冬氨酸(d)替代(e119d)，本发明的促胃肠动力肽促进细胞内ca²⁺释放作用明显减弱；若胃动素受体的第119位上的谷氨酸(e)被呈电中性的、含酰胺基的谷氨酰胺(q)替代(e119q),促胃肠动力肽促使细胞内ca²⁺释放作用则消失。由此提示，该促胃肠动力肽n末端的⁺nh2-正电性与胃动素受体第119位上的谷氨酸羧基末端的负电荷之间形成的静电引力是决定受体激活强弱的关键之一，也即是该多肽化合物的活性效应强弱关键之一。胃动素受体是g蛋白偶联受体，受体的第119位上谷氨酸与周围其他氨基酸之间形成一空间立体功能区，当配体n末端的⁺nh2-正电基团越靠近胃动素受体119位上谷氨酸羧基末端的负电基团，其正负电荷间形成的引力就越强，配体与受体亲合力就越强，随之产生的生物效应相应增强。我们研究也证实了这一点，当胃动素拟似肽1-14n末端的‘⁺nh2-’基团被‘⁺nh2-ch2-ch2-’替代(h-⁺nh2-ch2-ch2-phe-val-pro-ile-phe-thr-tyr-gly-glu-leu-gln-arg-met-gln)，其促进家兔小肠平滑肌条收缩作用明显加强，促进大鼠胃动力作用明显增加。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决背景技术而提出的一种具有胃肠运动刺激活性的多肽。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种具有胃肠运动刺激活性的多肽，包括其药用的酸加成盐，结构如下：

h-⁺nh2-ch2-ch2-phe-val-pro-ile-phe-thr-tyr-gly-glu-leu-gln-arg-met-gln。

在上述技术方案的基础上，可以有以下进一步的技术方案：

所述多肽化合物与药学上可接受的载体一起制成胶囊剂、片剂、注射剂。

所述的具有胃肠动力刺激活性的多肽在制备以胃肠道基本运动功能减弱为特征的疾病，如糖尿病性胃轻瘫、麻痹性肠梗阻和手术后肠梗阻药物中的用途。

本发明具有很强的胃肠道运动刺激活性，可用于治疗以胃肠道基本运动能力下降为特征的疾病，如糖尿病性胃轻瘫、麻痹性肠梗阻和手术后肠梗阻。

附图说明

图1为静脉注射胃动素和促胃肠动力肽对大鼠胃运动影响的幅度变化率图；

图2为静脉注射胃动素和促胃肠动力肽对大鼠胃运动影响的频率变化率图；

图3为静脉注射胃动素和促胃肠动力肽对糖尿病胃轻瘫大鼠胃运动的影响图；

图4为胃动素、促胃肠动力肽和gm109对糖尿病大鼠胃运动影响的幅度变化率图；

图5为胃动素、促胃肠动力肽和gm109对糖尿病大鼠胃运动影响的频率变化率图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来对本发明进一步说明。

本发明的化合物可用本领域已知的各种方法来制备，例如固相多肽合成法或经典的液相合成法。在固相合成法中，通常使用一种树脂载体，例如聚苯乙烯树脂、polyhipe或聚丙烯酰胺/硅藻土复合树脂依次地合成肽链。增长的肽链与树脂载体是通过适当的酸不稳定的分子连接部分连接的，例如，羟甲基苯乙酰氨基甲基(pam)、4-甲基二苯甲基氨基(mbha)或羟甲基苯氧乙酰氧基(hmpa)部分。然后采用氟化氢、三氟乙酸(tfa)、三氟甲烷磺酸(tfmsa)等类似化合物进行酸水解，肽链可在连接分子的连接部分断开，从而脱离树脂载体。

本发明的促胃肠动力肽的制备无论是采用固相法还是液相法，其基本合成步骤都包括通过一个适当保护的氨基酸或多肽的羧基部分与另一个适当保护的氨基酸或多肽氨基进行反应，使两部分氨基酸亚单位偶合形成新的酰胺键。为实现偶合反应，羧基部分必须活化。活化采用标准的偶联试剂，例如dcc、dic、edcc、bop、hbtu或pybrop。除使用pybrop时例外，可加入等摩尔的hobt以抑制活化的氨基酸部分的外消旋作用。在活化时必需采用相应氨基酸的羧酸盐的情况下，可加入诸如nmm、diea或tea一类的碱。

本发明化合物的酸加成盐的适宜载体包括等渗水和无菌注射用水(usp)，它们可单独使用，或与乙醇、丙二醇或本领域技术人员熟知的其它常规溶解剂合并使用。优选的载体是本发明化含物的等渗水溶液。

本发明的多肽化合物用前述的载体以无菌溶液或悬液的形式可以通过公认的非肠道途径给药。按重量计算，这些制剂中最少应含有约0.1％的本发明化合物，但这一含量的变化范围可以在大约0.1％至50％之间。本发明多肽化合物最好是静脉内给药，给药剂量一般每70公斤体重在约1μg至500mg之间，最好是约10μg至50mg。这一剂量每天可给药1至4次。

通过下列实施例将进一步解释本发明，给出实施例是为了说明本发明多肽化合物的效应，而不是对本发明加以限制。

实施例一

兔十二指肠平滑肌条收缩实验

按照[depoortereetal.,regulpept.1995,55(3):227-35]的方法，取出兔十二指肠，用冷的无菌krebs液冲洗，将十二指肠剪开，截取0.2cm×2.5cm环形肌肌条，并将肌条悬挂于含krebs液(nacl:120.9mmol/l，nah2po42.0mmol/l，nahco315.5mmol/l，kcl5.9mmol/l，cacl21.25mmol/l，mgcl21.2mmol/l，glucose11.5mmol/l)的恒温(37℃)浴槽中1小时，持续充以95％o2和5％co2的混合气体。参照[depoortereetal.,jpharmacolexpther.2003,305(2):660-7]实验方法，采用电刺激肌间神经，即用刺激器通过两个平行的镀铂电极，在平滑肌条两侧施加电场刺激(1～16hz脉冲串刺激：波宽1ms，串持续时间10s，串间隔90s，电压：8v)，用连接于记录仪(成都仪器厂，成都，中国)的张力传感器检测肌条收缩反应。加入10^-7m促胃动力多肽后，用1～16hz逐渐增强的电场刺激肌间神经，观察平滑肌收缩反应。电场刺激引起的反应用强度单位表示(g/mm²)，用以下公式将肌条横断面积进行标准化处理：横断面积(mm²)＝组织湿重(mg)/[组织长度(mm)×密度(mg/mm³)]。平滑肌密度通常为1.05mg/mm³。

研究结果显示如表1。当加入本发明的10^-7m促胃肠动力肽后，电刺激肌间神经，平滑肌条收缩明显增强(p<0.05)，且效应明显高于胃动素；且随着电刺激频率加大，促胃肠动力肽增加平滑肌收缩效应明显加强(p<0.05～0.01)。

表1促胃肠动力肽对电刺激肌间神经诱导的兔十二指肠平滑肌收缩的影响(g/mm²)

^*p<0.05,^**p<0.01,与ns对照组比较，^#p<0.05，与胃动素比较。

实施例二

大鼠在体胃运动实验

大鼠禁食24小时，10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，肛温维持在37±l℃。腹部皮肤消毒，自剑突下行正中切口，切口长1-1.5cm，暴露胃，在距幽门0.5cm处，将应力传感器沿胃环行肌方向缝贴于胃窦浆膜面，绝缘导线经皮下引至颈后部皮肤切口，穿出体外。术后腹腔注射青霉素8万单位。术后3天待动物恢复正常饮食，无任何疼痛和应激反应现象，即可进行实验。

实验前动物禁食24小时，自由饮水。实验时，将大鼠置于特制鼠笼内适应记录环境1小时。实验使用日本无线胃肠运动信号发射仪(imt-100单通道胃运动记录仪)，可保证动物处于自由活动清醒状态下记录，胃运动信号经传感器将胃运动应力变化转为电信号，并以无线信号发射方式传至计算机，通过计算机即时收集胃肠运动数据，由特定软件(analize11图象处理分析系统)进行数据处理。给药前稳定记录大鼠胃运动30-60min，尾静脉注射本发明的促胃肠动力肽，观察和记录胃运动的幅度及频率变化。计算胃运动的幅度及频率变化率。

胃运动的幅度及频率变化率的计算公式：

研究结果显示如图1和图2。与注射等体积生理盐水对照组比较，大鼠尾静脉分别注射10μmol/0.2ml，25μmol/0.2ml或50μmol/0.2ml促胃肠动力肽，5min后胃收缩幅度显著增高(p<0.05～0.01)，胃收缩频率也显著加快(p<0.05～0.01)，且呈显著剂量依赖关系。与50μmol/0.2ml胃动素组相比，静脉注射25μmol/0.2ml或50μmol/0.1ml促胃肠动力肽，在注射后10-20min，胃收缩的幅度显著增大(p<0.05～0.01)，收缩频率显著增快(p<0.05)。(图1和图2中：﹡p＜0.05，﹡﹡p＜0.01，与生理盐水组比较；^▲p＜0.05，^▲▲p＜0.01，与50μmol胃动素组比较；^★p＜0.05，^★★p＜0.01，与10μmol促胃肠动力肽组比较；^#p＜0.05，与25μmol促胃肠动力肽组比较)。

实施例三

糖尿病胃动力障碍大鼠在体胃运动实验

1.糖尿病胃轻瘫大鼠模型制备

健康9周龄雄性wistar大鼠126只，体重230-300g。单笼饲养，饲喂大鼠标准颗粒饲料，自由饮水进食，动物房温度维持在22±3℃左右，相对湿度控制在60±5％，动物饲养是昼夜循环为12h:12h。适应性饲养1周后方可进行实验。

参照gangula等方法[gangulaetal.,tetrahydrobiopterin(bh4),acofactorfornnos,restoresgastricemptyingandnnosexpressioninfemalediabeticrats.amjphysiolgastrointestliverphysiol.2010,298(5):g692-9.]制作糖尿病胃轻瘫模型。造模前先更换笼具，禁食(不禁水)12h；造模组动物腹腔注射新鲜配制1％stz液，注射剂量为55mg/kg(sigmachemical,st.louis,mo)，以注射相应剂量的0.1mol/l柠檬酸缓冲液(1ml/只)为对照组。48小时后各组大鼠尾尖采血测空腹血糖(fastingbloodglucose，fbg),筛选出fbg>250mg/dl的大鼠即为糖尿病大鼠。6周后伴有腹部胀大、体重减轻等症状的大鼠,即为糖尿病胃轻瘫大鼠。

2.应力传感器植入术

大鼠禁食24小时，10％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，肛温维持在37±l℃。腹部皮肤消毒，自剑突下行正中切口，切口长1-1.5cm，暴露胃，在距幽门0.5cm处，将应力传感器沿胃环行肌方向缝贴于胃窦浆膜面，绝缘导线经皮下引至颈后部皮肤切口，穿出体外。术后腹腔注射青霉素8万单位。术后3天待动物恢复正常饮食，无任何疼痛和应激反应现象，即可进行实验。

3.清醒大鼠胃运动记录

实验前动物禁食24小时，自由饮水。实验时，将大鼠置于特制鼠笼内适应记录环境1小时。实验使用日本无线胃肠运动信号发射仪(imt-100单通道胃运动记录仪)，可保证动物处于自由活动清醒状态下记录，胃运动信号经传感器将胃运动应力变化转为电信号，并以无线信号发射方式传至计算机，通过计算机即时收集胃肠运动数据，由特定软件(analize11图象处理分析系统)进行数据处理。给药前稳定记录大鼠胃运动30-60min，尾静脉注射本发明的促胃肠动力肽，观察和记录胃运动的幅度及频率变化。

研究结果显示如图3、图4和图5。与正常大鼠比较(n＝7，图3a)，糖尿病胃轻瘫(dm)大鼠胃运动明显减弱(图3d)，表现为胃收缩幅度(7.21±1.47g/minvs2.03±0.64g/min，p<0.05，图3)和胃收缩频率(4.99±0.87hzvs1.49±0.21hz，p<0.05，图3b)显著降低。

在糖尿病胃轻瘫大鼠，与生理盐水对照组比较，静脉注射50μmol/0.2ml胃动素或50μmol/0.2ml促胃肠动力肽，均可使大鼠胃运动幅度和频率显著增加(p<0.05，图3e和f，图4和图5)，但促胃肠动力肽促胃动力作用明显高于胃动素(p<0.05，图4和图5)。胃动素受体拮抗剂gm109则对正常大鼠或糖尿病胃轻瘫大鼠胃运动无显著改变(p>0.05，图4和图5)。(图4和图5中：﹡p＜0.05，﹡﹡p＜0.01，与ns组比较；^#p＜0.05，与50μmol胃动素组比较)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。