采用特异性引物鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法与流程

本发明涉及分子生物学和医药检测技术领域，具体地说，涉及采用特异性引物快速鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法。

背景技术：

动物药的应用由来已久，在早期的著作《黄帝内经》、《伤寒论》、《神农本草经》、《本草纲目》等书中就记载了动物药的应用及分类，动物药在中药材市场上占据着重要地位，在临床应用上有其无法替代的作用和功效。乌梢蛇为游蛇科动物乌梢蛇zaocysdhumnades(cantor)的干燥体，蜈蚣为娱蚣科动物少棘巨娱松scolopendrasubspinipesmutilansl.koch的干燥体，全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎buthusmartensiikarsch的干燥体，三种动物药在中医临床上被广泛应用。

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)技术作为新兴的鉴别技术，自从1983年由mullils发明以来，得到了广泛的应用。该技术是利用高温变性、低温复性及室温延伸等几步反应，经过几十个周期循环，使特异dna序列扩增百万倍以达到鉴定的目的。特异性引物pcr扩增与普通pcr扩增相似，但在引物设计时要充分考虑到引物的特异性，用特异性强的引物扩增未知模板，通过检测目标片段的有无，达到将目标品种与其他品种有效鉴别的目的。

目前该技术已应用于多种中药材的鉴别，应用于动物药的研究已见文献报道，在《中国药典》2015版中，已将该技术应用于乌梢蛇的鉴别，但用药典方法不能将乌梢蛇从全蝎和蜈蚣中区分出来。目前尚未发现利用引物对组合的方式对乌梢蛇、全蝎和蜈蚣进行pcr鉴定的报道。基于此，本发明首次利用引物对组合的方式将三者进行区分。

本发明通过对线粒体基因coi片段进行分析，应用种特异引物pcr扩增技术和琼脂糖凝胶电泳技术，筛选出三对引物，可对乌梢蛇、全蝎、蜈蚣进行有效鉴别，填补了该技术领域的空白。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一套用于鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的pcr引物组合。

本发明的另一目的是提供一种采用特异性引物快速鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法。

本发明的又一目的是提供上述方法在鉴别中药材乌梢蛇、全蝎和蜈蚣，及其中药饮片、中成药、保健品、中药配方颗粒中的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的pcr引物组合，所述引物组合包括：

用于鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的通用引物wssf和wssr，引物序列分别如seqidno:3和4所示；

用于鉴别蜈蚣的特异性引物wgf和wgr，引物序列分别如seqidno:5和6所示；

用于鉴别全蝎的特异性引物qxf和qxr，引物序列分别如seqidno:7和8所示。

本发明还提供含有所述引物组合的用于鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的检测试剂盒。

本发明的试剂盒还包括用于dna提取质量检查的引物tyf和tyr，所述引物tyf和tyr为鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的通用引物，引物序列分别如seqidno:1和2所示。

本发明的试剂盒还包括dntps、taqdna聚合酶、mg²⁺、pcr反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

本发明还提供一种采用特异性引物快速鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法，其是利用所述引物组合或者所述试剂盒对乌梢蛇、全蝎和蜈蚣进行检测。

本发明进一步提供上述方法在鉴别中药材乌梢蛇、全蝎和蜈蚣，及其中药饮片、中成药、保健品、中药配方颗粒中的应用。所述中药配方颗粒是经水提取后，经分离、浓缩、干燥等步骤制成的全成分配方颗粒。

所述应用包括以下步骤：

1)提取待测样品中的dna，并检查dna质量；

2)以步骤1)中提取的dna为模板，分别利用引物wssf和wssr、wgf和wgr、qxf和qxr进行pcr扩增反应；

3)分析pcr扩增产物。

前述的应用，步骤2)中各pcr反应体系为：2×taqpcrmixture12.5μl，dna模板1μl，ddh2o9.5μl，10μm上、下游引物各1μl。

引物wssf和wssr对应的pcr反应程序为：95℃5min；95℃30s，63℃45s，72℃30s，35个循环；72℃5min；4℃保存。

引物wgf和wgr对应的pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃7min；4℃保存。

引物qxf和qxr对应的pcr反应程序为：95℃4min；95℃40s，65℃1min，72℃30s，30个循环；72℃5min；4℃保存。

前述的应用，步骤1)提取待测样品中dna的具体操作如下：

本发明采用商品化试剂盒进行dna提取。血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(离心柱型)，购自天根生化科技(北京)有限公司，商品编号：czt.#dp304-03，lot#03706。

取每个样品适量，置于高压灭菌后的2.0ml离心管中，加入两粒小号研磨珠和一粒大号研磨珠，将管子盖严，放入液氮中冷冻60s，在60hz，90s条件下，研磨两次；取出上述离心管，称取30mg，置于2.0ml离心管中，加入600μlga缓冲液，100mg/mlrnasea12μl，20mg/ml蛋白酶k60μl，置于56℃水浴振荡器中，裂解1.5h；水浴后每份加入600μl缓冲液gb，上下颠倒混匀，70℃放置10min；再加入600μl无水乙醇，涡旋振荡器上震荡15s，将液体加至吸附柱cb3中，(本步中的液体需要分次加入，每次600μl)室温放置2min，12000rpm离心1min，弃掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；向吸附柱cb3中加入500μlgd缓冲液，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；再将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心5min，倒掉废液；将吸附柱cb3置于65℃的金属浴中10min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱cb3转入另一个1.5mlep管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液te，室温放置5min，12000rpm离心1min，将溶液收集到1.5mlep管中(实验时采用两次洗脱法，以保证样品的洗脱效率)；提取后的dna存放于-20℃冰箱中。

前述的应用，步骤1)中检查dna质量的具体方法为：以提取的dna为模板，利用引物tyf和tyr进行pcr扩增反应，并分析pcr扩增产物。

pcr反应体系为：2×taqpcrmixture12.5μl，dna模板1μl，ddh2o9.5μl，10μm上、下游引物各1μl。

pcr反应程序为：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，40个循环；72℃10min；4℃保存。

本发明中，分析pcr扩增产物的方法如下：取pcr扩增产物5μl在含genegreen核酸染料的2.0％琼脂糖凝胶电泳仪上电泳1h，并在凝胶成像仪中观察电泳结果。

在本发明的一个具体实施方式中，应用种特异引物pcr技术和琼脂糖凝胶电泳技术，筛选出第一对引物tyf和tyr，可在乌梢蛇、全蝎和蜈蚣中扩增出目的条带，证明dna提取成功，结果如图1所示；第二对引物wssf和wssr，可将乌梢蛇、全蝎和蜈蚣鉴别出来，结果如图2所示；第三对引物wgf和wgr可将蜈蚣从乌梢蛇和全蝎中鉴别出来，结果如图3所示；第四对引物qxf和qxr可将全蝎与乌梢蛇区分开，结果如图4所示，反应均在pcr扩增仪(appliedbiosystem)上进行，反应体系：总体系25μl，包括12.5μl2×taqpcrmixture，1μldna模板，9.5μlddh2o，10μm上、下游引物各1μl，引物序列及反应条件如表1所示，分别取pcr反应液在已添加genegreen核酸染料的2.0％琼脂糖凝胶上点样，在mbe-150电泳仪上电泳1h(120v)，凝胶成像仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度；该方法能够快速、准确、特异性的将乌梢蛇、全蝎和蜈蚣进行有效鉴别。

表1引物及pcr反应程序

本发明具有以下优点：

(一)本发明通过对线粒体coi基因的分析，开发出三对种特异性pcr引物并结合琼脂糖凝胶技术，实现乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的有效鉴别。本发明筛选的鉴定引物对乌梢蛇、全蝎和蜈蚣具有特异性，从而建立了常规pcr鉴定方法，大大缩短了鉴定周期，提高了检测特异性。

(二)现有技术中，未见采用pcr技术通过开发引物组合对乌梢蛇、全蝎和蜈蚣进行pcr鉴定的相关报道。本发明首次设计出能对乌梢蛇、全蝎和蜈蚣进行特异性扩增的引物组合，且扩增结果准确可靠。

(三)本发明中首次采用特异性引物组合鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣，为三者的鉴定提供了快速、准确、有效的检测方法。

附图说明

图1为本发明实施例2中利用引物tyf和tyr进行pcr扩增反应的凝胶电泳结果；其中，m:marker1；1:乌梢蛇；2:蜈蚣；3:全蝎。

图2为本发明实施例3中利用引物wssf和wssr进行pcr扩增反应的凝胶电泳结果；其中，m:marker1；1:乌梢蛇对照药材；2:乌梢蛇；3:蜈蚣；4:全蝎。

图3为本发明实施例3中利用引物wgf和wgr进行pcr扩增反应的凝胶电泳结果；其中，m:marker1；1:乌梢蛇；2:全蝎；3:蜈蚣。

图4为本发明实施例3中利用引物qxf和qxr进行pcr扩增反应的凝胶电泳结果；其中，m:marker1；1:乌梢蛇；2:蜈蚣；3:全蝎。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例的设计构思：对于配方颗粒而言，原药材的外观性状完全破坏，乌梢蛇、全蝎、蜈蚣三种动物药配方颗粒的外观性状又十分相似，一旦发生混淆，采用传统的薄层技术无法对三种动物药配方颗粒进行有效区分，发明人通过对线粒体基因coi片段进行分析，应用种特异引物pcr扩增技术和琼脂糖凝胶电泳技术，筛选出三对引物可对三种动物药配方颗粒进行鉴别，从而建立一套快速、准确、有效的pcr鉴定三种动物药配方颗粒的方法。

以下实施例中使用的乌梢蛇配方颗粒、蜈蚣配方颗粒和全蝎配方颗粒均购自北京康仁堂药业有限公司。

酶及其他试剂：琼脂糖(biowest)购自秀百锐生物器材有限公司，gene核酸染料、2*taqpcrmixture、marker、rnasea、血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒，均购自天根生化科技有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司。

主要仪器设备：2720型pcr扩增仪(appliedbiosystem公司)，thz-82型双数显旋转水浴振荡器(金坛市城东新瑞仪器厂)，p70d20l-de(w0)型微波炉(格兰仕微波生活电器有限公司)，js-6800型凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)，ldzf-30kb-ⅲ型立式蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)，mbe-150型电泳仪(美国ms公司)，micro21r台式高速低温离心机(美国thermo公司)等。

本发明中使用的所有原辅料材料、试剂和仪器、设备均为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备均可适用于本发明。

实施例1三种动物药配方颗粒基因组dna的提取

采用血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒来提取三种动物药配方颗粒基因组dna。

取北京康仁堂药业有限公司生产的动物药配方颗粒3种，分别为乌梢蛇配方颗粒、蜈蚣配方颗粒和全蝎配方颗粒。每个样品取约1.0g，置于高压灭菌后的2.0ml离心管中，加入两粒小号研磨珠和一粒大号研磨珠，将管子盖严，放入液氮中冷冻60s，在60hz，90s条件下，研磨两次。取出上述离心管，称取30mg，置于2.0ml离心管中，加入600μlga缓冲液，100mg/mlrnasea12μl，20mg/ml蛋白酶k60μl，置于56℃水浴振荡器中，裂解1.5h。水浴后每份加入600μl缓冲液gb，上下颠倒混匀，70℃放置10min。再加入600μl无水乙醇，涡旋振荡器上震荡15s，将液体加入到吸附柱cb3中，(本步中的液体需要分次加入，每次600μl)室温放置2min，12000rpm离心1min，弃掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。向吸附柱cb3中加入500μlgd缓冲液，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。再将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心5min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于65℃的金属浴中10min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱cb3转入一个干净的1.5mlep管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液te，室温放置5min，12000rpm离心1min，将溶液收集到1.5mlep管中(实验时采用两次洗脱法，以保证样品的洗脱效率)。提取后的dna存放于-20℃冰箱中。

以上操作中，应确认是否将指定体积的无水乙醇加入到gd和pw中，加入时应沿着试剂管的管壁四周，这样可以完全将粘附在管壁上的盐分冲洗干净。

上述缓冲液te可用灭菌后的蒸馏水代替，在洗脱时加热至65℃，这样可以提高洗脱效率。

实施例2dna质量检查

乌梢蛇配方颗粒、蜈蚣配方颗粒和全蝎配方颗粒dna提取质量用引物对tyf/tyr(seqidno:1和2)来检查。该对引物是专门用于动物药模板dna质量的通用引物。

pcr反应体系为：2×taqpcrmixture12.5μl，dna模板1μl，ddh2o9.5μl，10μm上、下游引物各1μl。

pcr反应程序为：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，40个循环；72℃10min；4℃保存。

进行pcr反应后，分别取pcr产物5μl在含genegreen核酸染料的2.0％琼脂糖凝胶电泳仪上电泳1h(90v)，凝胶成像仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度。结果显示在100bp～200bp之间出现目的条带，亮度的差异表示模板dna浓度的差异(图1)。

实施例3采用特异性引物快速鉴定三种动物药配方颗粒的方法

应用种特异性引物pcr和琼脂糖凝胶电泳技术，筛选出三对引物组合鉴定动物药配方颗粒的特异性引物。引物扩增反应在pcr仪上进行，pcr反应体系：12.5μl2×taqpcrmixture，1μldna模板，9.5μlddh2o，10μm上、下游引物各1μl，总体积25μl，反应条件如下：

引物wssf和wssr对应的pcr反应程序为：95℃5min；95℃30s，63℃45s，72℃30s，35个循环；72℃5min；4℃保存。

引物wgf和wgr对应的pcr反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃7min；4℃保存。

引物qxf和qxr对应的pcr反应程序为：95℃4min；95℃40s，65℃1min，72℃30s，30个循环；72℃5min；4℃保存。

进行pcr反应后，分别取pcr扩增产物5μl在含genegreen核酸染料的2.0％琼脂糖凝胶电泳仪上电泳1h，凝胶成像仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度；引物wssf和wssr，可将乌梢蛇配方颗粒、全蝎配方颗粒和蜈蚣配方颗粒鉴别出来，结果如图2所示；引物wgf和wgr可将蜈蚣配方颗粒从乌梢蛇配方颗粒和全蝎配方颗粒中鉴别出来，结果如图3所示；引物qxf和qxr可将全蝎配方颗粒与乌梢蛇配方颗粒区分开，结果如图4所示。结果表明，获得的三对组合引物wssf和wssr(seqidno:3和4)、wgf和wgr(seqidno:5和6)、qxf和qxr(seqidno:7和8)，方法能够快速、准确、特异性的对乌梢蛇、蜈蚣和全蝎三种动物药配方颗粒进行有效鉴别。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京康仁堂药业有限公司

<120>采用特异性引物鉴别乌梢蛇、全蝎和蜈蚣的方法

<130>khp171111221.7tq

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<400>8

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